CN112655518B - 一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，属于生物无性繁殖技术领域。该方法包括金铁锁优质种根的筛选，金铁锁优质种根表面消毒，金铁锁优质组织培养繁殖材料培养。采用本发明方法20d内可获得大量的金铁锁优质组织培养繁殖材料即组织培养外植体，其具有污染率低，增值系数高等特点，可解决大田获取繁殖材料存在时间限制、优质繁殖材料判断困难、繁殖材料数量有限以及获取的繁殖材料所带病原菌较多等问题。

Description

一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法

技术领域

本发明提供了一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，属于生物无性繁殖技术领域。

背景技术

金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)为石竹科金铁锁属多年生草本植物，又名独定子、昆明沙参、蜈蚣七、对叶七等，主要分布于云南省、四川省、贵州省和西藏部分地区。为中国特有的单种属植物，是研究石竹科植物系统分类和进化极其重要的材料。民间用药历史较为悠久，首载于《滇南本草》，而后收载于1977年版《中华人民共和国药典》，具有散瘀、消肿、排脓、止血等功效，主治风湿疼痛、跌打损伤、创面出血、消肿排脓等，现为云南白药、贵州太极等制药企业常用原材料。随着市场需求的扩大，金铁锁野生资源遭遇了前所未有的破坏，过渡的采挖导致了野生资源的濒危，在《中国植物红皮书》中已被列为国家二级保护植物。

目前，生产中金铁锁的种植技术较多地采用的是种子繁殖和根茎扦插繁殖，种子繁殖虽然能快速扩大种植面积，但种子存在遗传差异性，产生的植株后代存在抗病性、生长量、有效成分含量等方面差异性问题，并随着繁殖代数的增加呈现植株抗病性下降、减产等一系列问题，而根茎扦插繁殖又因优质繁殖材料稀缺不能快速扩大金铁锁种植面积。

组织培养技术是目前快速扩大化种群，规范化、规模化种植金铁锁较为便捷且可行的方法，通过组织培养技术可以有效固定亲本的优良性状，如抗病性强、有效成分含量高等优良基因，在很大程度上解决了上述生产中存在的问题。金铁锁组织培养技术主要采用金铁锁的健康枝条作为繁殖材料，通过试验地观察表明，金铁锁病害主要为土传病害，一般发生在植株开花后，由于雨季地面湿度增加，气温升高，加之金铁锁本身属于匍匐性生长植物，地上部分几乎与地面贴合生长，在其开花后地上部分变得更加密集，从而导致病害的发生。因此，选择金铁锁组织培养繁殖材料应在金铁锁开花前、雨季来临前进行，也就是每年的5-6月份是采集大田金铁锁组织培养繁殖材料的最佳时期，同时每个植株上可供采集的优质枝条数量并不多，主要是因为正常情况下，金铁锁根茎有两个芦头，每个芦头正常生长2-4个枝条，既要维持植株正常生长，又要健康枝条，所以每个植株上能被采取的枝条数量也就有限了。除此之外，金铁锁商品除注重有效成分含量外，还十分注重外观形态，好的金铁锁商品要求单根、直根、无病害、颜色黄褐色、体大，但我们在大田中采集金铁锁繁殖材料时是无法看到根茎生长情况的，也就无法判断采集到的金铁锁繁殖材料是否为优质繁殖材料，因此存在优质繁殖材料判断困难问题。同时，由于繁殖材料与地面长期接触所带的病原菌也较多。

发明内容

本发明针对金铁锁组织培养中大田获取繁殖材料存在时间限制、优质繁殖材料判断困难、繁殖材料数量有限以及获取的繁殖材料所带病原菌较多等缺陷，提供了一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，该方法包括金铁锁优质种根的筛选：首先将采集到的金铁锁根茎进行外部形态分级，筛选无病虫害、无损伤、无分叉的根茎作为种根备用。

种根的分级标准为：18cm<根茎长<25cm，0.8cm<茎粗<1.5cm，3g<重量<6g为一级，10cm<根茎长<18cm，0.5cm<茎粗<0.8cm，1.5g<重量<3g为二级，5cm<根茎长<10cm，0.3cm<茎粗<0.5cm，1.0g<重量<1.5g为三级，选择一级金铁锁根茎和/或二级金铁锁根茎为金铁锁优质种根；首选一级金铁锁根茎按以下步骤进行繁育，一级金铁锁根茎不足时，补充二级金铁锁根茎，若无一级金铁锁根茎则用二级金铁锁根茎，淘汰三级金铁锁根茎。

根茎的表面消毒处理方法为：将一级和/或二级种根进行清洗，洗去沙土，用吸水纸吸净水分后，用质量分数0.1％NaClO溶液浸泡2h进行根茎表面消毒后取出沥干水分备用。

培养基质的制备方法为：用800倍多菌灵液将10g的生物有机肥溶解后，用此混合液将苔藓和粗木屑分别浸湿，粗木屑浸湿至湿度为40-60％，苔藓沥干至不滴水，备用；生物有机肥指市场上销售的生物有机肥。

培养盘的选择：根据种根长度选择合适的培养盘，不限于培养盘的材质、大小和规格。

种根的培养方法为：将种根同向平放在培养盘上，使其根茎上方0.5cm及芦头整齐露于培养盘一边外，种根间距为0.5cm，种根摆放数量根据培养盘的边长而定，相同方法将培养盘的其他三边也摆上种根，种根与种根下端可叠加；摆好后，用粗木屑将种根盖好稍压实，粗木屑厚度约为2-3cm，上方再均匀铺上2cm苔藓进行保湿，在培养条件为18～26℃，湿度45～70％，光照强度1800-2000lx，光照时间8-12h/d。

本发明还提供更优的一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，包括以下步骤：

(1)金铁锁优质种根的筛选：采集的带有1-2个芦头、无病虫害、无损伤和无分叉的金铁锁根茎按如下分级标准分级：18cm≤根茎长≤25cm，0.8cm≤根茎粗≤1.5cm和3g≤根茎重量≤6g为一级金铁锁根茎；10cm≤根茎长<18cm，0.5cm≤根茎粗<0.8cm和1.5g≤根茎重量<3g为二级金铁锁根茎；选择一级金铁锁根茎和/或二级金铁锁根茎为金铁锁优质种根；

(2)金铁锁优质种根表面消毒：将所选择的金铁锁优质种根进行清洗，洗去沙土，清洗后用纸吸净其表面水分，再用质量分数0.1％次氯酸钠溶液浸泡2h后，取出金铁锁优质种根沥干其表面水分备用；

(3)金铁锁优质组织培养繁殖材料的培养：

①培养基质的处理：所述培养基质为木屑和苔藓或河沙和苔藓，用50％多菌灵可湿性粉剂800倍液1L与10g的氮磷钾缓释复合肥混合得混合液，选用木屑和苔藓为培养基质，需用混合液将木屑和苔藓分别浸湿，或选用河沙和苔藓为培养基质，也需用混合液将河沙和苔藓分别浸湿，木屑浸湿至水分含量为40～60％，苔藓浸湿后沥干至不滴水，河沙浸湿至水分含量为60～65％，备用；

②金铁锁优质种根摆放：

A.用木屑和苔藓为培养基质时，将步骤(3)①中经处理的木屑放入在培养盘内底部，再将步骤(2)中经表面消毒的金铁锁优质种根平摆放在培养盘内的木屑上，且使每一条金铁锁优质种根上的芦头露于培养盘边缘之外，再用步骤(3)①中经处理的木屑覆盖在培养盘内的金铁锁优质种根表面，然后在覆盖在金铁锁优质种根表面的木屑表面再覆盖步骤(3)①中经处理的苔藓进行保湿；

B.用河沙和苔藓为培养基质时，将步骤(3)①中经处理的河沙放入在培养盘内底部，再将步骤(2)中经表面消毒的金铁锁优质种根平摆放在培养盘内的河沙上，且使每一条金铁锁优质种根上的芦头露于培养盘边缘之外，再用步骤(3)①中经处理的木屑覆盖在培养盘内的金铁锁优质种根表面，然后在覆盖在金铁锁优质种根表面的河沙表面再覆盖步骤(3)①中经处理的苔藓进行保湿；

所述培养盘底部有漏水孔；

③培养：将步骤(3)②中摆放有金铁锁优质种根的培养盘置于培养条件为18℃～26℃，空气相对湿度45～70％，光照强度1800～2000lx，光照时间8h/d下培养，待培养盘内有芦头变绿时，每天喷水1～2次使培养盘内所有芦头保持湿润，待培养盘内所有金铁锁优质种根长出枝条，则所述枝条即为金铁锁优质组织培养繁殖材料。

优选地，上述更优的一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法中，步骤(3)①中所述的氮磷钾缓释复合肥，以质量分数计，含N15％，P₂O₅ 15％，K₂O 15％。

优选地，上述更优的一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法中，步骤(3)①中所述的木屑为粗木屑，所述粗木屑为直径5mm-10mm的木屑。

优选地，上述更优的一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法中，步骤(3)②A中所述培养盘内底部和覆盖在金铁锁优质种根表面的木屑或粗木屑的厚度为2～3cm，覆盖在木屑或粗木屑表面的苔藓的厚度为1～2cm；步骤(3)②B中所述培养盘内底部和覆盖在金铁锁优质种根表面的河沙的厚度为2～3cm，覆盖在河沙表面的苔藓的厚度为1～2cm。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

1.采用本发明方法培育用于金铁锁组织培养的金铁锁优质组织培养繁殖材料(即外植体)，污染率低，繁殖率高，短时间内可获得大量金铁锁优质组织培养繁殖材料。

本发明仅需15～20d即可获得大量金铁锁优质组织培养繁殖材料，平均繁殖倍数达11.5倍，将该金铁锁优质组织培养繁殖材料作为外植体进行组培污染率低(仅为3.33％)，比常规从大田种植地采集的金铁锁枝条作为外植体进行组培的污染率(16.67％)下降80.02％，与相同材料在室外培育获得的金铁锁组织培养繁殖材料用于对照2(8.33％)相比，污染率下降60.02％。

2.本发明一年四季，即使在冬季金铁锁休眠期内也均可获得大量优质组织培养繁殖材料，不受节气候的限制。

3.本发明所选用的培养基质以及其它培育原料成本低廉，易于购买。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明技术方案进一步说明，但本发明的保护范围不限于下述实施例，尤其是所述培养容器的形状、规格、氮磷钾缓释复合肥的品名以及种根的摆放方式、数量、层数等。

术语：

根茎：金铁锁的根，即生长在地下部分的金铁锁的根。

金铁锁组织培养繁殖材料：用于金铁锁植物组织培养的外植体材料。

实施例1本发明方法

金铁锁优质种根的筛选：将采集的带有1-2个芦头、无病虫害、无损伤和无分叉的金铁锁根茎按如下分级标准分级：

18cm≤根茎长≤25cm，0.8cm≤根茎粗≤1.5cm和3g≤根茎重量≤6g为一级金铁锁根茎，10cm≤根茎长<18cm，0.5cm≤根茎粗<0.8cm和1.5g≤根茎重量<3g为二级金铁锁根茎；5cm≤根茎长<10cm，0.3cm≤根茎粗<0.5cm和1.0g≤根茎重量<1.5g为三级金铁锁根茎；选择一级金铁锁根茎和/或二级金铁锁根茎为金铁锁优质种根；首选一级金铁锁根茎按以下步骤进行繁育，一级金铁锁根茎不足时，补充二级金铁锁根茎，若无一级金铁锁根茎则用二级金铁锁根茎，淘汰三级金铁锁根茎。本实施例选择一级金铁锁根茎为金铁锁优质种根进行如下试验。

(2)金铁锁优质种根表面消毒：将所选的金铁锁优质种根用自来水进行清洗，洗去沙土，用吸水纸吸净金铁锁优质种根表面水分后，用质量分数0.1％次氯酸钠溶液浸泡2h进行表面消毒后，取出金铁锁优质种根沥干其表面水分备用。

(3)金铁锁优质组织培养繁殖材料的培养：

①培养基质的处理：所述培养基质为粗木屑和苔藓，所述粗木屑直径为5mm～10mm，用50％多菌灵可湿性粉剂800倍液1L与10g的氮磷钾缓释复合肥混合得混合液，用混合液分别将粗木屑和苔藓浸湿，粗木屑浸湿至水分含量为60％，苔藓浸湿后沥干至不滴水，备用；以质量分数计，所述氮磷钾缓释复合肥含N15％，P₂O₅ 15％，K₂O 15％，养分释放期为90天。

②金铁锁优质种根摆放：将步骤(3)①中经处理的粗木屑放入在培养盘内底部，粗木屑的厚度为2～3cm，再将步骤(2)中经表面消毒的金铁锁优质种根平摆放在培养盘内的粗木屑上，且使每一条金铁锁优质种根上的芦头露于培养盘边缘之外，相邻两金铁锁优质种根之间的间距为0.5cm，再用步骤(3)①中经处理的粗木屑覆盖在培养盘内的金铁锁优质种根表面压实，覆盖的粗木屑为2～3cm，然后在覆盖在金铁锁优质种根表面的粗木屑表面再覆盖步骤(3)①中经处理的苔藓进行保湿，苔藓的厚度为1～2cm，所述培养盘底部有漏水孔。每一培养盘摆放的金铁锁优质种根数量根据培养盘的大小而定。

根据金铁锁优质种根长度选择合适的培养盘，例如培养盘尺寸为：长40cm，宽40cm，深10cm，培养盘下方均匀分布9-16个排水孔，排水孔直径1-2cm，先用2层纱布或其他透水性材料铺在培养盘内底面，防止所述粗木屑从排水孔漏出，再将步骤(3)①中经处理的粗木屑放其上并布满培养盘底部，用手压实。

③培养：将步骤(3)②中摆放好金铁锁优质种根的培养盘置于培养条件为18℃～26℃，空气相对湿度45～70％，光照强度1800-2000lx，光照时间8h/d下培养，待有芦头变绿时，每天喷1～2次水使所有芦头保持湿润，待所有金铁锁优质种根长出10cm以上枝条，则所述枝条即为金铁锁优质组织培养繁殖材料。

为使所用材料一致，用上述实施例1相同的一级金铁锁根茎作为对照材料，进行如下对比实验。

对比实验1：获得的组织培养繁殖材料比较实验

对照1：

将与实施例1相同的一级金铁锁根茎直接种于花盆中，花盆内的培养基质为所采集的金铁锁根茎的种植地土壤，置于室外培养，定期浇水(保持芦头每一部分都有水珠为止)，直至生长出10cm以上枝条，其枝条即为金铁锁组织培养繁殖材料。

试验结果比较：

对照1：从种植于花盆的金铁锁开始萌发至获得金铁锁组织培养繁殖材料需45～60d。

实施例1：从步骤(3)③培养开始至获得金铁锁优质组织培养繁殖材料，仅为15-20d，大大缩短了获得金铁锁组织繁殖材料的时间，缩短时间为25～45天，即缩短时间55.56％-75％。

另外，由于金铁锁病害主要为土传病害，一般发生在植株开花后，由于雨季地面湿度增加，气温升高，加之金铁锁本身属于匍匐性生长植物，地上部分几乎与地面贴合生长，在其开花后地上部分变得更加密集，从而导致病害的发生，以及金铁锁在冬季为休眠期，春季萌发到长出枝条需45-60天，因此，在大田或原生境选择金铁锁组织培养繁殖材料通常在金铁锁开花前且雨季来临前进行，也就是每年的5-6月份是采集大田金铁锁组织培养繁殖材料的最佳时期，因此，现有技术获得金铁锁组织培养繁殖材料需要180～200天(从倒苗至次年出苗并获得金铁锁组织繁殖材料的天数)，与在大田或原生境采集金铁锁组织培养繁殖材料相比，本发明可缩短时间165～180天(采用本发明方法获得金铁锁组织繁殖材料时间为15-20天)。而且本发明不受季节气候限制，一年四季均可采集金铁锁的根茎(地下部分)，即使在冬天的金铁锁地上部分完全没有枝条也可获得金铁锁根茎，一年四季都可快速获得优质的金铁锁组织培养繁殖材料，仅需为15-20d，即可获得优质的金铁锁组织培养繁殖材料。

对比实验2：污染率和增值倍数比较实验

处理1：本发明方法获得的金铁锁优质组织培养繁殖材料作为外植体的污染率和增值倍数实验

(1)将实施例1中获得金铁锁优质组织培养繁殖材料切成带腋芽的茎段进行消毒处理，消毒处理方法为：75％v/v乙醇30s，无菌水清洗3-4次，质量分数0.1％升汞溶液处理6min，无菌水清洗5-6次，备用。

(2)无菌条件下，将步骤(1)经消毒处理的茎段作为外植体接种于培养瓶内的初代培养基，在18℃～26℃，空气相对湿度45～70％，光照强度1800-2000lx，光照时间8h/d下培养，初代培养基配方为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L，每瓶接1个外植体。

对照2：采集对照1培育的金铁锁组织培养繁殖材料作为外植体的污染率和增值倍数实验

采集对照1培育的金铁锁组织培养繁殖材料按上述对比实验2中处理1方法进行实验。

对照3：从大田金铁锁种植地采集的金铁锁枝条作为外植体按上述对比实验2中处理1方法进行实验。从大田金铁锁种植地采集的金铁锁枝条质量级别与本发明所述的一级金铁锁根茎相当，即从大田金铁锁种植地采集的金铁锁枝条：18cm≤金铁锁枝条茎长≤25cm，0.8cm≤金铁锁枝条茎粗≤1.5cm和3g≤金铁锁枝条茎重量≤6g。

实验结果比较：

(1)污染率比较：

无菌条件下，将对比实验2处理1、对照2和对照3的繁殖材料分别经过对比实验2处理1中(1)方法消毒处理后分别接入初代培养基中，每处理60瓶，培养条件为：温度18～26℃，空气相对湿度45～70％，光照强度1800-2000lx，光照时间8h/d，30天后开始统计并计算污染率，试验结果如表1所示，从表1中可以看出，按本发明方法得到的外植体污染率很低，仅为3.33％，相同材料在室外培育获得的金铁锁组织培养繁殖材料用于对照2的污染率为8.33％，从大田金铁锁种植地采集的金铁锁枝条作为外植体按上述对比实验2中处理1方法进行实验，污染率为16.67％，说明本发明方法获得的繁殖材料从污染率上优于对照2和对照3。

表1对比实验2处理1、对照2、对照3污染率比较分析

(2)增值倍数比较

无菌条件下，将对比实验2处理1、对照2和对照3的繁殖材料分别经过对比实验2处理1中(1)方法消毒处理后分别接入初代培养基中，每处理60瓶，培养条件为：温度18～26℃，空气相对湿度45～70％，光照强度1800-2000lx，光照时间8h/d，30天后统计丛生芽个数及增值倍数，由表2可以看出，处理1平均丛生芽数可以达到11.5，增值倍数达到11.5倍，而相同材料在室外培育获得的金铁锁组织培养繁殖材料用于对照2的平均丛生芽个数为4.7个，增值倍数为4.7倍，从大田金铁锁种植地采集的金铁锁枝条用于对照3的平均丛生芽个数为3.8个，增值倍数仅为3.8倍，处理1的增值倍数分别是对照2和对照3的增值倍数的2.45倍和3.03倍。

表2对比实验2处理1、对照2、对照3增值倍数比较分析

Claims (4)

1.一种快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，其特征在于：

（1）金铁锁优质种根的筛选：采集的带有1-2个芦头、无病虫害、无损伤和无分叉的金铁锁根茎按如下分级标准分级：18cm≤根茎长≤25 cm，0.8cm≤根茎粗≤1.5cm，3g≤根茎重量≤6g为一级金铁锁根茎；10cm≤根茎长<18 cm，0.5cm≤根茎粗<0.8cm，1.5g≤根茎重量<3g为二级金铁锁根茎；选择一级金铁锁根茎和/或二级金铁锁根茎为金铁锁优质种根；

（2）金铁锁优质种根表面消毒：将所选择的金铁锁优质种根进行清洗，洗去沙土，清洗后用纸吸净其表面水分，再用质量分数0.1%NaClO溶液浸泡2h后，取出金铁锁优质种根沥干其表面水分备用；

（3）金铁锁优质组织培养繁殖材料的培养：

①培养基质的处理：所述培养基质为木屑和苔藓或河沙和苔藓，用50%多菌灵可湿性粉剂800倍液1L与10g的氮磷钾缓释复合肥混合得混合液，用混合液将木屑、苔藓、河沙分别浸湿，木屑浸湿至水分含量为40～60%，苔藓浸湿后沥干至不滴水，河沙浸湿至水分含量为60～65%，备用；

②金铁锁优质种根摆放：

A.用木屑和苔藓为培养基质时，将步骤（3）①中经处理的木屑放入在培养盘内底部，再将步骤（2）中经表面消毒的金铁锁优质种根平摆放在培养盘内的木屑上，且使每一条金铁锁优质种根上的芦头露于培养盘边缘之外，再用步骤（3）①中经处理的木屑覆盖在培养盘内的金铁锁优质种根表面，然后在覆盖在金铁锁优质种根表面的木屑表面再覆盖步骤（3）①中经处理的苔藓进行保湿；

B. 用河沙和苔藓为培养基质时，将步骤（3）①中经处理的河沙放入在培养盘内底部，再将步骤（2）中经表面消毒的金铁锁优质种根平摆放在培养盘内的河沙上，且使每一条金铁锁优质种根上的芦头露于培养盘边缘之外，再用步骤（3）①中经处理的河沙覆盖在培养盘内的金铁锁优质种根表面，然后在覆盖在金铁锁优质种根表面的河沙表面再覆盖步骤（3）①中经处理的苔藓进行保湿；

所述培养盘底部有漏水孔；

③培养：将步骤（3）②中摆放有金铁锁优质种根的培养盘置于培养条件为18℃～26℃，空气相对湿度45～70%，光照强度1800～2000 lx，光照时间8h/d下培养，待培养盘内有芦头变绿时，每天喷水1～2次使培养盘内所有芦头保持湿润，待培养盘内所有金铁锁优质种根长出枝条，则所述枝条即为金铁锁优质组织培养繁殖材料。

2.根据权利要求1所述的快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，其特征在于：步骤（3）①中所述的氮磷钾缓释复合肥，以质量分数计，含 N 15%，P₂O₅ 15%，K₂O 15%。

3.根据权利要求1所述的快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，其特征在于：步骤（3）①中所述的木屑为粗木屑，所述粗木屑为直径5mm-10mm的木屑。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的快速获得金铁锁优质组织培养繁殖材料的方法，其特征在于：

在步骤（3）②A中所述培养盘内底部和覆盖在金铁锁优质种根表面的木屑或粗木屑的厚度为2～3cm，覆盖在木屑或粗木屑表面的苔藓的厚度为1～2cm；

在步骤（3）②B中所述培养盘内底部和覆盖在金铁锁优质种根表面的河沙的厚度为2～3cm，覆盖在河沙表面的苔藓的厚度为1～2cm。