CN112694987B - 一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法，属于生物降解领域。本发明的目的是为了解决高氯酸盐还原菌生长代谢速率缓慢和富集驯化周期长的问题。本发明提供了一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法，具体步骤为在填充石墨颗粒的反应器中接种活性污泥，采用间歇进水方式进行高氯酸盐还原菌的富集，然后采用连续式进水方式，进行高氯酸盐还原菌的驯化培养，提高高氯酸盐还原效率。在富集体系中引入导电材料，既为微生物提供附着生长的载体，又能加速电子传递过程，可实现高氯酸盐还原菌的快速富集驯化，有利于高氯酸盐微生物处理工艺的应用和推广，具有良好的社会效益，经济效益和环境效益。

Description

一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法

技术领域

本发明属于生物降解领域，具体涉及一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法。

背景技术

随着工业的快速发展，高氯酸盐污染问题日益严重，已在全球范围内引起公众和学者的广泛关注。近年来，在多种水环境(雨水、雪水、海水、地下水、饮用水甚至北极积雪)和食品中频频检出ClO₄ ^-，使得高氯酸盐的处理成为世界各国亟待解决的环境问题。高氯酸盐具有高溶解性、扩散速度快、化学性质稳定等特点，传统的沉淀、过滤和消毒等处理工艺难以将其有效去除。目前，微生物降解是ClO₄ ^-最有效的转化途径，具有高效、安全、经济、无二次污染等优点，是目前最具前景和应用价值的修复技术。

微生物在厌氧条件下，以ClO₄ ^-作为电子受体，在高氯酸盐还原酶、氯酸盐还原酶和亚氯酸盐歧化酶等一系列酶的催化下，依次被还原为氯酸盐和亚氯酸盐，并最终还原为氯离子。高氯酸盐降解菌多数为厌氧或兼性厌氧菌，生长相对缓慢，其富集驯化周期较长。如何快速获得高氯酸盐降解富集培养物成为制约着微生物还原去除高氯酸盐技术发展和应用的主要因素之一。目前传统的富集驯化方法一般是从污染环境中采集样品，加入到选择性培养基中，然后经过多次传代培养驯化，获得稳定的降解菌群。但这种方法往往存在着工作量大，操作繁琐，富集周期长，菌群降解性能不稳定等缺点。

发明内容

本发明的目的是为了解决高氯酸盐还原菌生长代谢速率缓慢和富集驯化周期长的技术难题，为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)制备基础培养基：培养基的成分由如下成分组成：0.95g/L KH₂PO₄、1.5g/LNa₂HPO₄·12H₂O、1.8g/L CH₃COONa,0.12g/LMgSO₄·7H₂O、0.3g/L(NH₄)₂SO₄和微量元素1mL；将培养基进行高压蒸汽灭菌，通入氮气去除O₂；

(2)富集高氯酸盐还原菌群：向填充石墨颗粒的厌氧反应器中接种活性污泥，污泥接种浓度为18g/L；向步骤(1)制备得到的培养基中添加0.1g/L的NaClO₄·H₂O，然后将培养基泵入厌氧反应器中，采用间歇进水方式，每天以流速200mL/h，进水3h，进水量为600mL，温度控制在30℃，富集培养15天，得到高氯酸盐还原菌群；

(3)驯化高氯酸盐还原菌群：向步骤(1)制备得到的培养基中添加不同浓度的NaClO₄·H₂O，然后将培养基泵入到到步骤(2)的厌氧反应器中，在42mL/h的进水流速，48h的水力滞留时间下连续运行，当出水ClO₄ ^-浓度相对进水浓度ClO₄ ^-降低90％以上时，在该浓度下运行5d再逐渐提高进水的培养基中ClO₄ ^-浓度，所述进水ClO₄ ^-浓度由0.1g/L依次提高至0.6g/L、1.1g/L、1.6g/L、2.1g/L、2.6g/L和3.1g/L，直至ClO₄ ^-完全被还原，得到驯化后的高氯酸盐还原菌群。

进一步地限定，步骤(1)所述微量元素为0.1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.05g/LMnSO₄·H₂O、0.3g/L H₃BO₃、0.2g/L CaCl₂·6H₂O、0.01g/L CuSO₄·5H₂O、0.02g/LNiCl₂·6H₂O、0.03g/L Na₂MoO₄·2H₂O和0.03g/LNa₂SeO₃。

进一步地限定，步骤(2)所述活性污泥包括以下质量分数的菌种：变形菌门(Proteobacteria)29.13％。

进一步地限定，所述变形菌门的各分支菌纲丰度如下：β-变形菌纲(β-Proteobacteria)占16.50％，δ-变形杆菌纲(δ-Proteobacteria)占9.25％，γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)占1.98％，α-变形菌纲(α-Proteobacteria)占0.9％和ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)占0.5％。

进一步地限定，步骤(2)中所述填充石墨颗粒的厌氧反应器中，石墨颗粒的粒径2-4mm，填充密度为2g/cm³。

进一步地限定，步骤(2)所述石墨颗粒是用质量分数为32％的盐酸溶液和蒸馏水依次清洗石墨颗粒三次，然后150℃烘干2h，放入干燥器冷却至室温后填充到上流式厌氧反应器中。

有益效果：本发明采用的反应器操作维护简单，运行成本低；本发明添加导电性石墨颗粒，不仅为高氯酸盐还原菌提供了合适的附着载体，而且有利于电子传递，大大缩短了高氯酸盐还原菌的富集时间；本发明采用间歇进水方式富集，连续进水方式驯化，逐步提高进水中的高氯酸盐浓度，得到高效的高氯酸盐还原菌群，3d内将3.1g/L ClO₄ ^-完全还原。本发明有利于高氯酸盐微生物处理工艺的应用和推广，具有良好的社会效益，经济效益和环境效益。

附图说明

图1为本发明的反应器结构示意图，其中，1是进水管，2是取样口，3是出水管，4是阀门，5是恒温水浴层，6是循环水箱，7是进水瓶，8是蠕动泵；

图2为富集驯化阶段反应器中高氯酸盐降解效率图，其中横坐标是培养时间，纵坐标是ClO₄ ^-浓度；

图3为富集驯化阶段反应器中菌群的丰度变化图，其中，横坐标是培养时间，纵坐标是菌种的相对丰度；

图4为高氯酸盐降解情况图，其中，横坐标是培养时间，纵坐标是ClO₄ ^-浓度和ClO₄ ^-去除率。

具体实施例

本发明采用的实验试剂均是商业购买。

实施例1.

以污水处理厂的二沉池污泥为接种源，利用本发明的方法对污泥中的高氯酸盐还原菌进行富集驯化。原始污泥中，变形菌门(Proteobacteria)的数量较多，占细菌丰度的29.13％；其分支下的5个纲中β-变形菌纲(β-Proteobacteria)所占比例最大，占细菌总丰度的16.50％；其次为δ-变形杆菌纲(δ-Proteobacteria)，占总丰度的9.25％；γ-变形菌纲占细菌总丰度的1.98％；α-变形菌纲丰度为0.9％；ε-变形菌纲数量最少，为0.5％。

本发明中富集驯化是在上流式厌氧反应器中进行，结构如图1所示，反应器呈圆柱形，由有机玻璃制成，内径为12cm，高18cm，有效体积2L。反应器底部设有进水管1，侧面沿池壁向上依次平均开设三个不同高度的取样口2，顶端设有出水口3，进出水管由阀门4控制，反应器温度由外部的恒温水浴层5控制，控制温度为(30±1)℃，6是恒温循环水箱，7是进水瓶，8是蠕动泵。进水瓶7中的新鲜培养基以特定流速自下而上流动，使填充载体处理流化状态，载体上的生物膜可以充分地和培养基接触，有利于微生物细胞的生长，提高富集微生物的数量。反应器用黑布包裹，避免光照影响厌氧微生物生长。

上流式厌氧反应器内部填充石墨颗粒，粒径为2-4mm，填充密度为2g/cm³，处理方法是用质量分数为32％的盐酸溶液和蒸馏水依次清洗石墨颗粒三次，以去除石墨颗粒中携带的杂质，然后150℃烘干2h，放入干燥器冷却至室温后填充到反应器内，构成富集驯化反应器即填充石墨颗粒的厌氧反应器。

利用本发明的方法从污水处理厂的厌氧污泥中富集和驯化高氯酸盐还原菌，具体步骤如下

(1)制备培养基：0.95g/LKH₂PO₄、1.5g/LNa₂HPO₄·12H₂O、1.8g/L CH₃COONa、0.12g/LMgSO₄·7H₂O、0.3g/L(NH₄)₂SO₄、每升培养基加入1mL微量元素，pH调节至7.2～7.3，其中微量元素包含0.1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.05g/LMnSO₄·H₂O、0.3g/L H₃BO₃、0.2g/L CaCl₂·6H₂O、0.01g/L Cu SO4·5H₂O、0.02g/LNiCl₂·6H₂O、0.03g/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.03g/L Na₂SeO₃。将培养基进行高压蒸汽灭菌，通入氮气以去除O₂；

(2)富集高氯酸盐还原菌群：向厌氧反应器中接种活性污泥，污泥接种浓度为18g/L；向步骤(1)制备得到的培养基中添加0.1g/L的NaClO₄·H₂O，然后将培养基接种泵入到厌氧反应器中，采用间隙进水方式，每天以流速200mL/h，进水3h，进水量为600mL，温度控制在30℃，富集培养15天，得到高氯酸盐还原菌群；

(3)驯化高氯酸盐还原菌群：向步骤(1)制备得到的培养基中添加不同浓度的NaClO₄·H₂O，然后将培养基泵入到步骤(2)的厌氧生物反应器中，在42mL/h的进水流速，48h的水力滞留时间下连续运行，当出水ClO₄ ^-浓度相对进水浓度ClO₄ ^-降低90％以上时，在该浓度下运行5d再提高进水的培养基中ClO₄ ^-浓度，所述进水ClO₄ ^-浓度由0.1g/L依次提高至0.6g/L、1.1g/L、1.6g/L、2.1g/L、2.6g/L、3.1g/L，直至ClO₄ ^-完全被还原，得到驯化后的高氯酸盐还原菌群。

(4)菌群的鉴定：对不同富集驯化阶段反应器中微生物菌群进行高通量测序，获得富集驯化过程中微生物菌群丰度变化图。结果如图3所示，随着ClO₄ ^-浓度的不断提高，变形菌门细菌丰度由原始活性污泥的29.13％上升至75.89％，其中β-变形菌纲丰度由16.50％上升至45.62％，γ-变形杆菌纲丰度也由1.98％上升至29.06％，而α-和δ-变形菌纲丰度逐渐下降，ε-变形菌纲变化不明显。由此可见，随着富集驯化的进行，体系内以β-变形菌纲和γ-变形菌纲的细菌逐渐成为优势菌。据研究，已鉴定出的高氯酸盐还原菌主要隶属于变形菌门的α、β、γ和ε亚类，其中多数又归属于β-变形杆菌纲，比如代表性的高氯酸盐还原菌Azospira和Dechloromonas都属于β-变形杆菌纲；另外隶属于γ-变形菌纲的假单胞菌属(Pseudomonas)中的某些细菌也被证实具有高氯酸盐还原能力。由此可见，高氯酸盐还原菌被成功富集，且经过驯化获得了较高的高氯酸盐还原能力。

(5)ClO₄ ^-还原效率的验证：驯化结束后，从富集驯化反应器中随机取1g石墨颗粒，置于装有100mL灭菌除氧液体培养基的厌氧瓶中，ClO₄ ^-浓度为3.1g/L，设置三个重复样，30℃条件下厌氧培养，每12小时取样测定ClO₄ ^-浓度，结果表明经过富集和驯化得到的高氯酸盐还原菌群可以在3d内实现3.1g/L ClO₄ ^-的完全还原，从而验证了富集驯化菌群高效的高氯酸盐还原效率。

Claims (3)

1.一种利用导电材料富集和驯化高氯酸盐还原菌群的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

（1）制备基础培养基：培养基由如下成分组成：0.95 g/L KH₂PO₄、1.5 g/L Na₂HPO₄•12H₂O、1.8 g/L CH₃COONa、0.12 g/L MgSO₄·7H₂O、0.3 g/L (NH₄)₂SO₄和微量元素1 mL；将培养基进行高压蒸汽灭菌，通入氮气去除O₂；所述微量元素为 0.1 g/L ZnSO₄•7H₂O、0.05g/L MnSO₄•H₂O、0.3 g/L H₃BO₃、0.2 g/L CaCl₂•6H₂O、0.01 g/L CuSO₄•5H₂O、0.02 g/LNiCl₂•6H₂O、0.03 g/L Na₂MoO₄•2H₂O和0.03 g/L Na₂SeO₃；

（2）富集高氯酸盐还原菌群：向填充石墨颗粒的厌氧反应器中接种活性污泥，污泥接种浓度为18 g/L；向步骤（1）制备得到的培养基中添加0.1 g/L的NaClO₄•H₂O，然后将培养基泵入厌氧反应器中，采用间歇进水方式，每天以流速200 mL/h，进水3 h，进水量为600 mL，温度控制在30℃，富集培养15天，得到高氯酸盐还原菌群；所述填充石墨颗粒的厌氧反应器中，石墨颗粒的粒径为2-4 mm，填充密度为2 g/cm³；所述石墨颗粒是用质量分数为32%的盐酸溶液和蒸馏水依次清洗石墨颗粒三次，然后150℃烘干2 h，放入干燥器冷却至室温后填充到上流式厌氧反应器中；

（3）驯化高氯酸盐还原菌群：向步骤（1）制备得到的培养基中添加不同浓度的NaClO₄•H₂O，然后将培养基泵入到步骤（2）的厌氧反应器中，在42 mL/h的进水流速，48 h的水力滞留时间下连续运行，当出水ClO₄ ^-浓度相对进水ClO₄ ^-浓度降低90%以上时，在该浓度下运行5d再逐渐提高进水的培养基中ClO₄ ^-的浓度，所述进水ClO₄ ^-浓度由0.1 g/L依次提高至0.6g/L、1.1 g/L、1.6 g/L、2.1 g/L、 2.6 g/L和3.1 g/L，直至ClO₄ ^-完全被还原，得到驯化后的高氯酸盐还原菌群。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述活性污泥包括以下质量分数的菌种：变形菌门（Proteobacteria）29.13%。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述变形菌门的各分支菌纲丰度如下：β-变形菌纲(β-Proteobacteria)占16.50%，δ-变形杆菌纲(δ-Proteobacteria)占9.25%，γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)占1.98%，α-变形菌纲(α-Proteobacteria)占0.9%和ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)占 0.5% 。

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