CN112745373B - 基于4-硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化学领域，具体地，本发明涉及基于4‑硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检测方法。本发明提供了一种核酸中5‑R₁‑4‑硫代‑2’‑脱氧尿苷(5‑R₁‑4SdU)的转化产物5‑R₁‑N4‑R₂‑2’‑脱氧胞苷(5‑R₁‑N4‑R₂‑dC)及制备该产物的氧化胺解反应，以及基于该反应的5‑R₁‑4SdU代谢标记核酸的测定方法，核酸中的5‑R₁‑4SdU与其转化产物5‑R₁‑N4‑R₂‑dC存在氢键模式的差异，该差异可通过测序手段进行表征，表现为反应前后核酸中的5‑R₁‑4SdU位点发生T‑C突变，基于测得的T‑C突变发生的位置与频率，从而获取关于核酸合成或修复的动态信息。

Description

基于4-硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检 测方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体地，本发明涉及基于4-硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检测方法，以及基于这些方法开发的试剂盒。

背景技术

常见的DNA研究方法主要包括凝胶印迹、PCR、微阵列分析、测序等，但这些方法只能提供DNA的总水平信息，无法从中得知DNA的合成、损伤、修复等过程的动力学信息。

DNA代谢标记，是将区别于脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧胞苷（dC）、胸苷（T）等常规核苷的外源核苷与细菌、细胞、组织或活体进行培养，使外源核苷代谢结合到新生成的DNA中的技术。外源核苷通常可通过共价反应、抗体识别等方式进行识别或原位成像，从而对标记DNA进行富集或检测。该技术为DNA的合成、损伤、降解等过程增加了时间标尺，便于生命科学工作者对DNA的行为进行深入的研究和理解。

已报道的DNA代谢标记核苷主要包括5-溴脱氧尿苷（BrdU）、5-乙炔基脱氧尿苷（EdU）、5-乙烯基脱氧尿苷（VdU）等。

BrdU可通过特异性抗体对标记了BrdU的DNA进行富集与检测，因此已被广泛应用于DNA复制(Pope B D, Ryba T, Dileep V, et al. Topologically associatingdomains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 2014, 515:402-405; Brison O, El-Hilali S, Azar D, et al. Transcription-mediatedorganization of the replication initiation program across large genes setscommon fragile sites genome-wide. Nature communications. 2019, 10: 5693.)、姐妹染色单体互换(Schneider E L, Chaillet J R and Tice R R. INVIVO BUDR LABELINGOF MAMMALIAN CHROMOSOMES. Exp. Cell Res. 1976, 100: 396-399.)的研究。然而DNA双链中互补的碱基对阻碍了抗体对BrdU的接近性，因此通常需要使用强变性条件对样品进行处理，但这样不仅会破坏样本的结构和完整性，还会因变性条件的不同造成检测的较大误差。

EdU可与叠氮修饰的荧光团或生物素发生点击反应，由于反应具有高效率和良好的生物正交性，被广泛应用于DNA复制研究(Salic A and Mitchison T J. A chemicalmethod for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008,105: 2415-242; Neef A B and Luedtke N W. Dynamic metabolic labeling of DNA invivo with arabinosyl nucleosides. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America. 2011, 108: 20404-20409.)和DNA修复活性测定(Limsirichaikul S, Niimi A, Fawcett H, et al. A rapid non-radioactivetechnique for measurement of repair synthesis in primary human fibroblasts byincorporation of ethynyl deoxyuridine (EdU). Nucleic acids research. 2009,37: e31; Wienholz F, Vermeulen W and Marteijn J A. Amplification ofunscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cellquantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleicacids research. 2017, 45: e68.)中。然而EdU存在细胞毒性较大，干扰DNA功能和稳定性的问题，因此无法用于长时间的DNA标记实验。

VdU(Rieder U and Luedtke N W. Alkene-tetrazine ligation for imagingcellular DNA. Angewandte Chemie. 2014, 53: 9168-9172.)也可用于DNA代谢标记的研究，其中富电子的乙烯基可与缺电子四嗪发生反电子需求DA反应。但VdU并没有被广泛应用，可能是由于反应前需要用2MHCl对DNA作30分钟的变性处理，会导致DNA结构的破坏。

以上三类DNA代谢标记核苷可以通过原位荧光标记成像对DNA复制、修复等过程进行研究，从中获得时间和空间的信息，但该方法无法捕获不同序列间的DNA动力学差异。对基因不同区域的DNA动力学研究可通过DNA代谢标记结合二代测序实现，即被标记的DNA利用特异性方法进行富集，通过二代测序的读取覆盖度反馈出基因各区域复制的总水平。目前已发展出基于BrdU(Hansen R S, Thomas S, Sandstrom R, et al. Sequencing newlyreplicated DNA reveals widespread plasticity in human replication timing.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. 2010, 107: 139-144; Marchal C, Sasaki T, Vera D, et al. Genome-wideanalysis of replication timing by next-generation sequencing with E/L Repli-seq. Nature protocols. 2018, 13: 819-839.)和EdU(Ramachandran S and HenikoffS. Transcriptional Regulators Compete with Nucleosomes Post-replication.Cell. 2016, 165: 580-592; Ramachandran S and Henikoff S. MINCE-Seq: MappingIn Vivo Nascent Chromatin with EdU and Sequencing. Methods Mol Biol. 2018,1832: 159-168.)的Repli-Seq法，用于研究细胞过程与复制时间的关系。然而该方法在基因组层面分辨率较低，且富集过程的非特异性吸附也会导致假阳性结果。

因此，开发一种细胞毒性小、高分辨率的DNA代谢标记测定方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明旨在解决上述问题。为此，本发明的目的在于提供一种核酸代谢标记物以及基于该标记物的核酸代谢测定方法，所述方法免富集，具有较高的分辨率，且代谢标记物细胞毒性小。

为此，本发明一方面提供一种核酸转化产物。根据本发明的实施例，所述核酸转化产物包含含有5-R₁-N4-R₂-2’-脱氧胞苷（5-R₁-N4-R₂-dC）的核酸，所述含有5-R₁-N4-R₂-2’-脱氧胞苷的核酸的结构式为：

；

其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基；

R₂选自氢、C₁-C₈的烷基、C₅-C₂₀的芳香基、胺基、羟基。

目前已发展出的基于BrdU和EdU的Repli-Seq法，存在基因组层面分辨率较低的问题，并且富集过程的非特异性吸附也会导致假阳性结果。发明人发现一种特殊的核酸代谢标记物，并基于该标记物的氧化胺解反应与测序技术获得一种核酸代谢标记测定方法。核酸中5-R₁-4SdU转化为5-R₁-N4-R₂-dC的氧化胺解反应，5-R₁-4SdU杂环的4位巯基在氧化条件下转化为磺酸衍生物中间体，这些中间体可被胺类化合物亲核取代，从而转化为5-R₁-N4-R₂-dC。5-R₁-4SdU及其转化产物5-R₁-N4-R₂-dC存在氢键模式的差异，该差异可通过测序手段进行表征，表现为氧化胺解反应前后的5-R₁-4SdU位点发生T-C突变，基于测得的T-C突变发生的位置与频率，从而获取关于核酸合成或修复的动态信息。

根据本发明的实施例，所述核酸转化产物通过含有5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷（5-R₁-4SdU）的核酸转化而来，所述含有5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷的核酸的结构式为：

；

其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基。

本发明第二方面提供制备第一方面所述的核酸转化产物的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

（1）以包含含有5-R₁-4SdU的核酸为反应底物，在氧化剂作用下进行氧化反应，以便获得氧化中间产物，所述氧化中间产物结构式为：

；

（2）以所述氧化中间产物为反应底物，在胺类化合物R₂-NH₂作用下发生胺解反应，以便获得所述核酸转化产物；

其中，所述胺类化合物R₂-NH₂选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺。

含有5-R₁-4SdU的核酸中5-R₁-4SdU具有芳环巯基共振结构，在氧化剂的氧化下，可转化为次磺酸、亚磺酸、磺酸中间体，磺酸吸电子的性质可使芳环4位碳亲电性增强，从而磺酸可被反应体系中胺类化合物的氨基亲核取代，最终转化为5-R₁-N4-R₂-dC，即含有5-R₁-4SdU的核酸经过氧化反应和胺解反应后，获得含有5-R₁-N4-R₂-dC的核酸。

根据本发明的实施例，所述氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃。

根据本发明的实施例，所述氧化剂的浓度为10 μM-200 mM。

根据本发明的实施例，所述胺类化合物R₂-NH₂的浓度为1mM-5 M。

根据本发明的实施例，所述含有5-R₁-4SdU的核酸通过体外合成方式获取或源自经5-R₁-4SdU代谢标记的生物对象的核酸。

根据本发明的实施例，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为体外合成的核酸，其浓度为0.025μM-125μM，反应体系总体积可根据核酸样品量或随需要进行调整与改变。

根据本发明的实施例，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为经5-R1-4SdU代谢标记的生物对象的核酸，其浓度为0.025 ng/μL-12.5 μg/μL，反应体系总体积可根据核酸样品量或随需要进行调整与改变。

根据本发明的实施例，进行所述氧化反应或胺解反应的反应体系pH为5.0-13.0。

反应体系pH可视胺类化合物中氨基的pKb进行调整，可以为5.0-13.0。一般来讲，该反应可在较宽的pH范围（pK _b±4.0）内以较高的转化效率完成反应。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括进行所述氧化反应或胺解反应时，向反应体系中加入抑制核酸酶的试剂。

可以向反应体系中进一步加入抑制核酸酶的试剂，以防止可能存在的DNA酶对核酸样本的降解。

根据本发明的实施例，所述抑制核酸酶的试剂选自乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、亚氨基二琥珀酸四钠、1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸。

根据本发明的实施例，所述抑制核酸酶的试剂的浓度为1μM-100 mM。

根据本发明的实施例，进行所述氧化反应或胺解反应的温度为0-100℃。

抑制核酸酶的试剂（如EDTA）的作用是抑制DNA酶的活性，防止DNA被降解，但当反应温度较高，如80℃条件下DNA酶已失活，因此也可不添加EDTA。

所述氧化反应或胺解反应在0-100℃均可进行，若反应温度较低时，反应效率降低，但可以通过延长反应时间来提高反应效率，实现有效的化学转化。

本发明第三方面提供一种5-R₁-4SdU代谢标记核酸的测定方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

1）利用5-R₁-4SdU对生物样品中的核酸进行标记，获得标记后的生物样品，其中，所述标记后的生物样品中包含含有5-R₁-4SdU的核酸；

2）提取所述标记后的生物样品中的核酸，以便获得第一核酸提取物；

3）将所述第一核酸提取物中的第一部分进行如权利要求3-9中任一项所述的方法中的氧化反应和胺解反应，以便获得反应后的核酸，其中，进行所述胺解反应后，所述含有5-R₁-4SdU的核酸中的5-R₁-4SdU转化为5-R₁-N4-R₂-dC；

4）将所述第一核酸提取物中的第二部分与3）中所述反应后的核酸分别进行扩增或文库构建，并进行测序，比较所述第一核酸提取物中的第二部分与所述反应后的核酸的测序结果，其中，核酸中出现T-C突变聚集的区域为该区域出现复制和/或修复的指示；

其中，含有5-R₁-4SdU的核酸结构为：

；

含有5-R₁-N4-R₂-dC的核酸结构为：

；

R₁选自氢、C₁-C₄的烷基；

R₂选自氢、C₁-C₈的烷基、C₅-C₂₀的芳香基、胺基、羟基。

芳香基进一步优选为C₆-C₁₂的芳香基。

本发明将5-R₁-4SdU的氧化胺解反应与测序技术结合，获得一种使用低毒性脱氧核苷5-R₁-4SdU进行可扩增、可测序的核酸代谢测定方法。使用5-R₁-4SdU标记培养生物对象，通过上述氧化胺解反应对提取的生物对象的DNA进行转化，使其中的5-R₁-4SdU被转化为5-R₁-N4-R₂-dC。对反应前后的DNA样品进行测序，当某段核酸出现较高比例的T-C突变，说明此区域结合了更多的5-R₁-4SdU，从而表明该区域存在更高频的复制或修复。

根据本发明的实施例，所述生物样品选自细胞、组织、细菌、真菌、病毒。

根据本发明的实施例，所述生物样品为细胞，利用5-R₁-4SdU对所述细胞中的核酸进行标记时，培养所述细胞的培养基中加入的5-R₁-4SdU浓度为1μM-100mM。

所述培养基的类型根据细胞种类进行选择，培养基中细胞密度根据本领域在所用培养基中培养该类细胞的常规密度进行选择。

根据本发明的实施例，所述核酸为DNA，进行扩增时所用的DNA聚合酶选自Taq、Q5、Phusion。

需要说明的是，进行扩增时所用的DNA聚合酶也可以是其他常用的DNA聚合酶，并不局限于Taq、Q5、Phusion。

本发明第四方面提供一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷储备液，其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基。

采用本发明第四方面提供的试剂盒，可用于标记生物样品中的DNA，以测定生物样品中5-R₁-4SdU代谢标记核酸，从而获得核酸是否发生复制和/或修复，以及发生复制和/或修复的区域。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：

氧化剂；

能够产生胺类化合物的试剂；

其中，所述氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃；

所述胺类化合物选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺。

采用含有所述5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷储备液、氧化剂、能够产生胺类化合物的试剂的试剂盒，利用5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷标记生物样品中的DNA，以测定生物样品中5-R₁-4SdU代谢标记核酸。利用本发明提供的试剂盒，基于5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷的氧化胺解反应与测序技术，5-R₁-4SdU及其氧化胺解反应后的转化产物5-R₁-N4-R₂-dC存在氢键模式的差异，该差异可通过测序手段进行表征，表现为氧化胺解反应前后的5-R₁-4SdU位点发生T-C突变，根据测得的T-C突变发生的位置与频率，从而获取关于核酸合成或修复的动态信息。采用本发明提供的试剂盒，试剂盒中的代谢标记物细胞毒性小，具有较高的分辨率。

根据本发明的实施例，R₁为甲基，所述5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷储备液为4-硫代胸苷储备液。

根据本发明的实施例，所述能够产生胺类化合物的试剂为NH₄Ac-NaOH。

本发明第五方面提供第四方面所述的试剂盒在测定5-R₁-4SdU代谢标记核酸中的用途。根据本发明的实施例，所述用途包括利用所述试剂盒，采用第三方面所述的测定方法，以便测定所述生物样品的核酸中是否发生复制和/或修复，以及发生复制和/或修复的区域，其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了5-R₁-4SdU在核酸中的氧化胺解反应示意图及其反应前后氢键模式的转变；

图2显示了基于4-硫代胸苷（4ST）氧化胺解反应和二代测序的DNA代谢标记流程图；

图3显示了模式核酸的两次PCR制备一代测序样品示意图（其中黑色箭头所指的T为4ST位点）；

图4显示了模式核酸反应前后的一代测序结果；

图5显示了三种脱氧核苷在不同浓度下对细胞活力的影响；

图6显示了HPLC分析细胞DNA样品中4ST的比例；

图7显示了四组样品中12种突变的突变频率。

具体实施方式

根据本发明的一个具体的实施例，本发明提供一种核酸代谢测定方法，所述方法包括：

1）利用4-硫代胸苷（4ST），即5-R₁-4SdU（R₁=CH₃）对生物样品中的核酸进行标记，获得标记后的生物样品，当标记的生物样品为细胞时，其培养基中的4ST浓度为1μM-5 mM；

2）提取所述标记后的生物样品中的核酸，以便获得第一核酸提取物；

3）将所述第一核酸提取物中的第一部分进行氧化胺解反应，以便获得氧化胺解反应后的核酸，其中进行所述氧化胺解反应后，在标记了所述4ST的核酸中，所述4ST转化为5mdC，5mdC即5-R₁-N4-R₂-dC（R₁=CH₃，R₂=H）；

4）将所述第一核酸提取物中的第二部分与所述氧化胺解反应后的核酸分别进行扩增或文库构建，并进行测序，比较所述第一核酸提取物中的第二部分与所述氧化胺解反应后的核酸的测序结果，其中，核酸中出现T-C突变聚集的区域为该区域出现复制或修复的指示；

其中，标记了4ST的核酸结构为：

；

标记了5mdC的核酸结构为：

。

根据本发明的实施例，标记了5mdC的核酸通过以下方法获取：

（1）以包含含有4ST的核酸为反应底物，在氧化剂作用下进行氧化反应，以便获得氧化中间产物；

（2）以所述氧化中间产物为反应底物，在胺类化合物作用下发生胺解反应，以便获得标记了5mdC的核酸。

根据本发明的实施例，所述氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃；所述氧化剂的浓度为10 μM-200 mM。

根据本发明的实施例，所述胺类化合物R₂-NH₂选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺。

根据本发明的实施例，所述胺类化合物R₂-NH₂的浓度为1mM-5 M。

进行氧化胺解反应时，反应容器和控温方式也可随实验条件或反应体系的量进行改变。反应完成后的核酸纯化过程也可采用乙醇沉淀等方式，其目的在于洗涤除去小分子，以免影响后续PCR等实验。

根据本发明的具体实施例，本发明提供一种生物DNA标记试剂盒：5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷储备液、稀释用缓冲溶液，其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基。所述缓冲溶液的组分可以选自磷酸盐、醋酸盐、硼酸盐、铵盐、Tris-HCl、HEPES、MOPS、MES，pH为5.0-13.0。

根据本发明的具体实施例，本发明提供一种测定5-R₁-4SdU代谢标记核酸的试剂盒：5-R₁-4-硫代-2’-脱氧尿苷储备液、稀释用缓冲溶液；氧化剂；能够产生胺类化合物的试剂；

其中，氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃；

胺类化合物选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺。

本发明提供试剂盒中氧化剂、能够产生胺类化合物的试剂也可以组成一个生物DNA检测衍生试剂盒。

需要说明的是，本发明中的“氧化胺解反应”是指以包含含有5-R₁-4SdU的核酸为反应底物进行的氧化反应和胺解反应，反应终产物为含有5-R₁-N4-R₂-dC的核酸转化产物。

本发明中的“胺类化合物”是指实际参与胺解反应的化合物，在进行实验时，可以通过加入能够产生本发明中所述的胺类化合物的试剂以进行胺解反应，例如，试剂NH₄Ac-NaOH能够在反应中产生氨，氨作为胺类化合物参与胺解反应。

在本发明中，氧化反应进行较快，在实际操作时，通常先将产生胺类化合物的试剂加入反应体系中，随后加入氧化剂以启动氧化胺解反应，若先加入氧化剂，则底物迅速被氧化，产生较多的副产物，不利于胺解反应的进行，降低产率。

附图1显示了5-R₁-4SdU在核酸中的氧化胺解反应示意图及其反应前后氢键模式的转变。

根据本发明的具体实施例，所述核酸代谢测定方法包括以下步骤：

将4-硫代胸苷（4ST）与细胞进行培养，细胞DNA在复制或修复过程中，4ST可通过补救代谢途径转化为对应的三磷酸脱氧核苷，三磷酸脱氧核苷可结合到新生成的DNA中（如图2所示）。之后提取细胞DNA，将其分为两份，一份不作任何处理，另一份进行如图1所示的氧化胺解反应处理，其中的4ST能够转化为5mdC。将两份DNA提交PCR扩增和二代测序流程，由于4ST可被Taq、Phusion、Q5等常见的DNA聚合酶识别为T，而5mdC则被上述聚合酶识别为C，因此理论上4ST位点可在反应前后实现测序读取T-C的转变。当某段基因区域出现较高比例的T-C突变，说明此区域结合了更多的4ST，从而表明该区域存在更高频的复制或修复。

为验证反应的可行性，设计在模式核酸4ST-60nt上进行氧化胺解反应，并通过PCR扩增和一代测序，确认其中的4ST位点在反应前后能够发生T-C突变。模式核酸通过固相合成得到，是一条60nt的单链DNA，其中第31位碱基为4ST。在进行一代测序验证前，采用PCR结合限制性内切酶分析法，对模式核酸4ST-60nt上的氧化胺解反应条件进行了优化。最终确定优化的反应条件为1.25 μM 4ST-60nt、1 mM EDTA、400 μM NaIO₄、100 mM NH₄Ac-NaOH（pH9.0），80℃反应3 h，反应后的模式核酸使用超滤管进行洗涤纯化。

根据本发明的具体实施例，模式核酸4ST-60nt的核酸序列为：

CTGGCTATCTAACGCTTATAGACTGGTACANCAGATAACCCTCAAGGATCGATTGTGAAG，如SEQ IDNO:1所示，其中N为4-thiothymidine，即4-硫代胸苷。

根据本发明的具体实施例，如图3所示，考虑到一代测序开始的几十bp难以测准，为了得到更准确的一代测序结果，设计对模式核酸进行两次PCR，得到179bp的PCR产物作为一代测序样品。

对模式核酸进行两次PCR所用的引物为：

primer1F：5’-TTGGCGATGGCGGTAGCTAACTAAGTCGCCTGGCTATCTAACGCTTA

TAG-3’，如SEQ ID NO:2所示；

primer1R：5’-TCGTGCACATACAGCTGCACCGCACGCATGCTTCACAATCGATCCT

TGAG-3’，如SEQ ID NO:3所示；

primer2F：5’- TGTATGGTAACCTGCCAGTTTGGGACATCATTGGCGATGGCGGTAGC

TAA -3’，如SEQ ID NO:4所示；

primer2R：5’-TGCTGAACGAGCCTGAAGTAAAAGATTATCTCGTGCACATACAGCT

GCAC -3’，如SEQ ID NO:5所示。

由图4的一代测序结果可知，4ST位点在反应前能够被DNA聚合酶识别，并且在一代测序中被读作T，而4ST经过氧化胺解反应后大部分被转化为5mC，从而可在一代测序中被读作C。因此，模式核酸的一代测序实验证明了DNA中的4ST可被氧化胺解反应转化，并在反应前后实现测序读取T-C的突变。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例14ST对细胞进行DNA代谢标记

使用超纯水配制4ST储备液，并用无菌水相滤膜进行过滤，储备液置于-20℃保存，使用前置于37℃恒温培养箱预热。处于分裂期或损伤后的MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清的Dulbecco高糖培养基中，向培养基中加入4ST储备液，使4ST在培养基中的终浓度为1mM。将细胞置于37℃、5% CO₂的培养箱中继续培养一段时间，使细胞DNA在复制或修复过程中将4ST结合其中。分离细胞DNA用于后续体外实验，弃除培养基，获取细胞，使用DNA提取试剂盒进行细胞DNA的提取。

实施例2含4ST的模式核酸或细胞DNA的氧化胺解反应处理

向0.2 mL平盖PCR管中分别加入50 pmol模式核酸或500 ng实施例1中获得的细胞DNA，依次加入终浓度为1 mM的EDTA和100 mM的NH₄Ac-NaOH（pH 9.0），最后加入终浓度为400 μM的NaIO₄，反应体系总体积为40 μL。加完NaIO₄后立随即将PCR管置于PCR仪中，设置温度程序，80℃反应3h，反应结束温度降至4℃。反应后的核酸通过超滤管离心进行小分子脱除纯化。其中，模式核酸加入量为100pmol/40 μL，细胞DNA加入量为500 ng/40 μL。NH₄Ac-NaOH产生的氨的浓度为100 mM，反应体系pH为9.0。NaIO₄的浓度为400 μM。

实施例3模式核酸的两次PCR制备一代测序样品

以未经处理的4ST-60nt与经过氧化胺解反应的4ST-60nt分别作为模板，primer1F和primer1R为一对引物，Taq DNA聚合酶进行第一次PCR：向0.2 mL平盖PCR管中加入终浓度为10 nM的模板DNA，终浓度为0.5 μM的一对引物，25 μL的Taq HS mix，使PCR体系的体积为50 μL。将PCR管放置于PCR仪中，设置PCR程序为94℃ 3 min，[94℃ 10 s，52℃ 30 s，72℃1 min] 30个循环，72℃ 8 min，4℃∞。PCR产物取5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，剩余溶液用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit对PCR产物进行纯化，以除去聚合酶、dNTP、未反应的引物等，最终得到119bp双链DNA。

以纯化后的第一次PCR产物作为模板，primer2F和primer2R为一对引物，Taq DNA聚合酶进行第一次PCR：向0.2 mL平盖PCR管中加入终浓度为10 nM的模板DNA，终浓度为0.5μM的一对引物，25 μL的Taq HS mix，使PCR体系的体积为50 μL。将PCR管放置于PCR仪中，设置PCR程序为94℃ 3 min，[94℃ 10 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min] 30个循环，72℃ 8 min，4℃∞。取5 μL PCR原液用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，剩余溶液用E.Z.N.A. GelExtraction Kit对PCR产物进行纯化，最终得到179bp双链DNA。

将制得的179bp双链DNA测序样品送至生物公司，以primer-seq（5’-TGTATGGTAACCTGCCAGTTTGGGA-3’，如SEQ ID NO:6所示）为测序引物进行一代测序。由图4的一代测序结果可知，4ST位点在反应前能够被DNA聚合酶识别，并且在一代测序中被读作T，而4ST经过氧化胺解反应后大部分被转化为5mC，从而可在一代测序中被读作C。因此，模式核酸的一代测序实验证明了DNA中的4ST可被氧化胺解反应转化，并在反应前后实现测序读取T-C的突变。

实施例4 CCK-8细胞活力分析法比较4ST、BrdU、EdU的细胞毒性

为考察4ST对细胞活力的影响，采用CCK-8细胞活力分析法，将4ST与传统DNA代谢标记核苷BrdU和EdU进行细胞毒性的比较。

将MCF-7细胞以5000 cells/cm²的密度在96孔板中进行铺板，培养条件为含10%FBS的DMEM培养基，37℃，5% CO₂。铺板后培养过夜，向培养基中分别加入终浓度为1 μM、10μM、100 μM、333 μM、1 mM、3.33 mM的4ST、BrdU和EdU，同时设置空白对照组，对照组和各实验组分别平行设置四组。继续培养72 h后，每组取三个孔分别加入10 μL CCK-8，另一孔加入10 μL灭菌水，37℃孵育1.5 h后将孔板置于酶标仪中读取450 nm的吸光度值。以不添加核苷的空白对照组的平均吸光度值作为细胞活力100%的标准，对各实验组细胞活力进行计算并作图。

如图5所示，相比于BrdU和EdU，4ST具有明显的低细胞毒性优势。

实施例5 HPLC分析细胞DNA中4ST的结合比例

为证明4ST能够有效地对细胞DNA进行代谢标记，使用不同浓度的4ST对细胞进行标记培养，并通过HPLC对提取的细胞DNA中4ST结合比例进行分析。

将MCF-7细胞以13500 cells/cm²的密度在六孔板中进行铺板，培养条件为含10%胎牛血清的Dulbecco高糖培养基，37℃，5% CO₂。铺板后培养24 h，向培养基中分别加入终浓度为0μM、10 μM、100 μM、333 μM、1 mM、3.33 mM的4ST。继续培养72 h后，使用ThermoScientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit提取细胞DNA，根据样品的A260确定核酸浓度。取5 μg细胞DNA，加入15*10^-3U磷酸二酯酶和0.5 U碱性磷酸酶，在10 mMTris-HAcpH 8.8缓冲液中，37℃处理16 h，超滤管离心收取滤液，以除去酶。取约1 μg降解为脱氧核苷的DNA样品，以C18柱进行HPLC分离分析，260 nm检测波长监测dA、dG、dC、T，330 nm检测波长监测4ST。以20 μL含脱氧腺苷（dA）、脱氧鸟苷（dG）、脱氧胞苷（dC）、胸苷（T）、4-硫代胸苷（4ST）各40 μM的溶液作为色谱分析的标准样品。

如图6所示，细胞DNA中4ST的比例随4ST标记浓度的增加而增大，1 mM 4ST标记比例约为1.0% 4ST/T，即细胞DNA中有约1%的T被4ST替代。综合考虑标记效率和对细胞活力的影响，将1 mM作为优化的4ST标记浓度，用于进行后续实验。

实施例6 二代测序验证细胞DNA中4ST反应前后发生T-C突变

为证明细胞DNA中的4ST能够通过氧化胺解反应被有效地转化为5mC，并通过二代测序读取，显示出显著的T-C突变，将1 mM 4ST标记培养的细胞DNA和空白对照组细胞DNA分别分成两份，一份不作处理，另一份作氧化胺解反应处理（反应条件及后处理过程与模式核酸条件相同，即与实施例2条件相同）。

选择EXM1基因的一段684bp片段作为检验模型，以四组DNA样品作为模板，以EMX1-F（5’-AAAACCACCCTTCTCTCTGGC-3’，如SEQ ID NO:7所示）和EMX1-R（5’-GGAGATTGGAGACACGGAGAG-3’，如SEQ ID NO:8所示）为一对引物，以Q5 DNA聚合酶完成PCR扩增：向0.2 mL平盖PCR管中加入10 ng模板DNA，终浓度为0.5 μM的一对引物，25 μL的Q5 HFmix，使PCR体系的体积为50 μL。将PCR管放置于PCR仪中，设置PCR程序为98℃ 3 min，[98℃30 s，65℃ 20 s，72℃ 20 s] 35个循环，72℃ 5 min，4℃ ∞。PCR产物取5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，剩余溶液用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit将目标PCR产物纯化出来。之后使用TruePrep^TM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina进行二代测序文库的构建。将经过浓度测定和超敏胶质检的文库送至测序公司提交二代测序上机流程，对测序公司返回的数据进行处理与分析。

如图7所示，考察了四组样品（图7中每种碱基突变，从左至右四组分别为-4ST-反应；-4ST+反应；+4ST-反应；+4ST+反应，其中，-4ST-反应表示不添加4ST培养的MCF-7细胞，提取的基因组DNA不进行氧化胺解反应；-4ST+反应表示不添加4ST培养的MCF-7细胞，提取的基因组DNA进行氧化胺解反应；+4ST-反应表示添加1 mM 4ST培养的MCF-7细胞，提取的基因组DNA不进行氧化胺解反应；+4ST+反应表示添加1 mM 4ST培养的MCF-7细胞，提取的基因组DNA进行氧化胺解反应）中全部12种碱基突变的情况，并将统计出的突变频率从高到低排序，取中位数作为代表突变频率。图7显示经过4ST代谢标记和氧化胺解反应处理的样品中T-C突变和A-G突变频率显著高于其他样品，而其它类型的突变则显示一致。该结果与预期一致，其中A-G突变是由于双链DNA中4ST位点的对位原本为A碱基，在4ST发生化学转化后，其对位会在PCR过程中更替为G，从而导致A-G突变的出现，且其突变频率与T-C突变频率一致。

EXM1基因的一段684bp片段核酸序列为：

AAAACCACCCTTCTCTCTGGCCCACTGTGTCCTCTTCCTGCCCTGCCATCCCCTTCTGTGAATGTTAGACCCATGGGAGCAGCTGGTCAGAGGGGACCCCGGCCTGGGGCCCCTAACCCTATGTAGCCTCAGTCTTCCCATCAGGCTCTCAGCTCAGCCTGAGTGTTGAGGCCCCAGTGGCTGCTCTGGGGGCCTCCTGAGTTTCTCATCTGTGCCCCTCCCTCCCTGGCCCAGGTGAAGGTGTGGTTCCAGAACCGGAGGACAAAGTACAAACGGCAGAAGCTGGAGGAGGAAGGGCCTGAGTCCGAGCAGAAGAAGAAGGGCTCCCATCACATCAACCGGTGGCGCATTGCCACGAAGCAGGCCAATGGGGAGGACATCGATGTCACCTCCAATGACTAGGGTGGGCAACCACAAACCCACGAGGGCAGAGTGCTGCTTGCTGCTGGCCAGGCCCCTGCGTGGGCCCAAGCTGGACTCTGGCCACTCCCTGGCCAGGCTTTGGGGAGGCCTGGAGTCATGGCCCCACAGGGCTTGAAGCCCGGGGCCGCCATTGACAGAGGGACAAGCAATGGGCTGGCTGAGGCCTGGGACCACTTGGCCTTCTCCTCGGAGAGCCTGCCTGCCTGGGCGGGCCCGCCCGCCACCGCAGCCTCCCAGCTGCTCTCCGTGTCTCCAATCTCC，如SEQ ID NO:9所示。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 清华大学

<120> 基于4-硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检测方法

<130> PIDC3206061

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 模式核酸4ST-60nt

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> N为4-thiothymidine

<400> 1

ctggctatct aacgcttata gactggtaca ncagataacc ctcaaggatc gattgtgaag 60

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer1F

<400> 2

ttggcgatgg cggtagctaa ctaagtcgcc tggctatcta acgcttatag 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer1R

<400> 3

tcgtgcacat acagctgcac cgcacgcatg cttcacaatc gatccttgag 50

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer2F

<400> 4

tgtatggtaa cctgccagtt tgggacatca ttggcgatgg cggtagctaa 50

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer2R

<400> 5

tgctgaacga gcctgaagta aaagattatc tcgtgcacat acagctgcac 50

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer-seq

<400> 6

tgtatggtaa cctgccagtt tggga 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EMX1-F

<400> 7

aaaaccaccc ttctctctgg c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EMX1-R

<400> 8

ggagattgga gacacggaga g 21

<210> 9

<211> 684

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EXM1基因的一段684bp片段

<400> 9

aaaaccaccc ttctctctgg cccactgtgt cctcttcctg ccctgccatc cccttctgtg 60

aatgttagac ccatgggagc agctggtcag aggggacccc ggcctggggc ccctaaccct 120

atgtagcctc agtcttccca tcaggctctc agctcagcct gagtgttgag gccccagtgg 180

ctgctctggg ggcctcctga gtttctcatc tgtgcccctc cctccctggc ccaggtgaag 240

gtgtggttcc agaaccggag gacaaagtac aaacggcaga agctggagga ggaagggcct 300

gagtccgagc agaagaagaa gggctcccat cacatcaacc ggtggcgcat tgccacgaag 360

caggccaatg gggaggacat cgatgtcacc tccaatgact agggtgggca accacaaacc 420

cacgagggca gagtgctgct tgctgctggc caggcccctg cgtgggccca agctggactc 480

tggccactcc ctggccaggc tttggggagg cctggagtca tggccccaca gggcttgaag 540

cccggggccg ccattgacag agggacaagc aatgggctgg ctgaggcctg ggaccacttg 600

gccttctcct cggagagcct gcctgcctgg gcgggcccgc ccgccaccgc agcctcccag 660

ctgctctccg tgtctccaat ctcc 684

Claims (12)

1.一种5-R₁-4SdU代谢标记核酸的测定方法，其特征在于，所述方法包括：

1）利用5-R₁-4SdU对生物样品中的核酸进行标记，获得标记后的生物样品，其中，所述标记后的生物样品中包含含有5-R₁-4SdU的核酸；

2）提取所述标记后的生物样品中的核酸，以便获得第一核酸提取物；

3）将所述第一核酸提取物中的第一部分进行如制备核酸转化产物的方法中的氧化反应和胺解反应，以便获得反应后的核酸，其中，进行所述胺解反应后，所述含有5-R₁-4SdU的核酸中的5-R₁-4SdU转化为5-R₁-N4-R₂-dC；

4）将所述第一核酸提取物中的第二部分与3）中所述反应后的核酸分别进行扩增或文库构建，并进行测序，比较所述第一核酸提取物中的第二部分与所述反应后的核酸的测序结果，其中，核酸中出现T-C突变聚集的区域为该区域出现复制和/或修复的指示；

其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基；

R₂选自氢、C₁-C₈的烷基、C₅-C₂₀的芳香基、胺基、羟基；

其中，所述制备核酸转化产物的方法包括：

（1）以包含含有5-R₁-4SdU的核酸为反应底物，在氧化剂作用下进行氧化反应，以便获得氧化中间产物，所述氧化中间产物结构式为：

；

（2）以所述氧化中间产物为反应底物，在胺类化合物R₂-NH₂作用下发生胺解反应，以便获得所述核酸转化产物；

其中，所述胺类化合物R₂-NH₂选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺，

所述氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃，

所述氧化剂的浓度为10 μM-200 mM，

所述胺类化合物R₂-NH₂的浓度为1mM-5 M。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自细胞、组织、细菌、真菌、病毒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为细胞，利用5-R₁-4SdU对所述细胞中的核酸进行标记时，培养所述细胞的培养基中加入的5-R₁-4SdU浓度为1 μM-100mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA，进行扩增时所用的DNA聚合酶选自Taq、Q5、Phusion。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸通过体外合成方式获取或源自经5-R1-4SdU代谢标记的生物对象的核酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为体外合成的核酸，其浓度为0.025 μM-125 μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为经5-R1-4SdU代谢标记的生物对象的核酸，其浓度0.025 ng/μL-12.5 μg/μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述氧化反应或胺解反应的反应体系pH为5.0-13.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括进行所述氧化反应或胺解反应时，向反应体系中加入抑制核酸酶的试剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制核酸酶的试剂选自乙二胺四乙酸二钠、亚氨基二琥珀酸四钠、1,2-双（2-氨基苯氧基）-乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抑制核酸酶的试剂的浓度为1μM-100mM。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述氧化反应或胺解反应的温度为0-100℃。

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