CN112680384A - 苯酚降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苯酚降解菌及其应用。该苯酚降解菌是丛毛单胞菌(Comamonas sp.)新菌，其菌株号为WMF1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21167。实验证明WMF1具有降解苯酚和除磷的功能，可应用于降解水体污染中的苯酚和富营养化水体中总磷的去除，在环境治理等方面将具有广泛的应用前景。

Description

苯酚降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域中苯酚降解菌及其应用。

背景技术

丛毛单胞菌属(Comamonas)是1985年建立的，属于细菌域(Bacteria)-变形杆菌门(Proteobacteria)-β变形菌纲(Betaproteobacteria)-伯克氏菌目(Burkholderiales)-丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)，目前包括23个有效描述种。苯酚是炼焦、炼油、医药、农药等行业生产的原料或中间体，含酚废水的排放导致水体污染并严重威胁人类的健康，开发能降解苯酚的功能微生物具有重要价值。同时磷是引起水体富营养化的关键营养物质，会造成藻类过度繁殖，导致使水质恶化。生物法除磷是基于除磷菌在好氧及厌氧条件下，摄取及释放磷的原理，通过好氧-厌氧条件的交替运行来实现除磷。除磷菌是传统活性污泥工艺中一类特殊的细菌，在好氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。一般认为，除磷菌分为两种，兼性厌氧的反硝化除磷菌和好氧除磷菌，其中反硝化除磷菌能利用氧或硝酸盐作为电子受体，而好氧除磷菌只能利用氧作为电子受体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降解环境污染中的苯酚和/或如何去除富营养水体中的磷和/或如何进行环境治理。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丛毛单胞菌(Comamonas sp.)菌。所述丛毛单胞菌(Comamonas sp.)的菌株名称为WMF1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCC No.21167(以下简称丛毛单胞菌WMF1)。其16S rDNA的核苷酸序列含有序列表中序列1所示的DNA分子。

为了解决上述技术问题，本发明提供了丛毛单胞菌的培养物。

本发明所提供的丛毛单胞菌的培养物，是将丛毛单胞菌WMF1在微生物培养基中培养得到的物质(即发酵产物，如含有丛毛单胞菌WMF1和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有丛毛单胞菌WMF1和分泌到固体培养基内的物质即固体发酵物)。

为解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。

本发明所提供的菌剂含有丛毛单胞菌WMF1或/和丛毛单胞菌WMF1的代谢物或/和上述培养物。

上文中，所述丛毛单胞菌WMF1的代谢物可为丛毛单胞菌WMF1的发酵液。丛毛单胞菌WMF1的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养丛毛单胞菌WMF1，收集发酵液(含有丛毛单胞菌WMF1和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为丛毛单胞菌WMF1的代谢物。

上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。

上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，包括但不限于液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂等。

上述菌剂具有下述至少一种特性：

A1)降解苯酚；

A2)降解磷或去除磷。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述丛毛单胞菌的下述至少一种应用：

B1)在降解苯酚中的应用；

B2)在制备降解苯酚的产品中的应用

B3)在降解磷或去除磷中的应用；

B4)在制备降解磷或去除磷的产品中的应用；

B5)在治理环境苯酚污染中的应用；

B6)在制备治理环境苯酚污染的产品中的应用；

B7)在治理水体富营养化中的应用；

B8)在制备治理水体富营养化的产品中的应用。

上述菌剂的下述至少一种应用也属于本发明的保护范围：

C1)在降解苯酚中的应用；

C2)在制备降解苯酚的产品中的应用

C3)在降解磷或去除磷中的应用；

C4)在制备降解磷或去除磷的产品中的应用；

C5)在治理环境苯酚污染中的应用；

C6)在制备治理环境苯酚污染的产品中的应用；

C7)在治理水体富营养化中的应用；

C8)在制备治理水体富营养化的产品中的应用。

本发明还提供了培养上述丛毛单胞菌的方法，包括将上述的丛毛单胞菌在微生物培养基中培养的步骤。

实验证明，上述丛毛单胞菌WMF1能够降解苯酚和除磷，苯酚降解率为59.71％，总磷去除率为31.31％。WMF1是一株功能性的Comamonas属新物种，在环境治理等方面将具有广泛的应用前景。

保藏说明

菌种名称：丛毛单胞菌

拉丁名：Comamonas sp.

菌株编号：WMF1

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2020年11月12日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21167

附图说明

图1为WMF1与有效描述种系统发育树。

图2为WMF1与同属有效描述种和已报道同属其它菌株系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的培养基的配置方法如下：

苯酚培养基：溶质为：三水磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钠、葡萄糖、氯化铵、苯酚，溶剂为水。培养基中各溶质的浓度分别为：三水磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖5g/L、氯化铵0.75g/L、苯酚0.1g/L。

LB培养基：10g/L氯化钠、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH 7-8。

富磷培养基：溶质为：三水磷酸氢二钾、七水硫酸镁、氯化钠、葡萄糖、乙酸钠、氯化铵，溶剂为水。培养基中各溶质的浓度分别为：三水磷酸氢二钾0.07g/L、七水硫酸镁0.15g/L、氯化钠0.05g/L、葡萄糖0.4g/L、乙酸钠0.25g/L、氯化铵0.18g/L。

实施例1、WMF1菌株的鉴定和功能检测

(1)丛毛单胞菌WMF1的鉴定

丛毛单胞菌WMF1于2020年5月分离自安徽省铜陵市河道底泥。WMF1在LB(10g/LNaCl、10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉，pH 7-8)固体培养基上形成圆形规则土白色菌落，不产蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶和淀粉酶。将活化的WMF1接种在液体LB培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取1ml新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体于2ml离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后，采用通用引物8F/1492R进行PCR扩增。PCR产物电泳检测后，测定16S rDNA基因序列，获得长度为1397bp的片段，具体序列见序列表中序列1。

将该16S rDNA基因序列在NCBI网站进行序列相似性比对，经过比对该基因序列与Comamonas属具有相似性(其中与Comamonas odontotermitis相似性最高为97.36％)，表明该WMF1菌株属于Comamonas属，但跟已有菌株的相似性较低。将WMF1与有效描述种(即Comamonas属具有代表性的种)使用软件MEGA Neighbor-Joining的Bootstrap method1000次重排构树后得到的系统发育树如图1。WMF1与发育树最接近的菌株Comamonasodontotermitis分别处在明显不同的两个分支上，且二者的相似性小于97.5％，显示WMF1是一株跟已有效描述种都不同的新种。

进一步的将Ezbiocloud数据库中的同属菌株序列的AB021354、BAEC01000106、CP042344、CP044131、EU464941、FR691488、HQ116758、HQ232452、HQ738400；NCBI数据库中与WMF1相似性最高(也小于97.5％)的菌株序列MN540117、MN513230、NR043859、GU458274、GU458261、KY938155、MT386131、KX461916、MN889377、KT005541；CN201810115869、CN201811214591使用软件MEGA Neighbor-Joining的Bootstrapmethod 1000次重排构树后系统发育树如图2。WMF1依然处于明显不同的独立分支上。

因此综上显示WMF1是一株跟有公开文献报道都不同的新发现新种。

丛毛单胞菌WMF1已于2020年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.21167。

(2)丛毛单胞菌WMF1降解苯酚功能检测

将活化的丛毛单胞菌WMF1接种在液体LB培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体然后用等体积的无菌水悬浮成菌悬液。按5％(v/v)将5ml丛毛单胞菌WMF1菌悬液接种在100ml苯酚培养基中，并有同样按5％(v/v)将5ml无菌水接种在100ml苯酚培养基作为对照，30℃、150rpm振荡培养7d。实验包括三次重复。

由于苯酚在270nm波长处有稳定的最大吸收峰，且浓度与OD_270nm有良好的线性关系(y＝0.0166x，其中R²＝0.9994，y为OD_270nm值，x为苯酚浓度)，因此使用紫外分光光度法测定接菌培养液和未接菌对照培养液中的苯酚含量，按(不接菌对照苯酚浓度-接菌培养液苯酚浓度)/不接菌对照苯酚浓度×100％计算苯酚降解率。最终三次重复实验得到接菌WMF1菌株的培养液苯酚降解率的平均值为59.71％，表明WMF1菌株具有降解苯酚的功能，在环境治理等方面将具有广泛的应用前景。

(3)丛毛单胞菌WMF1除磷功能检测

将活化的丛毛单胞菌WMF1接种在液体LB培养基中，30℃、150rpm振荡培养24h。取新鲜培养菌液4℃、8000rpm离心5min，收集菌体然后用等体积的无菌水悬浮成菌悬液。按5％(v/v)将5ml丛毛单胞菌WMF1菌悬液接种在100ml富磷培养基中，并有同样按5％(v/v)将5ml无菌水接种在100ml富磷培养基对照，30℃、150rpm振荡培养2d。实验包括三次重复。

使用钼酸铵分光光度法(在中性条件下用过硫酸钾使试样消解，将所含磷全部氧化为正磷酸盐；在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物，总磷量与OD_700nm有良好的线性关系：y＝0.0181x+0.0036，其中R²＝0.9992，y为OD_700nm值，x为总磷量)测定接菌培养液和未接菌对照的总磷含量，按(不接菌对照总磷酚浓度-接菌培养液总磷浓度)/不接菌对照总磷浓度×100％计算总磷去除率。三次重复实验得到接菌WMF1菌株的培养液的总磷去除率平均值为31.31％，表明WMF1菌株具有除磷的功能，同样在环境治理等方面将具有广泛的应用前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 微米环创生物科技（北京）有限公司

<120> 苯酚降解菌及其应用

<130> GNCSQ210204

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 丛毛单胞菌（Comamonas sp.）

<400> 1

tgcagtcgaa cggcagcacg ggtgcttgca cctggtggcg agtggcgaac gggtgagtaa 60

tacatcggaa cgtgcctggt agtgggggat aactgctcga aagagcagct aataccgcat 120

gagatctaag gatgaaagca ggggaccttc gggccttgtg ctaccagagc ggctgatggc 180

agattaggta gttggtgggg taaaggctta ccaagcctgc gatctgtagc tggtctgaga 240

ggacgaccag ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaattttgg acaatgggcg caagcctgat ccagcaatgc cgcgtgcagg atgaaggcct 360

tcgggttgta aactgctttt gtacggaacg aaaagtactt ctctaataca gaggtgcgat 420

gacggtaccg taagaataag caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtgc gcaggcggtt atgtaagaca 540

gaggtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcctttgt gactgcatgg ctagagtgcg 600

gcagaggggg atggaattcc gcgtgtagca gtgaaatgcg tagatatgcg gaggaacacc 660

gatggcgaag gcaatcccct gggcctgcac tgacgctcat gcacgaaagc gtggggagca 720

aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat gtcaactggt tgttgggaat 780

taactttctc agtaacgaag ctaacgcgtg aagttgaccg cctggggagt acggccgcaa 840

ggttgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggatgatg tggtttaatt 900

cgatgatgca acgcgaaaaa ccttacccac ctttgacatg gcaggaagac tccagagacg 960

gagttgtgct cgaaagagaa cctgcacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gccattagtt gctacgaaag 1080

ggcactctaa tgggactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcct 1140

catggccctt ataggtgggg ctacacacgt catacaatgg ctggtacaaa gggttgccaa 1200

cccgcgaggg ggagctaatc ccataaagcc agtcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc 1260

gactgcgtga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgtcacggt gaatacgttc 1320

ccgggtcttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagcgg gtctcgccag aagtaggtag 1380

cctaaccgca aggaggg 1397

Claims (8)

1.丛毛单胞菌，其特征在于：所述丛毛单胞菌为丛毛单胞菌(Comamonas sp.)，其菌株号为WMF1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.21167。

2.根据权利要求1所述的丛毛单胞菌，其特征在于：所述丛毛单胞菌的16S rDNA核苷酸序列含有序列表中序列1所示的DNA分子。

3.权利要求1或2所述的丛毛单胞菌的培养物，是将权利要求1或2中所述的丛毛单胞菌在微生物培养基中培养得到的物质。

4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2中所述的丛毛单胞菌或/和权利要求1或2中所述的丛毛单胞菌的代谢物或/和权利要求3中所述的培养物。

5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种特性：

A1)降解苯酚；

A2)降解磷或去除磷。

6.权利要求1或2中所述的丛毛单胞菌的下述至少一种应用：

B1)在降解苯酚中的应用；

B2)在制备降解苯酚的产品中的应用

B3)在降解磷或去除磷中的应用；

B4)在制备降解磷或去除磷的产品中的应用；

B5)在治理环境苯酚污染中的应用；

B6)在制备治理环境苯酚污染的产品中的应用；

B7)在治理水体富营养化中的应用；

B8)在制备治理水体富营养化的产品中的应用。

7.权利要求4或5所述菌剂的下述至少一种应用：

C1)在降解苯酚中的应用；

C2)在制备降解苯酚的产品中的应用

C3)在降解磷或去除磷中的应用；

C4)在制备降解磷或去除磷的产品中的应用；

C5)在治理环境苯酚污染中的应用；

C6)在制备治理环境苯酚污染的产品中的应用；

C7)在治理水体富营养化中的应用；

C8)在制备治理水体富营养化的产品中的应用。

8.培养权利要求1或2所述的丛毛单胞菌的方法，包括将权利要求1或2中所述的丛毛单胞菌在微生物培养基中培养的步骤。

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