CN112673034A - 包含杂聚物的流动池 - Google Patents

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Abstract

流动池包括支撑物和附接至支撑物的杂聚物。杂聚物包括包含与附接至引物的官能团反应的附接基团的丙烯酰胺单体和包含刺激响应性官能团的单体。包含刺激响应性官能团的单体可以是pH响应性的、温度响应性的、糖响应性的、亲核体响应性的和/或盐响应性的。

Description

包含杂聚物的流动池
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年1月14日提交的美国临时申请序列号62/792,250的权益，该美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
背景
生物阵列是用于检测和分析分子的多种工具之一，所述分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。在这些应用中，阵列被设计成包括用于在人类和其他生物体的基因中存在的核苷酸序列的探针。例如，在某些应用中，单独的DNA探针和RNA探针可以附接在阵列支撑物上的呈几何网格(或随机)的位置处。例如来自人或生物体的测试样品可以暴露于网格，使得互补片段在阵列中的单独位点处与探针杂交。然后可以通过将特定频率的光在位点上扫描以通过片段所杂交的位点的荧光识别出样品中存在哪些片段来检查阵列。
生物阵列可以用于基因测序。一般来说，基因测序涉及确定在一段遗传物质(诸如DNA或RNA的片段)中的核苷酸或核酸的顺序。越来越长的碱基对序列正在被分析，并且得到的序列信息可以用于多种生物信息学方法中，以将片段逻辑地拟合在一起，以便可靠地确定片段所衍生自的广泛长度的遗传物质的序列。已经开发了自动化的基于计算机的特征片段的检查，并且已经被用于基因组作图、基因及其功能的识别、某些状况和疾病状态的风险评估等。除了这些应用之外，生物阵列还可以用于检测和评估宽范围的分子、分子家族、基因表达水平、单核苷酸多态性和基因分型。
概述
本文公开的一个方面是一种可切换杂聚物(switchable heteropolymer)，该可切换杂聚物包括：包含刺激响应性官能团(stimuli-responsive functional group)的多于一种单体，其中刺激响应性官能团选自由以下组成的组：pH响应性官能团、温度响应性官能团、糖响应性官能团、亲核体响应性官能团和盐响应性官能团。
刺激响应性官能团当暴露于预定的刺激时能够经历修饰，其中修饰改变可切换杂聚物的极性和/或构象。
在一些方面中，可切换杂聚物还包括接枝至其的引物。
在一些方面中，刺激响应性官能团不是叠氮基基团。
在一些方面中，可切换杂聚物包括两种或更多种不同的刺激响应性单体，该刺激响应性单体响应于相同或不同的刺激。
在一些方面中，可切换杂聚物是包含多于一种任选地含有叠氮基基团的丙烯酰胺单体的共聚物。在这些方面的一个方面中，丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体或者是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体和第二丙烯酰胺单体的组合。
在一些方面中，可切换杂聚物包括任选地包含叠氮基基团的糖单体(sugarmonomer)。
在一些方面中，pH响应性官能团选自由以下组成的组：被保护为缩醛、半缩醛或缩酮的羟基、1,2-二醇、1,3-二醇，叔丁氧基羰基氨基基团，9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团，氨基基团，羧酸酯/盐基团，羧酸基团，磺酸酯/盐基团和磺酸基团。
在其他方面中，糖响应性官能团(saccharide-responsive functional group)包括硼酸基团。
在还其他方面中，亲核体响应性官能团具有以下结构：
Figure BDA0002851688770000021
其中：(a)Y是SO2并且Y’是CH2；或者(b)Y和Y’两者均是C(O)。
在又另外的方面中，盐响应性官能团是表现出反聚电解质(antipolyelectrolyte)行为的两性离子官能团。
在一些方面中，温度响应性基团包括热敏性羟基或氨基保护基团。
应理解，本文公开的可切换杂聚物的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。
本文公开的另一个方面是一种制备可切换杂聚物的方法，该方法包括使多于一种包含刺激响应性官能团的单体与多于一种第二单体共聚。
在一些方面中，第二单体是包含叠氮基基团的糖单体或丙烯酰胺单体。在一些方面中，丙烯酰胺单体包含叠氮基基团。在一些方面中，丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体或者是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体和第二丙烯酰胺单体的组合。
应理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，方法和/或可切换杂聚物的特征的任何组合可以一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
本文公开的另一个方面是一种流动池，该流动池包括支撑物和附接至支撑物的可切换杂聚物。可以使用本文公开的任何可切换杂聚物。在一些方面中，流动池还包括接枝至可切换杂聚物的引物。
应理解，该流动池的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，流动池和/或方法和/或可切换杂聚物的特征的任何组合可以一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
本文公开的还另一个方面是一种制造流动池的方法，该方法包括使可切换杂聚物与流动池支撑物的至少一部分接触，从而将可切换杂聚物附接至流动池支撑物。
在一些方面中，该方法包括将引物接枝至附接至支撑物的可切换杂聚物。
在其他方面中，该方法包括将附接至流动池支撑物的可切换杂聚物暴露于预定的刺激。在一些方面中，该方法还包括在暴露之后，对流动池进行测序操作。
应理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，流动池和/或任何方法和/或可切换杂聚物的特征的任何组合可以一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
还另一个方面是一种测序方法，该测序方法包括：将引物接枝至流动池支撑物上的可切换杂聚物；将流动池支撑物上的可切换杂聚物暴露于预定的刺激，从而引起可切换杂聚物的极性和/或构象的改变；将核酸模板与流动池支撑物上的引物杂交；扩增流动池支撑物上的核酸模板以产生扩增的模板；以及当标记的核苷酸与扩增的模板中的互补核苷酸缔合时检测信号。
应理解，该方法的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，流动池和/或任何方法和/或可切换杂聚物的特征的任何组合可以以任何期望的方式一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
本文公开的又另一个方面是一种杂聚物，该杂聚物包括包含与附接至引物的官能团反应的附接基团(attachment group)的单体和包含刺激响应性官能团的单体，其中包含刺激响应性官能团的单体选自由以下组成的组：包含末端pH响应性官能团的丙烯酰胺单体；包含末端pH响应性官能团的乙烯基或丙烯酸酯/盐单体(acrylate monomer)，所述末端pH响应性官能团选自由具有酸不稳定的保护基团的羟基、具有碱不稳定的保护基团的羟基、具有酸不稳定的保护基团的氨基、具有碱不稳定的保护基团的氨基、磺酸酯/盐基团和磺酸基团组成的组；温度响应性N-取代的丙烯酰胺；包含末端糖响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；包含末端亲核体响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；以及包含末端盐响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体。
在一些方面中，包含刺激响应性官能团的单体当暴露于预定的刺激时将经历修饰，其中修饰改变可切换杂聚物的极性和/或构象。
该杂聚物的一些方面还包括接枝至附接基团的引物。
在一些方面中，附接基团选自由以下组成的组：叠氮基基团、烯基基团、炔基基团、醛基团、腙基团、肼基团、四唑基团、四嗪基团和硫醇基团。
在其他方面中，丙烯酰胺单体的附接基团包括叠氮基基团。在一些实例中，丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。在一些实例中，杂聚物还包括第二丙烯酰胺单体。
在一些方面中，包含刺激响应性官能团的单体是包含末端pH响应性官能团的丙烯酰胺单体；并且末端pH响应性官能团选自由以下组成的组：被保护为缩醛、半缩醛或缩酮的羟基、1,2-二醇、1,3-二醇，叔丁氧基羰基氨基基团，9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团，氨基基团，羧酸酯/盐基团，羧酸基团，磺酸酯/盐基团和磺酸基团。
在其他方面中，包含刺激响应性官能团的单体是包含末端糖响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且末端糖响应性官能团包括硼酸基团。在一个实例中，包含刺激响应性官能团的单体是3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。
在一些方面中，包含刺激响应性官能团的单体是包含末端亲核体响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且末端亲核体响应性官能团具有以下结构：
Figure BDA0002851688770000051
其中：(a)Y是SO2并且Y’是CH2；或者(b)Y和Y’两者均是C(O)。
在其他方面中，包含刺激响应性官能团的单体是包含末端盐响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且盐响应性官能团是表现出反聚电解质行为的两性离子官能团。在实例中，包含刺激响应性官能团的单体具有以下结构中的一种：
(i)
Figure BDA0002851688770000061
其中A是O或NH，并且Rz是H或C1-4烷基；或
(ii)
Figure BDA0002851688770000062
其中Rz是H或C1-4烷基。
在一些方面中，包含刺激响应性官能团的单体是温度响应性N-取代的丙烯酰胺；并且温度响应性N-取代的丙烯酰胺包括热敏性羟基或氨基保护基团。
在一些方面中，包含刺激响应性官能团的单体是温度响应性N-取代的丙烯酰胺；并且温度响应性N-取代的丙烯酰胺是N-异丙基丙烯酰胺。
应理解，该杂聚物的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，杂聚物和/或流动池和/或任何方法的特征的任何组合可以以任何期望的方式一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
本文公开的另一个方面是具有以下结构的杂聚物：
Figure BDA0002851688770000071
其中n在从10至500的范围内。
应理解，该杂聚物和/或流动池和/或任何方法的特征的任何组合可以以任何期望的方式一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
本文公开的还另一个方面是一种制备杂聚物的方法，该方法包括从由以下组成的组中选择包含刺激响应性官能团的单体：包含末端pH响应性官能团的丙烯酰胺单体；包含末端pH响应性官能团的乙烯基或丙烯酸酯/盐单体，所述末端pH响应性官能团选自由具有酸不稳定的保护基团的羟基、具有碱不稳定的保护基团的羟基、具有酸不稳定的保护基团的氨基、具有碱不稳定的保护基团的氨基、磺酸酯/盐基团和磺酸基团组成的组；温度响应性N-取代的丙烯酰胺；包含末端糖响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；包含末端亲核体响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；和包含末端盐响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；以及使包含刺激响应性官能团的单体与包含与附接至引物的官能团反应的附接基团的丙烯酰胺单体共聚。
在一些方面中，包含附接基团的丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。
该方法的一些方面还包括使包含刺激响应性官能团的单体和包含附接基团的丙烯酰胺单体与第二丙烯酰胺单体共聚。
应理解，该方法和/或流动池和/或任何杂聚物的特征的任何组合可以以任何期望的方式一起被使用和/或与本文公开的任何实例组合。
附图简述
通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的实例的特征将变得明显，其中相似的参考数字对应于类似的尽管可能不相同的组分。为了简洁起见，具有先前描述的功能的参考数字或特征可以结合或可以不结合其中它们出现的其他附图来描述。
图1A至图1D，连同图1E和图1F、或连同图1G和图1H，是描绘本文公开的方法的各个实施例的示意性横截面图；
图2A至图2D是描绘本文公开的方法的另一个实施例的示意性横截面图；和
图3A和图3B是描绘由比较聚合物和本文公开的聚合物的实施例形成的流动池的错误率百分比(图3A)和质量度量百分比(图3B)的图。
详细描述
除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。
术语包含(comprising)、包括(including)、含有(containing)和这些术语的多种形式彼此同义，并且意指同样广泛。
术语顶(top)、底(bottom)、下(lower)、上(upper)、上(on)和相关术语在本文中用于描述流动池和/或流动池的多种部件。应理解，这些方向术语不意指暗示特定的方向，而是用于指示部件之间的相对方向。方向术语的使用不应被解释为将本文公开的实例限制于任何特定的方向。
如本文使用的，“缩醛基团”指的是具有以下连接R2C(OR’)2的官能团，其中R基团和R’基团各自是有机片段。缩醛基团包括缩醛、缩酮、半缩醛和半缩酮。在缩醛中，一个R基团是H。在一些方面中，R’是C1-4烷基，或者两个R’基团一起形成C2-4亚烷基。缩醛保护基团可以用于保护羟基基团、1,2-二醇或1,3-二醇。
“丙烯酸酯/盐基团(acrylate group)”包括丙烯酸及其衍生物(例如甲基丙烯酸)的盐、酯和共轭碱。丙烯酸酯/盐离子具有分子式CH2＝CHCOO-。
“丙烯酰胺单体”是具有结构
Figure BDA0002851688770000091
的单体或其被取代的类似物(例如，甲基丙烯酰胺或N-异丙基丙烯酰胺)。包含丙烯酰胺基团和叠氮基基团的单体的实例是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺：
Figure BDA0002851688770000092
如本文使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基及类似基团。作为实例，名称“C1-4烷基”指示在烷基链中存在一个至四个碳原子，即该烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文使用的，“烯基”指的是包含一个或更多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子。示例性的烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及类似基团。
如本文使用的，“炔烃”或“炔基”指的是包含一个或更多个三键的直链或支链的烃链。炔基基团可以具有2个至20个碳原子。
如本文使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子。芳基基团的实例包括苯基、萘基、薁基以及蒽基。
如本文使用的，术语“附接”指的是两种事物共价地或非共价地(例如，通过氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用)彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价键或非共价键被附接至官能化的聚合物。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团指的是-N3。
如本文使用的，“结合区域”指的是基底上将与另一种材料结合的区，该另一种材料例如可以是间隔层、盖、另一种基底等、或其组合(例如，间隔层和盖)。在结合区域形成的结合可以是化学键(如上文描述的)，或者机械结合(例如，使用紧固件等)。
“叔丁氧基羰基基团”(Boc)指的是
Figure BDA0002851688770000101
基团。“丁氧基羰基氧基基团”指的是-OCO2tBu基团。
如本文使用的，“碳环基”意指在环体系骨架中仅包含碳原子的非芳香族环或非芳香族环体系。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式连接在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基以及环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子。碳环基环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基以及螺[4.4]壬基。
如本文使用的，术语“羧酸”或“羧基”指的是-COOH。
如本文使用的，“亚环烷基”意指经由两个附接点附接至分子的剩余部分的完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。
如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。实例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯基或降冰片烯。也如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。实例是环辛炔。另一个实例是双环壬炔。也如本文使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有至少一个三键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中在环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的，术语“沉积”指的是任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动的，并且导致表面性质的改变。通常，沉积可以使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术或类似技术来进行。一些具体的实例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如超声喷涂)、旋涂、浸泡涂覆或浸涂、刮刀涂覆、水坑分配(puddle dispensing)、流过涂覆(flow throughcoating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷或类似技术。
如本文使用的，术语“凹陷”指的是图案化支撑物中的离散凹形特征，其具有完全被图案化支撑物表面的间隙区域包围的表面开口。凹陷可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，作为实例包括圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地截取的凹陷的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、角形的等。作为实例，凹陷可以是井。也如本文使用的，“官能化的凹陷”指的是其中本文公开的聚合物和引物被附接的离散的凹形特征。
当提及项目的集合使用时，术语“每个(each)”意图识别集合中的单个项目，但不一定指的是集合中的每一个(every)项目。如果明确披露或上下文另外明确地规定，则可能发生例外。
如本文使用的，术语“流动池”意图意指容器，该容器具有其中反应可以被实施的腔室(即流动通道)、用于将试剂输送至腔室的入口、和用于从腔室去除试剂的出口。在一些实例中，腔室能够检测在腔室中发生的反应或信号。例如，腔室可以包括一个或更多个透明表面，允许对腔室中的阵列、光学标记的分子或类似物的光学检测。
如本文使用的，“流动通道”或“流动通道区域”可以是被限定在两个结合的部件之间的区，其可以选择性地接纳液体样品。在一些实例中，流动通道可以被限定在图案化支撑物和盖之间，并且因此可以与被限定在图案化支撑物中的一个或更多个凹陷流体连通。在其他实例中，流动通道可以被限定在非图案化支撑物和盖之间。
“芴甲氧羰基”基团(Fmoc)是一种碱不稳定的保护基团，具有结构
Figure BDA0002851688770000121
如本文使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧以及硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，在该体系中的每一个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5个-18个环成员。
如本文使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环或非芳香族环体系。杂环基可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式连接在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是环体系中的至少一个环不是芳香族的。在环体系中，杂原子可以存在于非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，组成环骨架的原子的数目，包括碳原子和杂原子)。在一些实例中，杂原子是O、N或S。
如本文使用的，术语“肼”或“肼基”指的是任选地被取代的-NHNH2基团。
如本文使用的，术语“腙”或“腙基”指的是
Figure BDA0002851688770000122
基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基以及5-10元杂环基，如本文定义的。
如本文使用的，“氢氧基”或“羟基”指的是-OH基团。
如本文使用的，术语“间隙区域”指的是支撑物中或表面上分隔凹陷的区。例如，间隙区域可以将阵列的一个特征与阵列的另一个特征分隔。彼此分隔的两个特征可以是离散的，即，彼此缺乏物理接触。在另一个实例中，间隙区域可以将特征的第一部分与特征的第二部分分隔。在许多实例中，间隙区域是连续的，而特征是离散的，例如，如对于在另外连续表面中限定的多于一个井的情况。由间隙区域提供的分隔可以是部分的或完全的分隔。间隙区域可以具有与在表面中限定的特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的特征可以具有涂层和引物的量或浓度，所述涂层和引物的量或浓度超过存在于间隙区域处的量或浓度。在一些实例中，涂层和引物可以不存在于间隙区域处。
如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中，糖是脱氧核糖，即缺少存在于核糖中的2’位处的羟基基团的糖。含氮杂环碱基(即核碱基)可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子结合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。
如本文使用的，“等离子体灰化”指的是通过氧等离子体从支撑物去除有机物质的过程。由等离子体灰化产生的产物可以用真空泵/系统来去除。等离子体灰化可以通过引入反应性羟基基团来活化支撑物。
本文提及的“杂聚物”或“杂聚物涂层”意图意指至少两种不同的重复亚单元(单体)的大分子，其中重复亚单元(单体)中的一种包含刺激响应性官能团。
如本文使用的，“引物”被定义为单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)，其用作用于DNA或RNA合成的起点。引物的5’末端可以被修饰以允许与官能化的聚合物层的偶联反应。引物长度可以是任何数目的碱基长的并且可以包括多种非天然的核苷酸。在实例中，引物是在从20个至40个碱基的范围内的短链。
如本文使用的，术语“硅烷”和“硅烷衍生物”指的是包含一个或更多个硅原子的有机化合物或无机化合物。无机硅烷化合物的实例是SiH4或卤化的SiH4，其中氢被一个或更多个卤素原子替代。有机硅烷化合物的实例是X-RB-Si(ORC)3，其中R-Si是有机连接基，并且其中X是官能团，诸如氨基、乙烯基、甲基丙烯酸酯/盐、环氧基、硫、烷基、烯基或炔基；RB是间隔基，例如-(CH2)n-，其中n是0至1000；RC选自氢、任选地被取代的烷基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的炔基、任选地被取代的碳环基、任选地被取代的芳基、任选地被取代的5-10元杂芳基以及任选地被取代的5-10元杂环基，如本文定义的。如本文使用的，术语“硅烷”和“硅烷衍生物”可以包括不同硅烷和/或硅烷衍生物化合物的混合物。
如本文使用的“间隔层”指的是将两种组分结合在一起的材料。在一些实例中，间隔层可以是有助于结合的辐射吸收材料，或者可以与有助于结合的辐射吸收材料接触。
如本文使用的“刺激响应性官能团”指的是聚合物中可以响应于刺激而改变其状态的原子和/或键的一部分。刺激响应性官能团可以是pH响应性的、温度响应性的、糖响应性的、亲核体响应性的或盐响应性的。每个刺激响应性官能团的具体实例将在下文进一步描述。
术语流动池“支撑物”或“基底”指的是可以在其上添加表面化学物质的支撑物或基底。术语“图案化基底”指的是凹陷被限定在其中或其上的支撑物。术语“非图案化基底”指的是大体上平面的支撑物。基底在本文中还可以被称为“支撑物”、“图案化支撑物”或“非图案化支撑物”。支撑物可以是晶片、面板(panel)、矩形片、管芯(die)或任何其他合适的配置。支撑物通常是刚性的，并且不溶于水性液体。支撑物对用于修饰凹陷的化学物质可以是惰性的。例如，支撑物对用于形成聚合物涂层、用于将引物附接至聚合物涂层等的化学物质可以是惰性的。合适的支撑物的实例包括环氧硅氧烷、玻璃和改性的或官能化的玻璃、多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)及其衍生物、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如来自Chemours的
Figure BDA0002851688770000141
)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如来自Zeon的
Figure BDA0002851688770000142
)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si3N4)、氧化硅(SiO2)、五氧化二钽(TaO5)或其他钽氧化物(TaOx)、氧化铪(HaO2)、碳、金属、无机玻璃或类似物。支撑物也可以是玻璃或硅或基于硅的聚合物，诸如POSS材料，任选地在表面处具有钽氧化物或另一种陶瓷氧化物的涂层。
如本文使用的术语“表面化学物质”指的是并入到流动池的通道中的化学和/或生物活性组分。本文公开的表面化学物质的实例包括被附接至支撑物的表面的至少一部分的聚合物涂层和被附接至聚合物涂层的至少一部分的引物。
“硫醇”官能团指的是-SH。
如本文使用的，术语“四嗪”和“四嗪基”指的是包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以是任选地被取代的。
如本文使用的“四唑”指的是包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可以是任选地被取代的。
本文公开的流动池的实例包括支撑物、附接至支撑物的聚合物和接枝至聚合物的引物。流动池的实例在图1F、图1H和图3D中示出，并且将在本文中进一步描述。现在将描述附接至流动池支撑物的聚合物的多种实例。
在整个说明书中对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的提及意指结合该实例描述的特定元素(例如，特征、结构和/或特性)包括在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在或可以不存在于其他实例中。另外，应理解，对于任何实例所描述的元素可以在多个实例中以任何合适的方式组合，除非上下文另外清楚地指示。
应理解，本文提供的范围包括所陈述的范围和在所陈述的范围内的任何值或子范围，如同这样的范围、值或子范围在本文中被明确地列举。例如，从约400nm至约1μm(1000nm)的范围应当被解释为不仅包括从约400nm至约1μm的明确列举的限制，而且还包括单个值，诸如约708nm、约945.5nm等和子范围，诸如从约425nm至约825nm、从约550nm至约940nm等。此外，当使用“约”和/或“大体上”来描述一个值时，它们意指涵盖所陈述的值的微小变化(多达+/-10％)。
本文描述的杂聚物包含刺激响应性官能团，该刺激响应性官能团当暴露于预定的刺激时能够经历修饰，其中修饰改变杂聚物的极性和/或构象。因此，本文公开的杂聚物的实例可以是可切换的。当暴露于特定的刺激时，可切换杂聚物可以从起始状态转变到第二切换的状态。切换的实例包括极性的改变，诸如疏水到亲水，增加亲水性；亲水到疏水，增加疏水性；中性到带电；带电到中性；阴离子到中性；阳离子到中性；中性到阴离子；中性到阳离子；以及中性到中性，具有增加的亲水性。切换的实例还包括构象改变，诸如膨胀、塌缩状态(collapsed state)到延伸状态(extended state)、延伸状态到塌缩状态(例如，具有反聚电解质行为)和线团-球体(coil-globule)形成。给定的刺激响应性基团可以赋予多于一种切换效应。在一些方面中，切换是不可逆的，并且在其他实例中，切换在不同的化学或热条件下是可逆的。
当可切换杂聚物被施加至流动池支撑物时，刺激响应性官能团表现出起始状态。在一些方面中，起始状态与流动池支撑物的疏水性质相容，并且该相容性简化流动池的制造和处理。例如，起始状态(例如疏水的)可以提高杂聚物对疏水性流动池支撑物的粘附性和涂层均匀性，而切换的状态可以与流动池用途诸如测序操作更相容。
因此，在一些方面中，切换的状态可以是在包括测序操作的一些应用中提供改进性能的溶液构象。在测序操作之前，本文公开的刺激响应性聚合物可以暴露于预定的刺激。当暴露于刺激时，由于预定刺激对刺激响应性官能团的影响，可切换杂聚物改变极性和/或构象。处于切换的状态的杂聚物可以提供低污染表面，低污染表面可以减少蛋白质的非特异性吸附，并且可以改进测序度量(例如，碱基或第一周期强度、质量评分、错误率等)。
普通技术人员将认识到，本文描述的任何杂聚物可以是包含以任何顺序或配置的两个或更多个重复单体单元的无规的、嵌段的、线性的和/或支化的共聚物，并且可以是线性的、交联的或支化的，或其组合。
在一些实例中，刺激响应性官能团是pH响应性官能团。在这样的方面中，可切换杂聚物是包含多于一种含有pH响应性官能团的单体的共聚物。多于一种单体可以各自具有相同的pH响应性官能团或响应于相同的pH条件的不同的pH响应性官能团。在一些方面中，杂聚物是具有多于一种丙烯酰胺单体的共聚物。可以使用单一类型的丙烯酰胺单体，或者可以使用两种或更多种不同的丙烯酰胺单体。
在一些方面中，在暴露于酸性或碱性pH条件时，pH响应性官能团转化为具有增加或减少的极性(例如，增加的亲水性或增加的疏水性)的取代基基团。在一些方面中，pH响应性官能团是中性的，并且在暴露于刺激时变成带电的。在一些方面中，pH响应性官能团是带电的，并且在暴露于刺激时变成中性的。在一些方面中，pH响应性官能团是中性的，并且在暴露于刺激时转化为不同的中性但更具极性的基团。
在一些方面中，pH响应性官能团是具有酸不稳定的保护基团的羟基(在暴露于酸性/低pH条件时切换为更亲水的游离羟基)、具有碱不稳定的保护基团的羟基(在暴露于碱性/高pH条件时切换为更亲水的游离羟基)、具有酸不稳定的保护基团的氨基(在暴露于酸性/低pH条件时切换为更亲水的游离氨基基团)、具有碱不稳定的保护基团的氨基(在暴露于碱性/高pH条件时切换为更亲水的游离氨基基团)、氨基基团(在酸性/低pH条件下切换为铵离子)、羧酸酯/盐(-CO2 -)基团(在暴露于酸性/低pH条件时切换为中性羧酸)、羧酸基团(在暴露于碱性/高pH条件时切换为带电且更亲水的羧酸酯/盐)、磺酸酯/盐(-SO3 -)基团(在暴露于酸性/低pH条件时切换为中性磺酸)或磺酸基团(在暴露于碱性/高pH条件时切换为带电且更亲水的磺酸酯/盐)。
示例性的可切换杂聚物包括以下结构的单体：
Figure BDA0002851688770000171
其中：
X是选自由以下组成的组的pH响应性官能团：-O-PG、-NH-PG、-NRaRb、-SO3H、-SO3 -、-CO2H和-CO2 -；
PG是酸不稳定或碱不稳定的保护基团(例如Boc、Fmoc或缩醛)；
Ra和Rb各自独立地是H或C1-4烷基；并且
每个Rz独立地是H或C1-4烷基。
在一些方面中，X是-O-Boc、-NHBoc、-NHFmoc、-NH2、-NHCH3或-N(CH3)2。在一些方面中，X是SO3H、-SO3 -、-CO2H或-CO2 -。在一些方面中，Ra和Rb两者均是甲基。在一些方面中，Rz是H或甲基。在一些方面中，单体具有以下结构：
Figure BDA0002851688770000181
因此，在一些方面中，pH响应性官能团是被保护为缩醛、半缩醛或缩酮的羟基、1,2-二醇或1,3-二醇(在暴露于酸性/低pH条件时切换为更具极性/亲水的二醇)，叔丁氧基羰基氨基基团，9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团，氨基基团，羧酸酯/盐(-CO2 -)基团，羧酸基团，磺酸酯/盐(-SO3 -)基团或磺酸基团。
叔丁氧基羰基氨基基团可以处于疏水(或不太亲水)状态，并且当暴露于低(酸性)pH(例如，具有小于7的pH)时，可以转变为亲水状态(例如，氨基基团)。叔丁氧基羰基氨基基团可以被附接至丙烯酰胺单体或丙烯酸酯/盐单体。含叔丁氧基羰基氨基基团的单体的实例包括N-(叔丁氧基羰基-氨基乙基)甲基丙烯酰胺、N-(叔丁氧基羰基-氨基丙基)甲基丙烯酰胺和(2-叔丁氧基羰基-氨基)乙基甲基丙烯酸酯。
9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团可以处于疏水(或不太亲水)状态，并且当暴露于低(酸性)pH(例如，具有小于7的pH)时，可以转变为亲水状态(例如，氨基基团)。9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团可以被附接至丙烯酰胺单体、或丙烯酸酯/盐单体或乙烯基单体。含9H-芴-9-基甲氧羰基基团的单体的实例包括：
Figure BDA0002851688770000182
氨基基团可以处于中性状态，并且当暴露于低(酸性)pH(例如，具有小于7的pH)时，可以转变为带电(且更亲水)的状态(阳离子)。例如，合成的聚合物中的氨基基团可以被质子化，这在聚合物骨架周围导致阳离子电荷。在合成的聚合物中，氨基基团可以被附接至丙烯酰胺单体、或丙烯酸酯/盐单体或乙烯基单体。含氨基基团的单体的实例包括甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙酯、N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺、N-[2-(N,N-二甲基氨基)乙基]甲基丙烯酰胺和N-[3-(N,N-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺。
当暴露于低(酸性)pH(例如，小于7的pH)时，缩醛基团可以转变为比其起始状态(羟基或二醇)更亲水的状态。缩醛基团可以被附接至叠氮化物官能化的透明质酸(HA-N3)。HA-N3在有机溶剂中具有有限的溶解度，并且因此在缩醛化反应之前，可以使用酸性离子交换树脂转化为其四丁基铵盐。缩醛化反应可以通过在室温使2-甲氧基丙烯和对甲苯磺酸吡啶鎓(pyridinium p-toluenesulfonate)与溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的HA-N3盐反应来进行。
在一些方面中，可切换杂聚物还包括含叠氮基的丙烯酰胺单体。在一些方面中，可切换杂聚物包括：
Figure BDA0002851688770000191
以及任选地
Figure BDA0002851688770000192
在一些方面中，可切换杂聚物包括结构：
Figure BDA0002851688770000201
其中每个Rz独立地是H或C1-4烷基。在一些实例中，X是-O-Boc、-NHBoc、-NHFmoc、-NH2、-NHCH3或-N(CH3)2。在一些实例中，X是-NHBoc。在一些方面中，X是SO3H、-SO3 -、-CO2H或-CO2 -。在一些方面中，Ra和Rb两者均是甲基。在一些方面中，每个Rz独立地是H或甲基。
在一些实例中，可切换杂聚物包括两个pH响应性缩醛官能团(诸如一个缩酮基团和一个半缩酮基团)和一个羧酸基团。示例性杂聚物具有以下结构：
Figure BDA0002851688770000202
其中n在从10至500的范围内。酸不稳定的缩醛基团保护叠氮基修饰的透明质酸(HA-N3)的极性右旋糖酐骨架上的多于一个醇，并且将杂聚物的特性从亲水改变为疏水。处于其更疏水的起始状态的杂聚物可能更容易处理和加工，允许杂聚物更有效地涂覆或粘附到本文公开的疏水性支撑物(例如降冰片烯官能化的玻璃或POSS基底)。
在一些实例中，刺激响应性官能团是温度响应性官能团。在这样的方面中，可切换杂聚物是包含多于一种含有温度响应性官能团的单体的共聚物。多于一种单体可以各自具有相同的温度响应性官能团或响应于相同的温度条件的不同的温度响应性官能团。在一些方面中，杂聚物是具有多于一种丙烯酰胺单体的共聚物。可以使用单一类型的丙烯酰胺单体，或者可以使用两种或更多种不同的丙烯酰胺单体。
温度响应性官能团是可以被转化成或多或少极性的官能团或由于温度变化引起聚合物构象改变的一种温度响应性官能团。例如，温度响应性基团包括热敏性羟基或氨基保护基团(诸如Boc或Fmoc基团)，其在杂聚物暴露于热时被去除(从中性起始状态切换到具有增加的亲水性的中性状态)。可以使用多种Boc和Fmoc保护的单体，包括丙烯酸单体。在另一个实例中，温度响应性官能团可以使聚合物在室温以中性且相对亲水的延伸的起始状态存在，并且然后在升高的温度(诸如高于32℃)将杂聚物切换到中性且相对疏水的塌缩状态。该其他实例是线团-球体切换，例如其可以由聚(N-异丙基丙烯酰胺)展示。应理解，接枝至该可切换杂聚物的引物可以稍微改变该行为。在一些方面中，该聚合物材料经历热的线团到球体的转变。在一些方面中，温度响应性官能团是可电离的热敏凝胶的聚合物的一部分。在一些方面中，包含温度响应性官能团的单体是N-取代的丙烯酰胺，诸如H2C＝C(H或甲基)-C(O)NRcRd，其中Rc是H，并且Rd是支链C3-6烷基。在一些方面中，包含温度响应性官能团的单体是N-异丙基丙烯酰胺，任选地在聚(N-异丙基丙烯酰胺)的嵌段中。
在实例中，杂聚物包括温度响应性官能团单体和丙烯酰胺单体。在一些实例中，丙烯酰胺单体选自由以下组成的组：叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体以及丙烯酰胺单体和叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体的组合，如上文所示。在一些方面中，可切换杂聚物还包括含叠氮基的丙烯酰胺单体。在一些方面中，可切换杂聚物包括：
Figure BDA0002851688770000221
以及任选地
Figure BDA0002851688770000222
在一些方面中，可切换杂聚物包括结构：
Figure BDA0002851688770000223
其中每个Rz独立地是H或C1-4烷基。
在另一个方面中，刺激响应性官能团是糖响应性官能团，其是与二醇试剂反应形成阴离子官能团的亲水性取代基基团。在一些方面中，二醇是有机二醇、或糖、或葡萄糖。在一些方面中，糖响应性官能团包括硼酸，诸如烷基硼酸或芳基硼酸。硼酸官能团可以处于电中性的起始状态(并且也可以是相对疏水的)，并且当暴露于糖溶液时，可以转变为带负电的(阴离子)状态(其也可以比电中性状态更亲水)。硼酸具有与糖反应形成硼酸酯的能力，硼酸酯由于水的流入而经历可逆的膨胀，这在测序操作期间可以是合意的。
硼酸官能团可以被附接至丙烯酰胺单体、或丙烯酸酯/盐单体或乙烯基单体。在实例中，包含糖响应性官能团的单体具有结构：
Figure BDA0002851688770000231
含硼酸基团的单体的实例包括3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。在一些方面中，可切换杂聚物还包括丙烯酰胺单体。在一些方面中，丙烯酰胺单体是含叠氮基的丙烯酰胺单体。在一些方面中，可切换杂聚物包括：
Figure BDA0002851688770000232
以及任选地
Figure BDA0002851688770000233
在一些方面中，杂聚物具有结构：
Figure BDA0002851688770000234
其中每个Rz独立地是H或C1-4烷基。
在一些实例中，刺激响应性官能团是亲核体响应性官能团。亲核体响应性官能团是一种易于被亲核体攻击以实现结构改变的基团，所述结构改变赋予如本文描述的极性和/或构象的改变。在一些方面中，可切换杂聚物是包含多于一种含有亲核体响应性官能团的单体的共聚物。多于一种单体可以各自具有相同的亲核体响应性官能团或响应于相同的亲核体的不同的亲核体响应性官能团。在一些方面中，杂聚物是包含亲核体响应性官能团的单体和一种或更多种丙烯酰胺单体的共聚物。可以使用单一类型的丙烯酰胺单体，或者可以使用两种或更多种不同的丙烯酰胺单体。在一些实例中，亲核体响应性官能团是环状磺酸酯(诸如磺内酯(sultone)环)或环状酸酐(诸如琥珀酸酐)，它们在暴露于亲核体时，在一些情况下在碱性(高pH)条件(诸如pH 9或更高)下，可以经历开环反应。
在一些方面中，亲核体响应性官能团具有以下结构：
Figure BDA0002851688770000241
其中(a)Y是SO2并且Y’是CH2；或者(b)Y和Y’两者均是C(O)。在其他方面中，亲核体响应性官能团是：
Figure BDA0002851688770000242
合适的亲核体包括伯烷基胺和烷基醇。磺内酯开环基团及其开环反应的实例如下：
Figure BDA0002851688770000243
其中M是H或单价阳离子(钠或钾阳离子)。磺内酯开环基团可以处于疏水(或不太亲水)状态，并且当暴露于高(碱性)pH时，可以经历开环反应并转变为(更)亲水状态。开环反应之后的官能团也可以是阴离子的，并且因此处于带电状态。
在一些方面中，包含亲核体响应性官能团的单体是：
Figure BDA0002851688770000244
在特定的实例中，单体是：
Figure BDA0002851688770000251
在一些方面中，亲核体响应性官能团可以被附接至丙烯酰胺单体、或丙烯酸酯/盐单体或乙烯基单体。在一些方面中，可切换杂聚物还包括丙烯酰胺单体。在一些实例中，丙烯酰胺单体是含叠氮基的丙烯酰胺单体。在一些方面中，可切换杂聚物包括：
Figure BDA0002851688770000252
以及任选地
Figure BDA0002851688770000253
在一些方面中，杂聚物具有结构：
Figure BDA0002851688770000254
其中每个Rz独立地是H或C1-4烷基。
在一些方面中，刺激响应性官能团是盐响应性官能团。在一些实例中，盐响应性官能团是表现出反聚电解质行为的两性离子官能团，其中当暴露于盐时，两性离子官能团从塌缩状态切换到延伸状态。盐响应性官能团是具有反聚电解质行为的两性离子官能团。如本文使用的“反聚电解质行为”意指当暴露于盐时，包含两性离子官能团的单体从塌缩状态切换到延伸状态(即，单体在盐水中比在纯水中具有更大的溶解度)。这样，盐响应性官能团可以处于塌缩状态(例如，其中聚合物链呈球体)，并且当暴露于盐溶液时，可以转变为延伸状态(即，其中聚合物链被延伸)。局部盐抗衡离子的影响改变了包含盐响应性官能团的聚合物链的构象。在一个实例中，包含两性离子官能团的单体选自由以下组成的组：N-(2-甲基丙烯酰氧基)乙基-N,N-二甲铵基丙磺酸酯和N-(3-甲基丙烯酰亚氨基)丙基-N,N-二甲基铵基丙磺酸酯。
在一些实例中，包含盐响应性官能团的单体具有结构：
Figure BDA0002851688770000261
其中A是O或NH，并且Rz是H或C1-4烷基。
在其他实例中，盐响应性官能团是季铵基团，诸如-NMe3 +。示例性单体是：
Figure BDA0002851688770000262
其中Rz是H或C1-4烷基。
当与阴离子对应物(存在于盐溶液中)结合时，这些带电物质可以表现出反聚电解质行为。合适的阴离子对应物的实例包括羧酸盐、磺酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐等。
盐响应性官能团可以被附接至丙烯酰胺单体、或丙烯酸酯/盐单体或乙烯基单体。在一些方面中，可切换杂聚物还包括丙烯酰胺单体。在一些实例中，丙烯酰胺单体是含叠氮基的丙烯酰胺单体。在一些方面中，可切换杂聚物包括：
Figure BDA0002851688770000271
以及任选地
Figure BDA0002851688770000272
在一些方面中，杂聚物具有结构：
Figure BDA0002851688770000273
其中每个Rz独立地是H或C1-4烷基。
在一个实例中，流动池包括支撑物和附接至支撑物的可切换杂聚物，其中刺激响应性官能团选自由以下组成的组：pH响应性官能团、温度响应性官能团、糖响应性官能团、亲核体响应性官能团和盐响应性官能团。刺激响应性官能团当暴露于预定的刺激时能够经历修饰，其中修饰改变可切换杂聚物的极性和/或构象。
在一些方面中，流动池支撑物是包括由间隙区域分隔的凹陷的图案化基底，并且其中杂聚物存在于凹陷内。在其他方面中，支撑物是具有流动通道区域和结合区域的非图案化基底，并且其中杂聚物被附接至流动通道区域。
在一些方面中，流动池还包括接枝至可切换杂聚物的引物。
在流动池的该方面的实例中，支撑物的表面用硅烷或硅烷衍生物官能化，并且杂聚物被附接至硅烷或硅烷衍生物。在一些实例中，硅烷或硅烷衍生物包括能够与官能化的聚合物层的官能团反应的不饱和部分。如本文使用的，术语“不饱和部分”指的是包含至少一个双键或一个三键的化学基团，包括环烯烃、环炔烃、杂环烯烃、杂环炔烃或其任选地被取代的变体。不饱和部分可以是单价的或二价的。当不饱和部分是单价的时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与环烯基、环炔基、杂环烯基和杂环炔基可互换地使用。当不饱和部分是二价的时，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃和杂环炔烃分别与亚环烯基、亚环炔基、杂环亚烯基和杂环亚炔基可互换地使用。
不饱和部分可以直接地共价附接至硅烷或硅烷衍生物的硅原子，或经由连接基间接地附接。合适的连接基的实例包括任选地被取代的亚烷基(例如，二价的饱和脂肪族基团(诸如亚乙基)，被认为由烯烃通过打开双键衍生，或由烷烃通过从不同碳原子去除两个氢原子衍生)、被取代的聚乙二醇或类似物。
本文公开的杂聚物由至少两种不同的单体组成。单体中的一种包含刺激响应性官能团。在一些方面中，单体中的另一种包含附接基团，该附接基团可以与流动池支撑物和/或引物反应，以将杂聚物附接至其。该另一个附接基团可能也能够附接至支撑物，或者另一个单体可以包括能够附接至支撑物的第二(不同的)附接基团。应理解，本文公开的聚合物还可以包括一种或更多种不干扰刺激响应性官能团和附接基团的各自的功能的其他单体。
在本文公开的聚合物的任何实例中，附接基团选自由以下组成的组：叠氮基、氨基、烯基(包括环烯基基团或杂环烯基基团)、炔基(包括环炔基基团或杂环炔基基团)、醛、腙、肼、羧基、羟基、四唑、四嗪和硫醇。
附接基团可能能够与附接至引物的5’末端的官能团反应。例如，双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)封端的引物可以经由应变促进的无催化剂点击化学被聚合物的叠氮化物附接基团捕获。对于另一个实例，炔烃封端的引物可以经由铜催化的点击化学被聚合物的叠氮化物附接基团捕获。对于还另一个实例，降冰片烯封端的引物可以与聚合物的四嗪附接基团经历无催化剂环应变促进的点击反应。应理解，其他偶联化学反应可以用于将引物附接至附接基团，所述偶联化学反应包括例如Staudinger连接、应变促进的反应和光点击环加成。
可以使用的封端的引物的其他实例包括四嗪封端的引物、叠氮基封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物、硫醇封端的引物、醛封端的引物、肼封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。
在实例中，附接基团被附接至丙烯酰胺单体。包含附接基团的单体的一个实例是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺。
在方法的实例中，将聚合物涂层施加至流动池涉及流过沉积、化学气相沉积、浸涂、浸泡涂覆、旋涂、喷涂、水坑分配、超声喷涂、刮刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷或喷墨印刷。
在方法的实例中，流动池支撑物是包括由间隙区域分隔的凹陷的图案化的流动池支撑物，并且方法还包括：在施加聚合物涂层之前，将硅烷或硅烷衍生物附接至图案化的流动池支撑物的表面，从而形成硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区域；在硅烷化的凹陷中和在硅烷化的间隙区域上施加聚合物涂层；以及从硅烷化的间隙区域去除(例如抛光)聚合物涂层。
在方法的实例中，将聚合物涂层暴露于预定的刺激涉及以下中的一种：加热聚合物涂层；将聚合物涂层暴露于预定pH的溶液；将聚合物涂层暴露于亲核体；将聚合物涂层暴露于包含糖的溶液；或将聚合物涂层暴露于盐溶液。
在又另外的方面中，一种方法包括将流动池支撑物的至少一部分上的聚合物涂层暴露于预定的刺激，从而引起聚合物涂层的刺激响应性官能团i)从当前状态切换到比当前状态更亲水的状态，或ii)从中性状态切换到带电状态，或iii)从塌缩状态切换到延伸状态；以及当聚合物涂层处于更亲水的状态、带电状态或延伸状态时，使用流动池支撑物进行测序操作。
在一些方面中，是一种用于制造流动池的方法。该方法包括将可切换杂聚物施加至流动池支撑物的至少一部分。
将参考图1A至图1F，以及结合图1G和图1H的图1A至图1D描述聚合物(聚合物涂层)和引物(即表面化学物质)向图案化基底的添加，并且将参考图2A至图2D描述表面化学物质向非图案化基底的添加。
图1A是图案化支撑物12的实例的横截面图。图案化支撑物12可以是图案化晶片或图案化管芯或任何其他图案化支撑物(例如，面板、矩形片等)。可以使用本文描述的支撑物12的任何实例。图案化晶片可以用于形成若干流动池，并且图案化管芯可以用于形成单个流动池。在实例中，支撑物可以具有在从约2mm至约300mm的范围内的直径，或者具有最大尺寸多达约10英尺(～3米)的矩形片或面板。在实例中，支撑物晶片具有在从约200mm至约300mm的范围内的直径。在另一个实例中，支撑物管芯具有在从约0.1mm至约10mm的范围内的宽度。虽然已经提供了示例性的尺寸，但是应理解，可以使用具有任何合适的尺寸的支撑物/基底。对于另一个实例，可以使用为矩形支撑物的面板，其具有比300mm圆形晶片更大的表面积。
图案化支撑物12包括限定在支撑物12的暴露层或表面上或者支撑物12的暴露层或表面中的凹陷14，以及分隔相邻凹陷14的间隙区域16。在本文公开的实例中，凹陷14被表面化学物质(例如，20、22)变成官能化的，而间隙区域16可以用于结合，但其上将不存在引物(在图1E、图1F和图1H中示出)。
凹陷14可以使用多种技术在支撑物12中或支撑物12上制造，所述多种技术包括例如光刻术、纳米压印光刻术、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于支撑物12的组成和形状。
可以设想凹陷14的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在实例中，凹陷14被设置成六边形网格用于紧密充填和改进的密度。其他布局可以包括，例如直线(即矩形)布局、三角形布局等等。在一些实例中，布局或图案可以是在行和列中的凹陷14的x-y格式。在一些其他实例中，布局或图案可以是凹陷14和/或间隙区域16的重复布置。在还其他实例中，布局或图案可以是凹陷14和/或间隙区域16的随机布置。图案可以包括斑点、垫、井、柱、条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。
布局或图案可以相对于在所限定的区中的凹陷14的密度(即，凹陷14的数目)来表征。例如，凹陷14可以以每mm2约200万的密度存在。密度可以被调节到不同的密度，包括例如每mm2至少约100、每mm2约1,000、每mm2约10万、每mm2约100万、每mm2约200万、每mm2约500万、每mm2约1000万、每mm2约5000万或更大的密度。可选择地或另外地，密度可以被调节为每mm2不大于约5000万、每mm2约1000万、每mm2约500万、每mm2约200万、每mm2约100万、每mm2约10万、每mm2约1,000、每mm2约100或更小。还应理解，支撑物12上的凹陷14的密度可以在选自上文的范围的较低值之一和较高值之一之间。作为实例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔开小于约100nm的凹陷14，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔开约400nm至约1μm的凹陷14，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔开大于约1μm的凹陷14。虽然已经提供了示例性密度，但是应理解，可以使用具有任何合适的密度的基底。
布局或图案可以也或可选择地从平均间距、即从凹陷14的中心到相邻间隙区域16的中心的间隔(中心到中心的间隔)方面来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均间距的变化的系数小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下，变化的系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小。位点16的特定图案的平均间距可以在选自上文的范围的较低值之一和较高值之一之间。在实例中，凹陷14具有约1.5μm的间距(中心到中心的间隔)。虽然已经提供了示例性的平均间距值，但是应理解，也可以使用其他平均间距值。
在图1A至图1H中示出的实例中，凹陷14是井14’，并且因此图案化支撑物12在其表面中包括井14’的阵列。井14’可以是微井或纳米井。每个井14’的尺寸可以通过其体积、井开口面积、深度和/或直径来表征。
每个井14’可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应对流动池的下游使用所预期的吞吐量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10-3μm3、约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3、约100μm3或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×104μm3、约1×103μm3、约100μm3、约10μm3、约1μm3、约0.1μm3或更小。应理解，官能化的涂层可以填充井14’的体积的全部或部分。单独的井14’中涂层的体积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
可以基于与上文关于井体积阐述的标准相似的标准来选择由表面上的每个井开口占据的面积。例如，用于表面上的每个井开口的面积可以是至少约1×10-3μm2、约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、约10μm2、约100μm2或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×103μm2、约100μm3、约10μm2、约1μm2、约0.1μm2、约1×10-2μm2或更小。由每个井开口占据的面积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
每个井14’的深度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。每个井14’的深度可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
在一些情况下，每个井14’的直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小(例如，约50nm)。每个井14’的直径可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
图案化支撑物12可以暴露于一系列过程，以便在凹陷14中添加表面化学物质20、22。
虽然未示出，但是应理解，图案化支撑物12可以暴露于等离子体灰化，以便清洁和活化表面。例如，等离子体灰化过程可以去除有机材料并引入表面羟基基团。其他合适的清洁工艺可以用于部分地根据支撑物12的类型来清洁支撑物12。例如，化学清洁可以用氧化剂或苛性碱溶液进行。
图案化支撑物12(在图1A中示出)然后可以暴露于将准备表面用于本文公开的刺激响应性聚合物的沉积以形成聚合物涂层20的过程(图1C)。在实例中，图案化支撑物12可以暴露于硅烷化，这将硅烷或硅烷衍生物18(图1B)附接至图案化的支撑物表面。硅烷化跨过表面，包括在凹陷14、14’中(例如，在底表面上和沿着侧壁)和在间隙区域16上，引入硅烷或硅烷衍生物18。在一些方面中，硅烷或硅烷衍生物被选择性地仅引入到图案化基底的凹陷或非图案化基底的微位置(它们彼此隔离)。
硅烷化可以使用任何硅烷或硅烷衍生物18来完成。硅烷或硅烷衍生物18的选择可以部分地取决于用于形成聚合物涂层20(在图1C中示出)的聚合物，因为在硅烷或硅烷衍生物18和聚合物涂层20之间形成共价键可能是合意的。用于将硅烷或硅烷衍生物18附接至支撑物12的方法可以取决于所使用的硅烷或硅烷衍生物18而变化。本文中阐述了若干实例。
在实例中，硅烷或硅烷衍生物18是(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)(即X-RB-Si(ORC)3，其中X是氨基，RB是-(CH2)3-，并且RC是乙基或甲基)。在该实例中，支撑物12的表面可以用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)或(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)预处理，以将硅共价地连接至表面上的一个或更多个氧原子(而不意图通过机制来保持，每个硅可以结合至一个、两个或三个氧原子)。该化学地处理的表面被烘烤以形成胺基团单层。然后胺基团与磺基HSAB反应以形成叠氮基衍生物。在21℃用1J/cm2至30J/cm2的能量的UV活化产生活性氮烯物质，其可以容易地经历与本文公开的聚合物的多种插入反应。
也可以使用其他硅烷化方法。合适的硅烷化方法的实例包括气相沉积、YES方法、旋涂或其他沉积方法。本文描述了可以用于使支撑物12硅烷化的方法和材料的一些实例，但是应理解，也可以使用其他方法和材料。
在利用YES CVD烘箱的实例中，图案化支撑物12被放置在CVD烘箱中。腔室可以被通风，并且然后硅烷化循环开始。在循环期间，硅烷或硅烷衍生物容器可以被保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约120℃)，硅烷或硅烷衍生物蒸气管线被保持在合适的温度(例如，对于降冰片烯硅烷约125℃)，并且真空管线被保持在合适的温度(例如，约145℃)。
在另一个实例中，硅烷或硅烷衍生物18(例如液体降冰片烯硅烷)可以被沉积在玻璃瓶内，并且放置在带有图案化支撑物12的玻璃真空干燥器内。然后可以将干燥器抽空到在从约15mTorr至约30mTorr的范围内的压力，并且放置在在从约60℃至约125℃的范围内的温度的烘箱内。允许硅烷化继续进行，并且然后将干燥器从烘箱中移除、冷却并在空气中通风。
气相沉积、YES方法和/或真空干燥器可以与多种硅烷或硅烷衍生物18一起使用，所述多种硅烷或硅烷衍生物18诸如包括本文公开的不饱和部分的实例的那些硅烷或硅烷衍生物18。作为实例，当硅烷或硅烷衍生物18包括环烯烃不饱和部分诸如降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包含氧或氮代替碳原子之一的(杂)降冰片烯)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯以及双环[4.2.1]壬-1-烯时，可以使用这些方法。这些环烯烃中的任一种可以例如用R基团诸如氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基(heteroalicyclyl)、芳烷基或(杂脂环基)烷基取代。降冰片烯衍生物的实例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。作为其他实例，当硅烷或硅烷衍生物18包括炔烃或环炔烃不饱和部分诸如环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔或双环[6.1.0]壬-3-炔)时，可以使用这些方法。这些环炔烃可以用本文描述的任何R基团取代。
如图1B中示出的，硅烷或硅烷衍生物18的附接形成硅烷化的图案化支撑物，包括硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区域(它们是被处理的凹陷和被处理的间隙区域的一个实例)。
硅烷化的图案化支撑物然后可以暴露于将在硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区域上形成聚合物涂层20的过程。
在施加聚合物涂层20之前，方法的一些实例可以涉及合成待被沉积以形成聚合物涂层20的杂聚物。合成可以涉及使含刺激响应性官能团的单体与选自由以下组成的组的单体共聚：叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体以及丙烯酰胺单体和叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体的组合。本文描述的pH响应性单体、温度响应性单体、糖响应性单体、亲核体响应性单体或盐响应性单体中的任一种可以用于形成杂聚物。可以使用若干方法来制备本文公开的聚合物材料。作为几个实例，所使用的聚合方法可以是自由基聚合、受控自由基聚合、非自由基方法或另一种合适的方法。
如本文描述的，聚合物涂层20的实例包括本文公开的任何刺激响应性聚合物，其包括刺激响应性官能团的任何实例和附接基团的任何实例。刺激响应性聚合物可以存在于混合物中或并入到混合物中。在实例中，混合物包括乙醇和水的混合物中的刺激响应性聚合物。聚合物涂层20可以使用任何合适的技术在硅烷化的图案化支撑物12的表面上形成(即，在硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区域上形成)。刺激响应性聚合物可以使用化学气相沉积(CVD)、或浸渍或浸涂、浸泡涂覆、旋涂、喷涂或超声喷涂、水坑分配、刮刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷或喷墨印刷，或经由其他合适的技术被沉积在图案化支撑物12的表面上。聚合物涂层20在图1C中示出。
浸泡涂覆可以涉及将图案化和硅烷化的支撑物浸入一系列温度控制的浴中。浴也可以是流量控制的和/或覆盖有氮气覆盖物(nitrogen blanket)。浴可以包含聚合物混合物。在整个多个浴中，刺激响应性聚合物将附接以在硅烷化的凹陷中和在间隙区域上形成聚合物涂层20。在实例中，图案化和硅烷化的支撑物将被引入到包含聚合物混合物的第一浴中，在该第一浴中发生反应以附接聚合物，并且然后图案化、硅烷化和聚合物涂覆的支撑物将被移动到另外的浴用于洗涤。图案化支撑物可以用机器臂或手动地从一个浴移动到另一个浴。干燥系统也可以用于浸泡涂覆中。
喷涂可以通过将聚合物混合物直接喷雾到图案化和硅烷化的支撑物上来完成。喷涂的支撑物可以被孵育持续足以附接聚合物的时间。在孵育之后，任何未附接的聚合物混合物可以使用例如旋涂机或通过在本文描述的浴或浸泡罐中声处理来稀释和去除。
水坑分配可以根据池和旋出方法来进行，并且因此可以用旋涂机完成。聚合物混合物可以(手动地或经由自动工艺)施加至图案化和硅烷化的支撑物。施加的聚合物混合物可以被施加至图案化和硅烷化的支撑物的整个表面或散布跨过整个表面。聚合物涂覆的图案化支撑物可以被孵育持续足以附接聚合物的时间。在孵育之后，任何未附接的聚合物混合物可以使用例如旋涂机或通过在本文描述的浴或浸泡罐中声处理来稀释和去除。
将聚合物涂层20附接至硅烷化的凹陷和硅烷化的间隙区域(即18)可以通过共价结合。将聚合物涂层20共价连接至硅烷化的凹陷对在最终形成的流动池的整个寿命中在多种使用期间将聚合物涂层20保持在凹陷14、14’中是有帮助的。以下是在硅烷或硅烷衍生物18和聚合物涂层20之间可以发生的反应的一些实例。
当硅烷或硅烷衍生物18包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)经历与刺激响应性聚合物的叠氮化物/叠氮基基团的1,3-偶极环加成反应；ii)经历与附接至刺激响应性聚合物的四嗪基团的偶联反应；iii)经历与附接至刺激响应性聚合物的腙基团的环加成反应；iv)经历与附接至刺激响应性聚合物的四唑基团的光点击反应；或者v)经历与附接至刺激响应性聚合物的腈氧化物基团的环加成。
当硅烷或硅烷衍生物18包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)经历与刺激响应性聚合物的叠氮化物/叠氮基的应变促进的叠氮化物-炔烃1,3-环加成(SPAAC)反应，或者ii)经历与附接至刺激响应性聚合物的腈氧化物基团的应变促进的炔烃-腈氧化物环加成反应。
当硅烷或硅烷衍生物18包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于在双环环体系中的应变，双环壬炔可以经历与附接至刺激响应性聚合物的叠氮化物或腈氧化物的类似的SPAAC炔烃环加成。
虽然未示出，但是应理解，在方法的一些实例中，图案化支撑物12可以不暴露于硅烷化。相反，图案化支撑物12可以暴露于等离子体灰化，并且然后聚合物涂层20可以直接旋涂(或以其他方式沉积)在等离子体灰化的图案化支撑物12上。在该实例中，等离子体灰化可以产生表面活化剂(例如，-OH基团，如羟基或羧基)，其可以将聚合物涂层20粘附到图案化支撑物12。在这些实例中，可以选择聚合物涂层20的其他官能团，使得它与通过等离子体灰化产生的表面基团反应。例如，聚合物涂层20的其他官能团可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)。
在被涂覆后，刺激响应性聚合物也可以暴露于固化工艺，以跨过整个图案化基底(即，在凹陷14和间隙区域16上)形成聚合物涂层20。在实例中，固化刺激响应性聚合物可以在从室温(例如，约25℃)至约60℃的范围内的温度进行持续从约5分钟至约2小时的范围内的时间。
硅烷化和涂覆的图案化基底(在图1C中示出)可以暴露于清洁工艺。该工艺可以利用水浴和声处理。水浴可以被保持在从约22℃至约45℃的范围内的相对低的温度。在另一个实例中，水浴温度在从约25℃至约30℃的范围内。
然后，如果需要，将硅烷化和涂覆的图案化支撑物暴露于抛光，以从硅烷化的间隙区域中去除聚合物涂层20的一部分。硅烷化、涂覆和抛光的图案化基底在图1D中示出。硅烷或硅烷衍生物18的邻近间隙区域16的部分可以作为抛光的结果被去除或者可以不作为抛光的结果被去除。这样，在图1D至图1H中，硅烷或硅烷衍生物18的邻近间隙区域16的部分以虚线示出，因为它们在抛光后可能至少部分地保留，或者它们在抛光后可能被去除。当这些硅烷化的部分被完全去除时，应理解，下面的支撑物12被暴露。
抛光工艺可以用温和的化学浆料(包括，例如，研磨剂、缓冲液、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂)来进行，该温和的化学浆料可以从间隙区域16去除薄的聚合物涂层20和在一些情况中硅烷或硅烷衍生物18的至少一部分，而不有害地影响在这些区域处的下面的支撑物12。可选择地，抛光可以用不包含研磨颗粒的溶液来进行。
化学浆料可以用于化学机械抛光系统中以抛光图1C中示出的硅烷化和涂覆的图案化支撑物的表面。抛光头/垫或其他抛光工具能够从间隙区域16抛光聚合物涂层20，同时将聚合物涂层20留在凹陷14、14’中，并且使下面的支撑物12至少大体上完整。作为实例，抛光头可以是Strasbaugh ViPRR II抛光头。
如上文提及的，抛光可以用抛光垫和不含任何研磨剂的溶液来进行。例如，抛光垫可以与不含研磨颗粒的溶液(即不包含研磨颗粒的溶液)一起使用。
抛光从间隙区域16去除聚合物涂层20的部分(以及在一些情况下硅烷或硅烷衍生物18的至少一部分)，并且将聚合物涂层20的部分留在硅烷化的凹陷中，如图1D中示出的。还如上文提及的，在抛光完成之后，间隙区域16可以保持硅烷化。换句话说，在抛光之后，硅烷化的间隙区域可以保持完整。可选择地(如由18的虚线部分所指示的)，作为抛光的结果，硅烷或硅烷衍生物18可以从间隙区域16去除。
虽然未示出，但是应理解，硅烷化、涂覆和抛光的图案化支撑物(在图1D中示出)可以暴露于清洁工艺。该工艺可以利用水浴和声处理。水浴可以被保持在从约22℃至约30℃的范围内的相对低的温度。硅烷化、涂覆和抛光的图案化基底也可以被旋转干燥，或经由另一种合适的技术被干燥。
然后，图1D中示出的硅烷化、涂覆和抛光的图案化支撑物可以暴露于产生流动池10的图1E和图1F中示出的工艺，或者暴露于产生流动池10’的图1G和图1H中示出的工艺。在图1E和图1F中，在盖26被结合至图案化的流动池支撑物12之前，引物22被接枝。在图1G和图1H中，在引物22被接枝之前，盖26被结合至图案化的流动池支撑物12。
在图1E中，进行接枝工艺，以便将引物22接枝至凹陷14、14’中的聚合物涂层20。引物22可以是包含炔烃官能团的任何正向扩增引物或反向扩增引物。合适的引物的具体实例包括P5引物和/或P7引物，它们被用于在由Illumina Inc.出售的商业流动池的表面用于在HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NEXTSEQTM、NEXTSEQDXTM、NOVASEQTM、GENOME ANALYZERTM、ISEQTM和其他仪器平台上测序。
在该实例中，接枝可以通过流过沉积(例如，使用临时结合的盖)、浸泡涂覆、喷涂、水坑分配来完成，或者通过将引物20附接至至少一些凹陷14、14’中的官能化的聚合物层20的另一种合适的方法来完成。这些示例性技术中的每一种可以利用引物溶液或混合物，其可以包含引物、水、缓冲液和催化剂，并且可以如本文描述的进行。
浸泡涂覆可以涉及将图案化支撑物(在其凹陷14中具有聚合物涂层20)浸入一系列温度控制的浴中。浴也可以是流量控制的和/或覆盖有氮气覆盖物。浴可以包含引物溶液或混合物。在整个多个浴中，引物22将附接至至少一些凹陷14中的聚合物涂层20的附接基团。在实例中，涂覆和抛光的图案化支撑物将被引入到包含引物溶液或混合物的第一浴中，在该第一浴中反应发生以附接引物，并且然后图案化基底将被移动到另外的浴用于洗涤。图案化基底可以用机器臂或手动地从一个浴移动到另一个浴。干燥系统也可以用于浸泡涂覆中。
喷涂可以通过将引物溶液或混合物直接喷雾到涂覆和抛光的图案化支撑物上来完成。喷涂的晶片可以在从约0℃至约70℃的范围内的温度被孵育持续在从约4分钟至约60分钟的范围内的时间。在孵育之后，引物溶液或混合物可以使用例如旋涂机来稀释和去除。
水坑分配可以根据池和旋出方法来进行，并且因此可以用旋涂机完成。引物溶液或混合物可以(手动地或经由自动工艺)施加至涂覆和抛光的图案化支撑物。施加的引物溶液或混合物可以被施加至涂覆和抛光的图案化支撑物的整个表面或散布跨过整个表面。引物涂覆的图案化基底可以在从约0℃至约80℃的范围内的温度被孵育持续在从约2分钟至约60分钟的范围内的时间。在孵育之后，引物溶液或混合物可以使用例如旋涂机来稀释和去除。
如图1F中描绘的，盖26然后可以被结合至支撑物12的结合区域25。当图案化的流动池支撑物12是晶片时，盖26的不同区可以至少部分地限定使用晶片形成的相应的流动通道30。当图案化的流动池支撑物12是管芯时，盖26可以限定所形成的一个或更多个流动通道30。
盖26可以是对激发光透明的任何材料，激发光指向凹陷14中的表面化学物质20、22。作为实例，盖26可以是玻璃(例如硼硅酸盐、熔融二氧化硅等)、塑料或类似物。合适的硼硅酸盐玻璃的可商购的实例是从Schott North America,Inc.可获得的D
Figure BDA0002851688770000401
合适的塑料材料，也就是环烯烃聚合物的可商购的实例是从Zeon Chemicals L.P.可获得的
Figure BDA0002851688770000402
产品。
在一些实例中，盖26可以与侧壁29一体地形成，侧壁29对应于结合区域25的形状并且将被结合至结合区域25。例如，凹槽(recess)可以被蚀刻到透明块中，以形成大体上平面的(例如顶部)部分27和从大体上平面的部分27延伸的侧壁29。当蚀刻的块被安装到图案化基底12的结合区域时，凹槽可以变成流动通道30。
在其他实例中，侧壁29和盖26可以是彼此耦接的单独部件。例如，盖26可以是大体上矩形的块，其具有至少大体上平面的外表面和至少大体上平面的内表面，所述内表面限定流动通道30的一部分(例如，顶部部分)(一旦结合至图案化支撑物12)。该块可以被安装到(例如，结合至)侧壁29上，该侧壁29结合至图案化的流动池基底12的结合区域25并且形成流动通道30的侧壁。在该实例中，侧壁29可以包括在本文中关于间隔层(下文描述)阐述的任何材料。
盖26可以使用任何合适的技术诸如激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子体活化结合、玻璃料结合或本领域已知的其他方法来结合至图案化的流动池支撑物12的结合区域25。在实例中，间隔层28可以用于将盖26结合至结合区域25。间隔层28可以是将图案化基底12的至少一些间隙区域16(例如，结合区域25)和盖26密封在一起的任何材料。
在一个实例中，间隔层28可以是吸收在由盖26和/或图案化支撑物12透射的波长处的辐射的辐射吸收材料。所吸收的能量进而在间隔层28和盖26之间以及在间隔层28和图案化基底12之间形成结合。该辐射吸收材料的实例是在约1064nm处吸收的来自DuPont(USA)的黑色
Figure BDA0002851688770000403
(含炭黑的聚酰亚胺)。应理解，聚酰亚胺可以在不添加炭黑的情况下使用，除了波长必须被改变为由天然聚酰亚胺材料显著吸收的波长(例如，480nm)。作为另一个实例，当用在532nm处的光照射时，聚酰亚胺CEN JP可以被结合。当间隔层28是辐射吸收材料时，间隔层28可以被定位在盖26和图案化支撑物12之间的界面处，使得间隔层28接触期望的结合区域25。可以施加压缩(例如，约100PSI的压力)，同时将合适波长的激光能量施加至界面(即，辐射吸收材料被照射)。激光能量可以从顶部和底部两者施加至界面，以便实现合适的结合。
在另一个实例中，间隔层28可以包括与其接触的辐射吸收材料。辐射吸收材料可以被施加在间隔层28和盖26之间的界面处以及在间隔层28和图案化的流动池支撑物12之间的界面处。作为实例，间隔层28可以是聚酰亚胺，并且单独的辐射吸收材料可以是炭黑。在该实例中，单独的辐射吸收材料吸收激光能量，该激光能量在间隔层28和盖26之间以及间隔层28和图案化支撑物12之间形成结合。在该实例中，可以在相应的界面处施加压缩，同时将在合适的波长处的激光能量施加至界面(即辐射吸收材料被照射)。
当图案化的流动池支撑物12是晶片时，间隔层28和(盖26的或连接至盖26的)侧壁29可以物理地将一个流动通道30与相邻的流动通道30分隔开，并且可以位于晶片的周边处。当图案化支撑物12是管芯并且正在形成的流动池10将包括单个流动通道30或泳道(lane)时，间隔层28和(盖26的或连接至盖26的)侧壁29可以位于管芯的周边处以限定流动通道30并且密封流动池10。当图案化支撑物12是管芯并且正在形成的流动池10将包括多个隔离的流动通道30(例如，八个流动通道/泳道或四个流动通道/泳道)时，间隔层28和(盖26的或连接至盖26的)侧壁29可以物理地将一个流动通道/泳道30与相邻的流动通道/泳道30分隔开，并且可以位于管芯的周边处。然而，应理解，取决于实施方式，间隔层28和侧壁29可以位于任何期望的区域中。
当图案化支撑物12是管芯时，组装流动池10可以涉及盖26的结合。当图案化支撑物12是晶片时，组装流动池10可以涉及另外的加工，诸如切割，在盖26被结合之后。在一个实例中，盖26可以被结合至图案化晶片，并且切割形成单独的流动池10。如本文提及的，在晶片上，侧壁29可以物理地将一个流动通道30与相邻的流动通道30分隔开，并且因此切割可以通过至少一些侧壁29发生，使得每个单独的流动池10包括期望数目的流动通道30，每个流动通道30具有围绕其周边的原始侧壁29的一部分。在另一个实例中，图案化晶片可以被切割以形成无盖的管芯，该无盖的管芯可以具有结合至其的相应盖26以形成单独的流动池10。
在图1F中示出的示例性流动池10中，盖26包括与侧壁29一体地形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28结合至图案化基底12的结合区域25。
盖26和图案化的流动池基底12一起限定流动通道30，该流动通道30与凹陷14、14’选择性地流体连通。流动通道30可以用于例如选择性地将反应组分或反应物引入到表面化学物质20、22，以便在凹陷14、14’中/凹陷14、14’处引发指定的反应。
在进行测序操作之前，流动池10可以暴露于聚合物涂层20的预定刺激，以便将聚合物涂层20从当前状态转变为更亲水的状态(例如，从疏水状态转变为亲水状态)、从中性状态转变为带电状态、和/或从塌缩状态转变为延伸状态。所使用的预定刺激将取决于聚合物涂层20及其包含的刺激响应性官能团。将聚合物涂层20暴露于预定的刺激可以涉及加热聚合物涂层20；将聚合物涂层20暴露于预定pH的溶液；将聚合物涂层20暴露于包含糖的溶液；将聚合物涂层20暴露于亲核体；或将聚合物涂层20暴露于盐溶液。当盖26被附接时，将聚合物涂层20暴露于任何溶液可以通过流过过程(flow through process)来完成。例如，碱性或酸性溶液、糖溶液(例如，葡萄糖)或盐溶液可以通过输入端口被引入到流动池通道30中，允许孵育持续足以发生期望的性质改变的时间，并且然后通过输出端口从通道30去除。在实例中，孵育时间可以从几秒到若干分钟。当刺激响应性官能团是热响应性的时，可以加热整个流动池10，或者可以使用流过过程将加热的溶液暴露于聚合物涂层20。
预定的刺激将使聚合物涂层20与随后进行的测序操作的条件更相容。
预定pH的溶液的实例可以包括碱性溶液，诸如0.1M NaOH、TRIS-HCL缓冲液或碳酸盐缓冲液，或酸性溶液，诸如柠檬酸盐缓冲液(pH6)或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液。糖溶液的实例包括具有在从约1mM至约100mM的范围内的浓度的葡萄糖溶液。盐溶液的实例包括盐水-柠檬酸钠缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。
现在参考图1G和图1H，方法的另一个实例包括在引物22被接枝之前，将盖26结合至图案化的流动池支撑物12。
如图1G中示出的，聚合物涂层20已经如图1D中描述的被施加(例如，沉积和抛光)。至少一些抛光的间隙区域16可以限定结合区域25，并且盖26可以被结合至结合区域25。盖26可以是任何材料，并且可以具有本文描述的任何配置。盖26可以经由本文描述的任何技术被结合至结合区域25。
在图1G中示出的实例中，盖26包括与侧壁29一体地形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28被结合至图案化基底12的结合区域25。在盖26被结合之后，流动通道30在盖26和图案化基底12之间形成。流动通道30可以用于选择性地将多种流体引入到流动池10’(图1H)。
在该实例中，引物22然后被接枝至凹陷14中的聚合物涂层20，如图1H中示出的。可以使用本文描述的任何引物22。在该实例中，接枝可以通过流过过程来完成。在流过过程中，本文描述的引物溶液或混合物可以通过相应的输入端口(未示出)被引入到流动通道30中，可以在流动通道30中保持持续足以将引物22附接至一个或更多个凹陷14中的聚合物涂层20的时间(即孵育期)，并且然后可以从相应的输出端口(未示出)去除。在引物22附接之后，另外的流体可以被引导通过流动通道30，以洗涤现在官能化的凹陷和流动通道30。
在进行测序操作之前，流动池10’可以暴露于聚合物涂层20的预定刺激，以便将聚合物涂层20从当前(例如更疏水的)状态转变为比当前状态更亲水的状态，从中性状态转变为带电状态，和/或从塌缩状态转变为延伸状态。所使用的预定刺激将取决于聚合物涂层20及其包含的刺激响应性官能团。将聚合物涂层20暴露于预定的刺激可以涉及加热聚合物涂层20；将聚合物涂层20暴露于预定pH的溶液；将聚合物涂层20暴露于包含糖的溶液；将聚合物涂层20暴露于亲核体；或将聚合物涂层20暴露于盐溶液。当盖26被附接时，将聚合物涂层20暴露于任何溶液可以通过如本文先前描述的流过过程来完成。当刺激响应性官能团是热响应性的时，可以加热整个流动池10’，或者可以使用流过过程将加热的溶液暴露于聚合物涂层20。
预定的刺激将使聚合物涂层20与随后进行的测序操作的条件更相容。
在其他实例中，将聚合物涂层20暴露于预定的刺激可以在引物22接枝之前发生。在预定的刺激暴露发生在图1E中的引物22接枝之前的实例中，可以使用除流过过程之外的技术，诸如浸涂或浸泡涂覆。例如，图1D中示出的硅烷化、涂覆和抛光的图案化支撑物可以浸入碱性或酸性溶液、糖溶液(例如葡萄糖)或盐溶液中持续足以发生期望的性质改变的时间。对于另一个实例，图1D中示出的硅烷化、涂覆和抛光的图案化支撑物可以被加热至期望的温度以引发状态转变。在预定的刺激暴露发生在图1H中的引物22接枝之前的实例中，流过过程可以用于这样的暴露。对于另一个实例，如图1G中示出的具有附接至其的盖26的硅烷化、涂覆和抛光的图案化支撑物可以被加热至期望的温度以引发状态转变。加热可以在存在水或缓冲液的情况下进行。
如上文提及的，表面化学物质20、22也可以被添加到非图案化支撑物，并且将参考图2A至图2D描述该实例。在非图案化支撑物12’的情况下，连续表面将包括在图1E、图1F和图1H的井14’中发现的相同的表面化学物质20、22。本文公开的任何支撑物可以用作非图案化基底12’，除非非图案化基底12’不包括凹陷14或间隙区域16。在该示例性方法中，盖26(在图2B中示出)在开始时结合至非图案化基底12’，以形成流动通道30。盖26可以是本文描述的任何材料并且在本文描述的任何配置中。盖26也可以经由本文描述的任何技术结合至非图案化基底12’。
在图2B中示出的实例中，盖26包括与侧壁29一体地形成的顶部部分27。侧壁29通过间隔层28被结合至非图案化基底12’的结合区域25。结合区域25可以在非图案化基底12’的周边处或者在任何区处，在该任何区中形成流动通道30的边界是合意的。在其他实例中，间隔层28可以形成侧壁，并且可以被附接至至少大体上平面的盖26。
盖26(包括侧壁29)和非图案化基底12’一起限定流动通道30。流动通道30可以用于例如选择性地引入流体，以便形成表面化学物质20、22，并且选择性地将反应组分或反应物引入到表面化学物质20、22，以便在流动通道30内引发聚合物涂层20的状态转变和/或引发其他指定的反应。
在形成聚合物涂层20(在图2C中示出)之前，该方法可以涉及将非图案化基底12’暴露于(经由流过过程)清洁工艺和/或另一种工艺(例如硅烷化)，所述另一种工艺准备非图案化基底12’的暴露表面用于刺激响应性聚合物的随后沉积。
在图2B中示出了非图案化基底12’的硅烷化。在该实例中，硅烷化将硅烷或硅烷衍生物18附接至在流动通道30中存在的非图案化的晶片表面12’的暴露部分。
硅烷化可以使用任何硅烷或硅烷衍生物18来完成。硅烷或硅烷衍生物18的选择可以部分地取决于用于形成聚合物涂层20(在图2C中示出)的刺激响应性聚合物，因为在硅烷或硅烷衍生物18和聚合物涂层20之间形成共价键可能是合意的。用于将硅烷或硅烷衍生物18附接至基底12’的方法可以是流过过程。
如图2C中示出的，在该实例中，聚合物涂层20然后在硅烷或硅烷衍生物18上或者在已经沉积的其他化学物质上形成，以准备在流动通道30内的非图案化基底12’的暴露表面。
可以使用本文描述的任何刺激响应性聚合物，并且可以一起使用刺激响应性聚合物的组合。在实例中，聚合物涂层的形成可以通过流过过程来完成。在流过过程中，刺激响应性聚合物可以通过相应的输入端口被引入到流动通道30中，并且可以被固化或可以不被固化。聚合物涂层20将在非图案化基底12’的暴露表面上形成，并且抛光不发生。
如图2D中示出的，引物22被接枝至流动通道30中的聚合物涂层20。在该实例中，接枝可以通过流过过程来完成。在流过过程中，引物溶液或混合物可以通过相应的输入端口被引入到流动通道30中，可以在流动通道中保持持续足以将引物22附接至聚合物涂层20的附接基团的时间(即孵育期)。然后，剩余的引物溶液或混合物可以从相应的输出端口去除。在引物附接之后，另外的流体可以被引导通过流动通道，以洗涤现在官能化的流动通道30。在图2D中示出了在该实例中的所得到的流动池10”。
在进行测序操作之前，流动池10”可以暴露于聚合物涂层20的预定刺激，以便将聚合物涂层20从当前状态转变为更亲水的状态(例如，从疏水状态转变为亲水状态、从亲水状态转变为更亲水的状态)、从中性状态转变为带电状态、和/或从塌缩状态转变为延伸状态。所使用的预定刺激将取决于聚合物涂层20及其包含的刺激响应性官能团。将聚合物涂层20暴露于预定的刺激可以涉及加热聚合物涂层20；将聚合物涂层20暴露于预定pH的溶液；将聚合物涂层20暴露于包含糖的溶液；将聚合物涂层20暴露于亲核体；或将聚合物涂层20暴露于盐溶液。因为盖26被附接，所以将聚合物涂层20暴露于任何溶液可以通过如本文先前描述的流过过程来完成。当刺激响应性官能团是热响应性的时，可以加热整个流动池10”，或者可以使用流过过程将加热的溶液暴露于聚合物涂层20。
预定的刺激将使聚合物涂层20与随后进行的测序操作的条件更相容。测序操作是确定DNA或RNA的样品中核苷酸顺序的过程。在实例中，测序操作是合成测序，其涉及当核苷酸被添加到模板链时对荧光标记的可逆终止子进行成像，并且然后裂解荧光标记的可逆终止子以允许下一个碱基的并入。
在使用流动池10”的其他实例中，将聚合物涂层20暴露于预定的刺激可以在引物22接枝之前发生。再次，因为盖26在施加聚合物涂层20之前被附接，所以流过过程可以用于预定的刺激暴露。对于另一个实例，如图2C中示出的硅烷化和涂覆的非图案化支撑物可以被加热至期望的温度以引发状态转变。加热可以在水性环境(例如水或缓冲液)中完成。
虽然未示出，但是应理解，图案化支撑物12或非图案化支撑物12’可以包括入口端口和出口端口，它们将流体地接合其他端口(未示出)，用于将流体引导至相应的流动通道中(例如，从试剂盒(reagent cartridge)或其他流体存储系统)并从流动通道中引导出来(例如，到废物去除系统)。
此外，虽然未示出，但是应理解，官能化的支撑物(其上具有表面化学物质20、22)可以被结合至另一个其上具有表面化学物质20、22的官能化的基底，而不结合至盖26。两个官能化的表面可以彼此面对，并且可以具有在其间限定的流动通道。间隔层和合适的结合方法可以用于将两个官能化的基底结合在一起。
本文公开的流动池10、10’、10”可以用于多种测序方法或技术中，所述多种测序方法或技术包括通常被称为合成测序(SBS)、循环阵列测序、连接测序、焦磷酸测序等等的技术。利用这些技术中的任一种并且在使用图案化支撑物12的实例中，由于聚合物涂层20和附接的引物22存在于官能化的凹陷(即，其上具有表面化学物质20、22的14、14’)中而不是在间隙区域16上，扩增将被限制于官能化的凹陷。测序通常涉及将核酸模板与流动池杂交，扩增核酸模板，并且当核苷酸或寡核苷酸与扩增的核酸模板缔合时检测信号。
作为一个实例，合成测序(SBS)反应可以在系统诸如来自Illumina(San Diego,CA)的HISEQTM、HISEQXTM、MISEQTM、MISEQDXTM、MINISEQTM、NOVASEQTM、NEXTSEQDXTM或NEXTSEQTM测序器系统上运行。
SBS测序操作通常包括将核酸文库模板引入到流动池支撑物12，由此核酸文库模板与附接至聚合物涂层20的引物22杂交；从杂交的核酸文库模板产生核酸模板链；引入与核酸模板链的衔接子互补的测序引物；将荧光标记的核苷酸和聚合酶引入到流动池支撑物12，由此一种荧光标记的核苷酸被并入，以沿着核酸模板链延伸测序引物；以及检测来自并入的一个荧光标记的核苷酸的荧光信号。
在SBS中，多于一个核酸文库模板可以被引入到流动池10、10’、10”。多个核酸文库模板例如与固定在流动池10、10’、10”上的两种类型的引物22中的一种杂交。然后可以进行簇生成。在簇生成的一个实例中，使用高保真的DNA聚合酶从杂交的引物22通过3’延伸来拷贝核酸文库模板。原始核酸文库模板被变性，使拷贝固定在引物22所位于的地方中。等温桥扩增可以用于扩增固定的拷贝。例如，拷贝的模板在相邻的互补引物22上成环并且与相邻的互补引物22杂交，并且聚合酶拷贝所拷贝的模板以形成双链桥，双链桥被变性以形成两条单链。这两条链在相邻的互补引物22上成环并且与相邻的互补引物22杂交，并且再次延伸以形成两条新的双链环。通过等温变性和扩增的循环在每个模板拷贝上重复该过程，以产生密集的克隆簇。双链桥的每个簇被变性。在实例中，反向链通过特异性碱基裂解被去除，留下正向模板链。
模板的3’末端和任何引物22可以被封闭以防止不希望的引发。测序引物可以被引入到流动池10、10’、10”。因为测序引物与核酸模板链的衔接子互补，所以它将与衔接子杂交(例如，模板的读段1测序引物)。
监测核酸引物(例如测序引物)沿核酸模板(例如正向模板多核苷酸链)的延伸，以确定模板中核苷酸的序列。基本的化学过程可以是聚合(例如，通过聚合酶催化)或连接(例如，通过连接酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS过程中，荧光标记的核苷酸以模板依赖方式添加到模板(从而使测序引物延伸)，使得添加到测序引物的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。例如，为了引发第一个SBS循环，一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可以被输送到容纳具有附接至其的模板链的引物22的阵列的流动通道30等内/被输送通过流动通道30等。测序引物延伸导致标记的核苷酸被并入，并且该并入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向流动池10、10’、10”提供激发光。
在一些实例中，在核苷酸已经被添加之后，核苷酸还可以包括进一步使测序引物延伸终止的可逆终止性质。例如，具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以沿模板链被添加到测序引物，使得随后的延伸不能发生，直到去封闭剂被输送以去除该部分。因此，对于使用可逆终止的实例，去封闭试剂可以被输送到流动通道30等(在检测发生之前或之后)。
洗涤可以在多个流体输送步骤之间发生。然后SBS循环可以重复n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。
虽然已经详细地描述了SBS，但是应理解，本文描述的流动池10、10’、10”可以与其他测序方案诸如基于流动池的文库制备一起用于基因分型，或者用于其他化学和/或生物应用中。
为了进一步说明本公开内容，本文给出了示例性实施例和预言实施例。应理解，这些实施例出于说明性的目的被提供并且不应被解释为限制本公开内容的范围。
非限制性工作实施例和预言实施例
实施例1.糖响应性的可切换杂聚物(硼酸)的合成。
Figure BDA0002851688770000491
将BrAPA(N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)、叠氮化钠和二甲基甲酰胺(DMF)的混合物放置于DrySyn浴中，并且在氮气气氛下，在20℃在搅拌的情况下加热该溶液持续3h，以形成AzAPA(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)。将丙烯酰胺和3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸溶解在去离子水中。然后将制备的AzAPA溶液添加到丙烯酰胺/3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸溶液，并且在通过0.2μm过滤器过滤之前充分混合。然后将过滤的溶液转移到配备有搅拌棒的500mL圆底烧瓶中，并且将氮气鼓泡通过混合物持续30min。在对丙烯酰胺/AzAPA预混物脱气的同时，制备所需量的在去离子水中的过硫酸钾，并然后将其转移到单体的混合物。然后将混合物用共引发剂TEMED(四甲基乙二胺)处理。将溶液在氮气下在35℃搅拌持续1.5h。在聚合结束时，移除氮气管线以将反应烧瓶暴露于空气。然后将粗混合物缓慢地添加到2-丙醇。然后通过过滤分离粗聚合物。
预言实施例2.pH响应性的可切换杂聚物(阴离子)的合成。
Figure BDA0002851688770000501
将丙烯酸酯/盐衍生物和磺内酯的混合物反应以形成磺酸酯/盐衍生的丙烯酸酯/盐单体。如实施例1中描述的，将该单体转化成杂聚物。
预言实施例3.亲核体响应性的可切换杂聚物(磺内酯)的合成。
Figure BDA0002851688770000502
如实施例1中描述的，将磺内酯衍生的丙烯酸酯/盐单体转化成杂聚物。
预言实施例4.亲核体响应性的可切换杂聚物(环状酸酐)的合成。
Figure BDA0002851688770000511
如实施例1中描述的，将琥珀酸酐衍生的丙烯酸酯/盐单体转化成杂聚物。
实施例5.盐响应性的可切换杂聚物(两性离子)的合成。
Figure BDA0002851688770000512
所示出的杂聚物由如实施例1中描述的合适单体制备。该杂聚物可以具有改进的干燥储存稳健性。
实施例6.pH响应性的可切换杂聚物(阴离子)的合成。
Figure BDA0002851688770000521
所示出的杂聚物由如实施例1中描述的合适单体制备。该杂聚物可以具有改进的干燥储存稳健性。
实施例7.使用可切换杂聚物的测序操作。
使用流过过程将四种杂聚物分别地涂覆在四个单通道、非图案化的流动池的通道表面上。
对照：聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)，也被称为PAZAM
测试1：实施例5的两性离子可切换杂聚物
测试2：实施例6的阴离子可切换杂聚物
测试3：实施例1的糖的可切换杂聚物
将18μM-26μM引物接枝在单独的流动池中的每个聚合物层上。
在测序之前，将实施例1的聚合物暴露于葡萄糖的溶液，这将实施例1的聚合物从其中性且相对疏水的状态转变为其带负电且更亲水的状态。在该实施例中，实施例5的聚合物和实施例6的聚合物没有切换。
使用PhiX文库在每个通道中进行超过300个测序循环。读段1对应于循环1-151，并且读段2对应于循环152-302。收集的测序数据包括错误率(百分比)(在图3A中示出)和质量评分(大于Q30的百分比)(在图3B中示出)。Q30相当于1000次中1次不正确碱基调用的概率。这意味着碱基调用准确度(即，正确碱基调用的概率)是99.9％。99％的较低的碱基调用准确度(Q20)将具有1/100的不正确碱基调用概率，这意味着每100个碱基对测序读段将可能包含一个错误。当测序品质达到Q30时，几乎所有的读段将是完美的，具有零错误和零歧义。如图3A和图3B中示出的，实施例聚合物中的每种聚合物与比较/对照实施例表现类似。这些结果指示实施例1、实施例4和实施例5的聚合物能够支持合成测序技术，其性能与对照实施例的性能大致匹配。据信，用所有类型的测序文库都可以获得类似的结果。
附加说明
应该认识到，在本文和所附权利要求中描述的概念的所有组合(假设这样的概念不相互不一致)被设想为本文公开的创造性主题的一部分。特别是，出现在本公开内容的结尾处的所要求保护的主题的所有组合被设想为本文公开的创造性主题的一部分。还应该认识到，也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中的本文中明确使用的术语应该符合与本文公开的特定概念最一致的含义。
虽然已经详细描述了若干实例，但是应理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。

Claims (25)

1.一种杂聚物，包括：
包含与附接至引物的官能团反应的附接基团的丙烯酰胺单体；和
包含刺激响应性官能团的单体，其中包含所述刺激响应性官能团的所述单体选自由以下组成的组：
包含末端pH响应性官能团的丙烯酰胺单体；
包含末端pH响应性官能团的乙烯基或丙烯酸酯/盐单体，所述末端pH响应性官能团选自由以下组成的组：具有酸不稳定的保护基团的羟基、具有碱不稳定的保护基团的羟基、具有酸不稳定的保护基团的氨基、具有碱不稳定的保护基团的氨基、磺酸酯/盐基团和磺酸基团；
温度响应性N-取代的丙烯酰胺；
包含末端糖响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；
包含末端亲核体响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；和
包含末端盐响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体。
2.根据权利要求1所述的杂聚物，其中包含所述刺激响应性官能团的所述单体当暴露于预定的刺激时将经历修饰，其中所述修饰改变所述杂聚物的极性和/或构象。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的杂聚物，还包括接枝至所述附接基团的所述引物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的杂聚物，其中所述附接基团选自由以下组成的组：叠氮基基团、烯基基团、炔基基团、醛基团、腙基团、肼基团、四唑基团、四嗪基团和硫醇基团。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的杂聚物，其中所述丙烯酰胺单体的所述附接基团包括叠氮基基团。
6.根据权利要求5所述的杂聚物，其中所述丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。
7.根据权利要求5所述的杂聚物，还包括第二丙烯酰胺单体。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是包含所述末端pH响应性官能团的所述丙烯酰胺单体；并且
所述末端pH响应性官能团选自由以下组成的组：被保护为缩醛、半缩醛或缩酮的羟基、1,2-二醇、1,3-二醇，叔丁氧基羰基氨基基团，9H-芴-9-基甲氧羰基氨基基团，氨基基团，羧酸酯/盐基团，羧酸基团，磺酸酯/盐基团和磺酸基团。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是包含所述末端糖响应性官能团的所述丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且
所述末端糖响应性官能团包括硼酸基团。
10.根据权利要求9所述的杂聚物，其中包含所述刺激响应性官能团的所述单体是3-(丙烯酰胺基)苯基硼酸。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是包含所述末端亲核体响应性官能团的所述丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且
所述末端亲核体响应性官能团具有以下结构：
Figure FDA0002851688760000021
其中：(a)Y是SO2并且Y’是CH2；或者(b)Y和Y’两者均是C(O)。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是包含所述末端盐响应性官能团的所述丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；并且
所述盐响应性官能团是表现出反聚电解质行为的两性离子官能团。
13.根据权利要求12所述的杂聚物，其中包含所述刺激响应性官能团的所述单体具有以下结构中的一种：
(i)
Figure FDA0002851688760000031
其中A是O或NH，并且Rz是H或C1-4烷基；或
(ii)
Figure FDA0002851688760000032
其中Rz是H或C1-4烷基。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是所述温度响应性N-取代的丙烯酰胺；并且
所述温度响应性N-取代的丙烯酰胺包括热敏性羟基或氨基保护基团。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的杂聚物，其中：
包含所述刺激响应性官能团的所述单体是所述温度响应性N-取代的丙烯酰胺；并且
所述温度响应性N-取代的丙烯酰胺是N-异丙基丙烯酰胺。
16.一种具有以下结构的杂聚物：
Figure FDA0002851688760000041
其中n在从10至500的范围内。
17.一种制备可切换杂聚物的方法，包括：
从由以下组成的组中选择包含刺激响应性官能团的单体：
包含末端pH响应性官能团的丙烯酰胺单体；
包含末端pH响应性官能团的乙烯基或丙烯酸酯/盐单体，所述末端pH响应性官能团选自由以下组成的组：具有酸不稳定的保护基团的羟基、具有碱不稳定的保护基团的羟基、具有酸不稳定的保护基团的氨基、具有碱不稳定的保护基团的氨基、磺酸酯/盐基团和磺酸基团；
温度响应性N-取代的丙烯酰胺；
包含末端糖响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；
包含末端亲核体响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；和
包含末端盐响应性官能团的丙烯酰胺、丙烯酸酯/盐或乙烯基单体；以及
使包含所述刺激响应性官能团的所述单体与包含与附接至引物的官能团反应的附接基团的丙烯酰胺单体共聚。
18.根据权利要求17所述的方法，其中包含所述附接基团的所述丙烯酰胺单体是叠氮基乙酰胺基戊基丙烯酰胺单体。
19.根据权利要求17或权利要求18所述的方法，还包括使包含所述刺激响应性官能团的所述单体和包含所述附接基团的所述丙烯酰胺单体与第二丙烯酰胺单体共聚。
20.一种流动池，包括：
支撑物；以及
附接至所述支撑物的根据权利要求1-16中任一项所述的杂聚物。
21.一种制造流动池的方法，包括使根据权利要求1、2或4-16中任一项所述的杂聚物与流动池支撑物的至少一部分接触，从而将所述杂聚物附接至所述流动池支撑物。
22.根据权利要求21所述的方法，还包括将引物接枝至附接至所述支撑物的所述杂聚物的所述附接基团。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，还包括将附接至所述流动池支撑物的所述杂聚物暴露于预定的刺激。
24.根据权利要求23所述的方法，还包括，在所述暴露之后，对所述流动池进行测序操作。
25.一种测序方法，包括：
将引物接枝至流动池支撑物上的可切换杂聚物；
将所述流动池支撑物上的所述可切换杂聚物暴露于预定的刺激，从而引起所述可切换杂聚物的极性和/或构象的改变；
将核酸模板与所述流动池支撑物上的所述引物杂交；
扩增所述流动池支撑物上的所述核酸模板以产生扩增的模板；和
当标记的核苷酸与所述扩增的模板中的互补核苷酸缔合时，检测信号。
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