CN112646909A - 一种基于染色体上特异snp位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法 - Google Patents

一种基于染色体上特异snp位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法 Download PDF

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CN112646909A CN202110006360.2A CN202110006360A CN112646909A CN 112646909 A CN112646909 A CN 112646909A CN 202110006360 A CN202110006360 A CN 202110006360A CN 112646909 A CN112646909 A CN 112646909A
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刘先凯
吕宇飞
王东澍
陈刚
王恒樑
朱力
潘超
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明公开了一种基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法。本发明筛选出8个针对炭疽芽胞杆菌特异的SNP靶标。基于这8个SNP位点在其两侧碱基延伸构建出使用方便的电子探针(eProbe)，使用这8个eProbe鉴定了建库时的炭疽芽胞杆菌可疑菌株，临床中类炭疽蜡样芽胞杆菌以及基于毒力基因鉴定错误的蜡样芽胞杆菌，结果证实了这8个电子探针具有特异、准确、快速检测炭疽芽胞杆菌的实用性。这8个eProbe涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，可用于快速鉴定炭疽芽胞杆菌，从蜡样芽胞杆菌区分出炭疽芽胞杆菌对临床指导用药以及医学防护决策具有关键作用。

Description

一种基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法。
背景技术
土壤中蜡样芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌在致病性，芽胞形成和染色体上的遗传相似性被认为是同一物种。在蜡样芽胞杆菌家族中，区分炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌非常关键，因为这两种病原体在临床上都很重要并会导致人类感染，但是各自引发的相关疾病的严重程度明显不同。炭疽芽胞杆菌是人畜共患和致命疾病炭疽的病原体。蜡样芽胞杆菌引起食源性胃肠炎和机会性感染。它们形成芽胞后能够抵抗极端的环境条件，在环境中广泛分布。炭疽芽胞杆菌时常会爆发小规模炭疽疫情，而蜡样芽胞杆菌也经常会引起医疗器械污染和食物中毒。因而，由蜡样芽胞杆菌家族引起的感染，在临床上未鉴定清楚病原体初次启用β-内酰胺类抗菌药物治疗时应谨慎。随着分离菌株的越来越多和测序技术的迅速发展，蜡样芽胞杆菌家族基因组文库变得更加复杂。NCBI中的炭疽芽胞杆菌基因组数据库包含了一些非炭疽芽胞杆菌基因组数据，该数据来自简单的序列比对，类炭疽芽胞杆菌的蜡样芽胞杆菌很容易混入炭疽芽胞杆菌基因组数据库中，误导相关人员进行后续分析。迫切需要一个明确快速高效的从蜡样芽胞杆菌家族中区分炭疽芽胞杆菌的方法。
发明内容
为了有效的解决上述技术问题，本发明提供了一种基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法。
第一方面，本发明要求保护特定物质在如下任一中的应用：
P1、鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌；
P2、制备用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的产品；
P3、检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌；
P4、制备用于检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌的产品。
所述特定物质为能够用于检测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中如下8个位点核苷酸多态性的物质：
(1)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4564265位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为A；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为G；
(2)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5015039位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为C；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为T；
(3)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5014970位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为C；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为A；
(4)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第3810008位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为T；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为C；
(5)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第109410位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为T；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为C；
(6)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第1491472位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为A；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为C；
(7)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4861968位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为G；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为T或者A；
(8)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5207983位核苷酸；
该位置，炭疽芽胞杆菌为G；炭疽芽胞杆菌近源菌(蜡样芽胞杆菌和/或苏云金芽胞杆菌)为A。
其中，所述特定物质可为任何能够检测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中所述(1)-所述(8)所示8个位点中全部或部分的核苷酸多态性的任何物质，如引物和/或探针。
在本发明中，所述特定物质为用于检测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中所述(1)-所述(8)所示8个位点中全部或部分的核苷酸多态性的探针或探针组。
进一步地，所述特定物质为8个探针中的全部或部分；所述8个探针分别用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌的基因组中所述(1)-所述(8)所示8个位点的核苷酸。
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第4564265位核苷酸A的探针记为探针1；所述探针1(BaID_eProbe01)为SEQ ID No.1所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5015039位核苷酸C的探针记为探针2；所述探针2(BaID_eProbe02)为SEQ ID No.2所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5014970位核苷酸C的探针记为探针3；所述探针3(BaID_eProbe03)为SEQ ID No.3所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第3810008位核苷酸T的探针记为探针4；所述探针4(BaID_eProbe04)为SEQ ID No.4所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体正链的第109410位核苷酸T的探针记为探针5；所述探针5(BaID_eProbe05)为SEQ ID No.5所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体正链的第1491472位核苷酸A的探针记为探针6；所述探针6(BaID_eProbe05)为SEQ ID No.6所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第4861968位核苷酸G的探针记为探针7；所述探针7(BaID_eProbe05)为SEQ ID No.7所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5207983位核苷酸G的探针记为探针8；所述探针8(BaID_eProbe05)为SEQ ID No.8所示单链DNA。
根据需要，上述各探针上还可标记荧光基团。
第二方面，本发明要求保护一种检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌的方法。
本发明要求保护的检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌的方法，可包括如下步骤：
(A1)检测所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中如下8个位点中的全部或部分的核苷酸多态性：
(1)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4564265位核苷酸；
(2)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5015039位核苷酸；
(3)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5014970位核苷酸
(4)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第3810008位核苷酸
(5)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第109410位核苷酸
(6)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第1491472位核苷酸；
(7)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4861968位核苷酸；
(8)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5207983位核苷酸。
(A2)根据(A1)所得结果按照如下确定所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌：若所述(1)-所述(8)所示的8个位点的核苷酸多态性中至少有一个与相应的炭疽芽胞杆菌判定标准相符，则所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株为或候选为炭疽芽胞杆菌(只要有任何一个检出，就可以确定为炭疽芽胞杆菌，多个SNP位点能够保证在测序质量较差的情况下或者部分位点发生变异(人为的或自然发生的)的情况下依然能够对炭疽杆菌进行准确快速鉴定，相符的个数越多，判定为炭疽芽胞杆菌的准确率越高)；若所述(1)-所述(8)所示的8个位点的核苷酸多态性无一与相应的所述炭疽芽胞杆菌判定标准相符，则所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株不为炭疽芽胞杆菌。
所述炭疽芽胞杆菌判定标准如下：
(a1)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4564265位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为A；
(a2)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5015039位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为C；
(a3)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5014970位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为C；
(a4)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第3810008位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为T；
(a5)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第109410位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为T；
(a6)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)正链的第1491472位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为A；
(a7)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第4861968位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为G；
(a8)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)负链的第5207983位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为G。
在第二方面所述方法的步骤(A1)，可采用下文第三方面所述探针组或第五方面所述探针或第六方面所述试剂盒(本质为前文所述特定物质)完成检测。
所述方法可为非疾病诊断治疗性方法。
第三方面，本发明要求保护一种探针组。
本发明所要求保护的探针组可用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌，具体可由如下8个探针中的全部或部分组成；所述部分为2个以上；
探针1(BaID_eProbe01)：SEQ ID No.1所示单链DNA；
探针2(BaID_eProbe02)：SEQ ID No.2所示单链DNA；
探针3(BaID_eProbe03)：SEQ ID No.3所示单链DNA；
探针4(BaID_eProbe04)：SEQ ID No.4所示单链DNA；
探针5(BaID_eProbe05)：SEQ ID No.5所示单链DNA；
探针6(BaID_eProbe06)：SEQ ID No.6所示单链DNA；
探针7(BaID_eProbe07)：SEQ ID No.7所示单链DNA；
探针8(BaID_eProbe08)：SEQ ID No.8所示单链DNA。
第四方面，本发明要求保护一种探针。
本发明所要求保护的探针可用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌，具体可为如下8个探针中的任意一个；
探针1(BaID_eProbe01)：SEQ ID No.1所示单链DNA；
探针2(BaID_eProbe02)：SEQ ID No.2所示单链DNA；
探针3(BaID_eProbe03)：SEQ ID No.3所示单链DNA；
探针4(BaID_eProbe04)：SEQ ID No.4所示单链DNA；
探针5(BaID_eProbe05)：SEQ ID No.5所示单链DNA；
探针6(BaID_eProbe06)：SEQ ID No.6所示单链DNA；
探针7(BaID_eProbe07)：SEQ ID No.7所示单链DNA；
探针8(BaID_eProbe08)：SEQ ID No.8所示单链DNA。
第五方面，本发明要求保护一种试剂盒。
本发明所要求保护的试剂盒可用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌，具体可为含有前文第三方面中所述探针组或第四方面中所述探针的试剂盒。
第六方面，本发明要求保护一种鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的方法。
本发明所要求保护的鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的方法，可包括如下步骤：
(C1)采用前文第三方面中所述探针组或前文第四方面中所述探针与所述待测菌株的基因组进行杂交；
(C2)根据(C1)所得结果按照如下确定所述待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌：若所述8个探针中至少有一个与所述待测菌株的基因组杂交后有阳性信号，则所述待测菌株为或候选为炭疽芽胞杆菌；若所述8个探针与所述待测菌株的基因组杂交后均没有产生阳性信号，则所述待测菌株不为炭疽芽胞杆菌。
其中，所述待测菌株可为任意菌株，包括但不限于蜡样芽胞杆菌家族菌株(如炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌或苏云金芽胞杆菌)。
所述方法可为非疾病诊断治疗性方法。
本发明最初从管家基因、CRISPR位点和早先研究已报道的基因中筛选了18个基因座，用于区分蜡样芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌。从NCBI数据库下载了近2000株蜡样芽胞杆菌家族的基因组序列，分析了这18个基因座在这些基因组库中的分布以及核苷酸序列，遴选出8个针对炭疽芽胞杆菌特异的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)靶标。基于这8个SNP位点在其两侧碱基延伸构建出使用方便的电子探针(eProbe)，使用这8个eProbe鉴定了建库时的炭疽芽胞杆菌可疑菌株，临床中类炭疽蜡样芽胞杆菌以及基于毒力基因鉴定错误的蜡样芽胞杆菌，结果证实了这8个电子探针具有特异、准确、快速检测炭疽芽胞杆菌的实用性。这8个eProbe涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，可用于快速鉴定炭疽芽胞杆菌，从蜡样芽胞杆菌区分出炭疽芽胞杆菌对临床指导用药以及医学防护决策具有关键作用。
附图说明
图1为蜡样芽胞杆菌家族主要成员及各基因组状态。BA表示炭疽芽胞杆菌，BC表示蜡样芽胞杆菌，BT表示苏云金芽胞杆菌。未填充的条图表示物种完整的基因组，基因组已经拼接完成环状；斜线填充的条图代表基因组不完整，仍存在很多contigs。
图2为SNP位点在基因组中的位置。基因组圈图由外向里代表，红色字体外层碱基表示SNP碱基的改变信息；第二层数字绿色字体表示SNP在Bacillus anthracis AmesAncestor染色体中(NC_007530.fna)的位置；第三层字母蓝色字体表示SNP所在的基因座。图中SNP位置为在Bacillus anthracis Ames Ancestors染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)的位置。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定新方法的建立
一、方法
1、菌株的下载和初步筛选
在NCBI网站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载了截止到2020年8月10日已经公布基因组测序结果的蜡样芽胞杆菌所有菌株(主要是炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌)的基因组序列。为了获得可靠的炭疽芽胞杆菌基因数据库，本发明根据以下条件对下载的炭疽芽胞杆菌进行了初步筛选，筛选的方法包括：16S rRNA序列分析(>98.7％)，ANI(>96％)和dDDH(>70％)值的计算(Proposed minimal standards forthe use of genome data for the taxonomy of prokaryotes.Jongsik Chun,AharonOren,Antonio Ventosa,Henrik Christensen,David Ruiz Arahal,Milton S.da Costa,Alejandro P.Rooney,7Hana Yi,Xue-Wei Xu,Sofie De Meyer and MarthaE.Trujillo.Int J Syst Evol Microbiol 2018；68:461–466)以及基因plcR编码阅读框中第640位碱基的检测,在炭疽杆菌中plcR基因的640位核苷酸为“T”，而蜡样芽胞杆菌家族其它细菌中的plcR基因的640位核苷酸为“G”或“C”(Easterday,W.R.,et al.,Use of SingleNucleotide Polymorphisms in the plcR Gene for Specific Identification ofBacillus anthracis.Journal of Clinical Microbiology,2005.43(4):p.1995-1997.)。对应这些条件都不满足的“可疑炭疽杆菌”，继续进行是否含有pXO1、pXO2分析，如果不含有这两个质粒，进一步检测是否含有pagA，lef，cya，capA，capB和capC等炭疽杆菌的毒力基因。
2、基因座的选择及基因座中特异SNP分析
从蜡样芽胞杆菌家族的MLST位点的管家基因(glpF,gmk,ilvD,pta,purH,pyc,tpiA)，CRISPR位点基因(CRISPR2，3，5)以及早先研究报导过的用于鉴定的基因(rpoB，gyrA，gyrB，Ba813，plcR，ptsI，SG850，purA)。
将选择的基因座核苷酸序列在炭疽芽胞杆菌(BA)和蜡样芽胞杆菌(BC)，苏云金芽胞杆菌(BT)(后文中BC和BT合并简称为Bct)中进行各自blast比对，剔除核苷酸序列完全相同的基因，初步筛选合适的基因座用作后续靶标(剔除4个基因座)。
以炭疽芽胞杆菌标准菌株Ames_Ancestor的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)序列中选择的14个基因座的核苷酸序列为标准序列(参考序列)，通过本地blast(blast-2.7.1+)，与全部BA，BC和BT菌株进行比对，把这些菌株的14个基因座的核苷酸序列分别截取出来，构建比对序列(fasta格式)。
将这些序列导入mega软件(MEGA-X)进行比对分析，寻找能够区分炭疽芽胞杆菌与其近源菌株(Bct)的特异SNP位点，并确定这些SNP位点在参考序列中的位置。
3、“电子探针”(eProbe)的构造
以每个基因座鉴定到的SNP位点为基准，向上游截取24bp，向下游截取25bp，截取出一个50bp长度的“电子探针”，每一个“电子探针”(包含所有菌株的序列)构成的fasta格式文件，导入mega软件进行比对分析，如果这个标签在所有炭疽芽胞杆菌中都相同，在所有蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的菌株中至少有1个碱基(该SNP位点)与这个标签不同，我们就选取这个标签。通过调整上下游截取位置，我们获得了位于7个基因座中的8个炭疽芽胞杆菌特异的“电子探针”(eProbe_Ba)。
4、评价Ba“电子探针”
利用eProbe_Ba对下载的全部炭疽杆菌(包括在步骤1中剔除的12株可疑炭疽杆菌)、蜡样芽胞杆菌及苏云金芽胞杆菌进行鉴定，评价构建的Ba“电子探针”的准确性、灵敏性及鉴定每一株菌的耗时情况。
二、结果
1、菌株下载及炭疽杆菌可疑菌株剔除
截至2020年8月10日，在NCBI上共有252株炭疽芽胞杆菌全基因组序列，1118株蜡样芽胞杆菌全基因组序列，622株苏云金芽胞杆菌全基因组序列。这些菌株基因组测序完成状态不同，有的已经拼接成一个环状DNA，有的则还是很多contig的状态，有的甚至多达1500多个contig。为了方便识别，对菌株进行重新编号和命名。炭疽芽胞杆菌统一采用BAXXX，蜡样芽胞杆菌采用BCXXXX，苏云金芽胞杆菌采用BTXXX。
为了完成对炭疽芽胞杆菌的初步筛选，将其它251株菌株与作为标准菌株的炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)序列进行比较。在原核生物分类中，通常将97％的16S rRNA基因序列相似性作为同种物种定义的阈值。我们发现炭疽芽胞杆菌数据库中251个菌株的16S rRNA与炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株相似性均高于99％。每个新菌株与已公布基因组序列的菌株之间的平均核苷酸同一性(ANI)和数字DNA-DNA杂交(dDDH)值分别低于96％和70％，被视作细菌种类划分的标准。用这ANI和dDDH两个阈值判断后，我们的数据库中剔除了四个菌株(BA168_AFS095574,BA169_AFS081271,BA171_AFS057383和BA172_AFS029941，公开数据库菌株编号参考表1)。用其它251株菌与Ames Ancestor菌株染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)进行比较，基因plcR编码阅读框中第640位碱基为特异的“T”，否则该菌株不是炭疽杆菌被剔除。分析结果显示(公开数据库菌株编号参考表1)：BA052_MCCC_1A02161，BA053_MCCC_1A01412，BA126_RIT375，BA143_PFAB2，BA145_N1ZF-2，BA146_L19，BA150_F34和BA170_AFS072084在该位点为“G”；BA172_AFS029941在该位点为“C”；同时BA168_AFS095574，BA169_AFS081271和BA171_AFS057383这三株菌的plcR阅读框仅有前503bp有匹配，无法判断640位碱基的情况。基于上面的3个方法判断，我们暂时将12株可疑炭疽芽胞杆菌剔除，不进行后续SNP位点筛选分析。这些菌株包括(公开数据库菌株编号参考表1)：BA052_MCCC_1A02161，BA053_MCCC_1A01412，BA126_RIT375，BA143_PFAB2，BA145_N1ZF-2，BA146_L19，BA150_F34，BA168_AFS095574，BA169_AFS081271，BA170_AFS072084，BA171_AFS057383，和BA172_AFS029941。将剩余的240株炭疽芽胞杆菌，用来进行炭疽芽胞杆菌特异SNP位点建库分析(暂时把这240株炭疽芽胞杆菌称为“确定的炭疽芽胞杆菌”，把这暂时剔除的12株炭疽芽胞杆菌称为“可疑的炭疽芽胞菌”)。蜡样芽胞杆菌家族主要成员及各基因组状态如图1所示。
表1、炭疽芽胞杆菌Assembly ID及重命名对应表
Figure BDA0002883560160000091
Figure BDA0002883560160000101
Figure BDA0002883560160000111
Figure BDA0002883560160000121
2、基因座选择以及其SNP特异性分析
(1)选择基因座(18个)
多位点序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，通过PCR扩增多个管家基因内部片段，测定其序列，分析菌株的变异，从而进行分型。利用CRISPR位点可以进行细菌分型，因而本发明收集了MLST基因座，以及CRISPR基因座，还有一些研究报导过的基因座用作鉴定区别靶点，具体基因座见表2。
表2、本发明选择的18个基因座
Figure BDA0002883560160000122
Figure BDA0002883560160000131
注：表中的位置信息是指在Bacillus anthracis Ames Ancestors染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)中的位置。
用选取的18个基因座(ORF)与选取的BA，BC和BT的全基因组进行本地BLAST(blast-2.7.1+)，分析这些位点在这些菌株中总的分布情况。18个基因座在1980株菌(BA，BC，BT)中的分布情况，可以看出没有任何一个基因座(ORF)在所有菌株中都有分布；这些菌株中含有全部18个位点的菌株有1756株菌(其中BA＝234，BC＝909，BT＝613)。
(2)4个基因座核苷酸序列在部分BA，BC和BT菌株中完全相同
有一些蜡样芽胞杆菌及苏云金芽胞杆菌中基因组中的gmk,gyrB,pta,purH基因座与炭疽杆菌Ames_Ancestor株中对应基因座的核苷酸序列完全相同，这说明这几个基因座无法把炭疽芽胞杆菌与其近源菌株(蜡样芽胞杆菌BC和苏云金芽胞杆菌BT)(在后文中简写为Bct)分开，因而我们剔除这几个基因座。
(3)剔除6个基因座(crispR2，crispR3，glpF，gyrA，ilvD,ptsI)
分析发现crispR2，crispR3,glpF，gyrA,ilvD和ptsI这6个基因座，在炭疽芽胞杆菌中没有特异的SNP位点可以与近源的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌区分，因而在后续分析中剔除这6个基因座。
(4)8个基因座特异SNP分析
在Ba813、plcR、purA、pyc、rpoB、SG850和tpiA这7个位点中都发现了一个特异的SNP位点，在crispR5中发现了两个特异SNP位点，这些SNP位点都能够很好的把炭疽芽胞杆菌与近源菌株(蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌)区分开来(图2)。由于发现的plcR上的SNP位点与文献报道的完全相同，在本研究中只用来佐证其它发现位点的准确性，不在专利申请范围内，因而在后续分析中一直都包含了这个位点，但是在后续描述中不再出现plcR位点的名称，只描述本发明发现的新SNP位点。
选择的基因座在染色体上的分布情况，可以看出位于复制起始区两侧分布比较密集。
3、评估炭疽杆菌“电子探针”的特异高效性
为了更方便的使用这些炭疽杆菌特异SNP位点(7个基因座中的8个位点)来快速鉴定炭疽杆菌，本发明以这8个SNP为基础，构建了特异炭疽杆菌“电子探针”，具体如表3所示。
表3、本发明的8个特异性SNP的“电子探针”信息
Figure BDA0002883560160000141
注：表中SNP位置以及电子探针位置都是以炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体(GenBank：NC_007530，25-OCT-2020)作为标准，进行位置计数的。
以1992株Bact菌株(包括252株BA，1118株BC和622株BT)为测试集，使用这套探针进行查询和鉴定，检验这套炭疽杆菌特异“电子探针”(eProbe_Ba)的特异性和灵敏性。
使用本发明确定的8个eProbe_Ba(表3)对240株“确定的炭疽杆菌”进行查询，结果显示239株菌检测到全部检炭疽杆菌特异的8个eProbe_Ba，另外一株炭疽菌(BA140_20SD，表1)检测到了7个eProbe,炭疽杆菌电子探针BaID_eProbe04未检测到；而前面剔除的12株“可疑炭疽菌”及所有的Bct菌株都未能检测到任何一个炭疽杆菌特异电子标签，这也与我们前面的结果实相符合的。从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载了除BA，BC和BT以外的几千株Bacillus属的细菌基因组(见表4)运用电子探针进行查询，结果显示这些菌株中未能检测到任何一个炭疽杆菌特异电子探针，再次说明这些电子探针的特异性。
表4、芽胞杆菌菌种名称及菌种数目信息表(4947株)
Figure BDA0002883560160000142
Figure BDA0002883560160000151
注：Bacillus anthracis*表示可疑的炭疽芽胞杆菌。
上述结果表明：本发明提供的8个明确可靠的电子探针，可用于快速鉴定炭疽芽胞杆菌，从蜡样芽胞杆菌区分出炭疽芽胞杆菌对临床指导用药以及医学防护决策具有关键作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种基于染色体上特异SNP位点的炭疽芽胞杆菌鉴定方法
<130> GNCLN210052
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ccattgctaa tgtatgcgaa tttcaatttg ccaaatgaca atttaggttt 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
aggtgctgca aaggcaacga atgcctctgg taaaaaagct gatgacaaat 50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aacgagcacg acaccagaaa gtaacacaga agataagtct caaaaagaag 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
aatgccaggc ggacagtaca gtaatttaca acaacaagcg aaagtggttg 50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gtggtagaag gtgatgttga gctgcaatct attaagattt atgctcctga 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
agcgggtgta ggaaacggga aaacaattgt atatcttcta tatgcaattt 50
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
tccagctcta ttcttagagc gcctggtagc agcgactgaa ggaactgatt 50
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
atatgtatgt gatacgtctg ttgtgttaaa tgatgcatta gataacaatc 50

Claims (10)

1.特定物质在如下任一中的应用：
P1、鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌；
P2、制备用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的产品；
P3、检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌；
P4、制备用于检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌的产品；
所述特定物质为能够用于检测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中如下8个位点核苷酸多态性的物质：
(1)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4564265位核苷酸；
(2)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5015039位核苷酸；
(3)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5014970位核苷酸；
(4)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第3810008位核苷酸；
(5)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第109410位核苷酸；
(6)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第1491472位核苷酸；
(7)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4861968位核苷酸；
(8)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5207983位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述特定物质为用于检测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中所述(1)-所述(8)所示8个位点中全部或部分的核苷酸多态性的探针或探针组。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述特定物质为8个探针中的全部或部分；所述8个探针分别用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌的基因组中所述(1)-所述(8)所示8个位点的核苷酸；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第4564265位核苷酸A的探针记为探针1；所述探针1为SEQ ID No.1所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5015039位核苷酸C的探针记为探针2；所述探针2为SEQ ID No.2所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5014970位核苷酸C的探针记为探针3；所述探针3为SEQ ID No.3所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第3810008位核苷酸T的探针记为探针4；所述探针4为SEQ ID No.4所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体正链的第109410位核苷酸T的探针记为探针5；所述探针5为SEQ ID No.5所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体正链的第1491472位核苷酸A的探针记为探针6；所述探针6为SEQ ID No.6所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第4861968位核苷酸G的探针记为探针7；所述探针7为SEQ ID No.7所示单链DNA；
用于特异性鉴定炭疽芽胞杆菌基因组中染色体负链的第5207983位核苷酸G的探针记为探针8；所述探针8为SEQ ID No.8所示单链DNA。
4.一种检测或者辅助检测待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(A1)检测所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株的基因组中如下8个位点中的全部或部分的核苷酸多态性：
(1)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4564265位核苷酸；
(2)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5015039位核苷酸；
(3)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5014970位核苷酸；
(4)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第3810008位核苷酸；
(5)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第109410位核苷酸；
(6)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第1491472位核苷酸；
(7)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4861968位核苷酸；
(8)对应于炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5207983位核苷酸；
(A2)根据(A1)所得结果按照如下确定所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株是否为炭疽芽胞杆菌：若所述(1)-所述(8)所示的8个位点的核苷酸多态性中至少有一个与相应的炭疽芽胞杆菌判定标准相符，则所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株为炭疽芽胞杆菌；若所述(1)-所述(8)所示的8个位点的核苷酸多态性无一与相应的所述炭疽芽胞杆菌判定标准相符，则所述待测蜡样芽胞杆菌家族菌株不为炭疽芽胞杆菌；
所述炭疽芽胞杆菌判定标准如下：
(a1)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4564265位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为A；
(a2)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5015039位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为C；
(a3)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5014970位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为C；
(a4)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第3810008位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为T；
(a5)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第109410位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为T；
(a6)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体正链的第1491472位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为A；
(a7)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第4861968位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为G；
(a8)针对炭疽芽胞杆菌Ames Ancestor株的染色体负链的第5207983位核苷酸；
所述炭疽芽胞杆菌的判定标准为：该位置核苷酸为G。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：权利要求4中的步骤(A1)是采用权利要求6所述探针组或权利要求7所述探针或权利要求8所述试剂盒完成检测的。
6.探针组，由如下8个探针中的全部或部分组成；所述部分为2个以上；
探针1：SEQ ID No.1所示单链DNA；
探针2：SEQ ID No.2所示单链DNA；
探针3：SEQ ID No.3所示单链DNA；
探针4：SEQ ID No.4所示单链DNA；
探针5：SEQ ID No.5所示单链DNA；
探针6：SEQ ID No.6所示单链DNA；
探针7：SEQ ID No.7所示单链DNA；
探针8：SEQ ID No.8所示单链DNA。
7.探针，为如下8个探针中的任意一个；
探针1：SEQ ID No.1所示单链DNA；
探针2：SEQ ID No.2所示单链DNA；
探针3：SEQ ID No.3所示单链DNA；
探针4：SEQ ID No.4所示单链DNA；
探针5：SEQ ID No.5所示单链DNA；
探针6：SEQ ID No.6所示单链DNA；
探针7：SEQ ID No.7所示单链DNA；
探针8：SEQ ID No.8所示单链DNA。
8.含有权利要求6所述探针组或权利要求7所述探针的试剂盒。
9.一种鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的方法，包括如下步骤：
(C1)采用权利要求6所述探针组或权利要求7所述探针与所述待测菌株的基因组进行杂交；
(C2)根据(C1)所得结果按照如下确定所述待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌：若所述8个探针中至少有一个与所述待测菌株的基因组杂交后有阳性信号，则所述待测菌株为或候选为炭疽芽胞杆菌；若所述8个探针与所述待测菌株的基因组杂交后均没有产生阳性信号，则所述待测菌株不为炭疽芽胞杆菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述待测菌株为任意菌株，包括但不限于蜡样芽胞杆菌家族菌株；
所述蜡样芽胞杆菌家族菌株为炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌或苏云金芽胞杆菌。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136443A (zh) * 2021-05-08 2021-07-20 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法
CN113444817A (zh) * 2021-05-12 2021-09-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法
CN113462799A (zh) * 2021-08-05 2021-10-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040253619A1 (en) * 2002-12-06 2004-12-16 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bacterial bioagents
US20060223084A1 (en) * 2004-12-06 2006-10-05 Bioveris Corporation Methods and compositions for detecting Bacillus anthracis
US20090220951A1 (en) * 2007-01-05 2009-09-03 Katherine Wheeler Methods and compositions for classifying bacillus bacteria
CN109234419A (zh) * 2018-11-30 2019-01-18 王素华 炭疽杆菌双重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040253619A1 (en) * 2002-12-06 2004-12-16 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bacterial bioagents
US20060223084A1 (en) * 2004-12-06 2006-10-05 Bioveris Corporation Methods and compositions for detecting Bacillus anthracis
US20090220951A1 (en) * 2007-01-05 2009-09-03 Katherine Wheeler Methods and compositions for classifying bacillus bacteria
CN109234419A (zh) * 2018-11-30 2019-01-18 王素华 炭疽杆菌双重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGREN, JOAKIM; HAMIDJAJA, RADITIJO A.; HANSEN, TRINE; 等.: "In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences", 《VIRULENCE》 *
PRIEST, FG; BARKER, M; BAILLIE, LWJ; 等.: "Population Structure and Evolution of the Bacillus cereus Group", 《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》 *
高志奇;王东澍;冯尔玲；等: "炭疽芽胞杆菌中CRISPR位点", 《微生物学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113136443A (zh) * 2021-05-08 2021-07-20 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法
CN113136443B (zh) * 2021-05-08 2021-12-21 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种快速鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的核酸检测方法
CN113444817A (zh) * 2021-05-12 2021-09-28 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于CRISPR-Cas12a系统的炭疽芽胞杆菌检测方法
CN113462799A (zh) * 2021-08-05 2021-10-01 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法
CN113462799B (zh) * 2021-08-05 2023-06-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法

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