CN112646873B

CN112646873B - 一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用

Info

Publication number: CN112646873B
Application number: CN202011589566.4A
Authority: CN
Inventors: 申定珠; 陈川; 贾庆玲; 闫黎; 曹慧; 贺平一; 邢三丽; 黄研
Original assignee: SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Current assignee: SHANGHAI GERIATRIC INSTITUTE OF CHINESE MEDICINE
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112646873A

Abstract

本发明提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明所述试剂中包括扩增mmu_circRNA_29850的引物对。本发明所述mmu_circRNA_29850可作为动脉粥样硬化的潜在作用靶点，为诊断动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点，也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段。

Description

一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药术领域，具体涉及一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用。

背景技术

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是缺血性心脑血管病的主要病理基础。CircRNA是具有共价闭合的内源非编码RNA循环结构，广泛参与了心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和癌症等各种疾病。已有研究表明，circRNA在AS中起着关键作用。但是，circRNA的功能及其在AS中的作用尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用，所述试剂为诊断动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点，也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂，所述试剂中包括扩增mmu_circRNA_29850的引物对，所述mmu_circRNA_29850的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述mmu_circRNA_29850的调控靶点为Scp2，所述Scp2的氨基酸或核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选的，扩增所述Scp2的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明还提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂盒，所述试剂盒中包括上述试剂。

本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物能够促进所述mmu_circRNA_29850的基因表达，或抑制所述mmu_circRNA_29850的靶点Scp2的基因表达。

本发明提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂，所述试剂中包括扩增mmu_circRNA_29850的引物对。本发明所述mmu_circRNA_29850是AS的潜在作用靶点，为诊断动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点，也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段。本发明实施例中，通过芯片微阵列筛选了AS的CircRNA表达谱，生物信息学分析以预测差异表达的CircRNA的潜在生物功能。根据ceRNA网络，对差异表达的CircRNA和mRNA进行qRT-PCRR或Western blot验证，为circRNA在AS发病机理中的分子机制提供了较新证据，提示mmu_circRNA_29850是AS的潜在作用靶点。基于David数据库Go、KEGG分析结果，选择3个差异表达的mRNA：Scp2、Hmgcs2、Pld1行qRT-PCR验证，Scp2在M组小鼠主动脉组织中表达上调(P<0.01)，Hmgcs2、Pld1无明显差异(P＞0.05)；Western blot结果进一步表明Scp2在M组表达上调(P<0.05)，提示Scp2是mmu_circRNA_29850的调控靶点。

附图说明

图1为HE、油红O染色结果图，其中图1A为小鼠主动脉窦HE染色图(40×、100×、200×，n＝3)；图1B为小鼠主动脉窦油红O染色图(40×)；

图2为从小鼠主动脉组织中鉴定出的73个circRNA的分布图，其中A为结构分布图，B为染色体分布图；

图3为circRNA标准化后数据强度分布图；

图4为circRNA标准化后双聚类分析图；

图5为ceRNA网络，该网络内包含了5个circRNAs，13条miRNAs和61条mRNAs；

图6为M组与C组相比，差异表达circRNA的qRT-PCR，*P<0.05；

图7为mRNA的GO和KEGG通路分析，其中图7A为选定的10个生物进程；图7B选定的10种细胞成分；图7C为选定的10种分子功能；图7D为选定的10种KEGG通路；

图8为M组相对于C组的差异表达mRNA的qRT-PCR结果图，**P<0.01；

图9为M组相对于C组的差异表达mRNA的Western blot结果图，*P<0.05。

具体实施方式

本发明提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂，所述试剂中包括扩增mmu_circRNA_29850的引物对，所述mmu_circRNA_29850的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：GTGATGGATGTGGACACACTGTACTAGGCCCTGAGAGTGGAACCCTTACATCCATCAACTACCCACATACCTATCCTAACAGCACTGTGTGTGAATGGGAGATTCGAGTCAGGACGGGAGAAAGGATTCGCATCAAATTCGGTGACTTTGACATTGAAGATTCTGATTATTGTCACCTTAATTACCTGAAAATCTTTAATGGAATTGGAGTCAGCAGAACGGAAATAGGCAAATACTGTGGTCTGGGTTTACAAATGAATCAGTCAATTGAGTCCAAAGGCAGTGAAGTCACAGTGCTGTTCATGAGTGGAACCCATGCTGCTGGGCGAGGATTTTTGGCTTCATACTCAGTTATAGATAAAGAAGATTTAATCACTTGTTTGGATACTGTATCTAATTTTTTGGAACCAGAGTTCAGTAAGTACTGCCCAGCTGGCTGTCTTTTGCCTTTTGCTGAAATATCTGGAACAATTCCTCATGGATACAGAGATTCTTCACCATTGTGTATGGCTGGAATCCATGCAGGAGTAGTGTCAAACGTGCTGGGTGGCCAAATCAGCATTGTGATTAGCAAAGGGACCCCATATTATGAAAGCTCTTTGGCCAACAATGTCACTTCCACGGTGGGATACTTATCTGCAAGTCTGTTTACATTTAAGACAAGTGGTTGCTATGGGACTCTGGGGATGGAGTCTGGTGTGATTGCCGATCCCCAGATAACAGCATCGTCTGCACTGGAGTGGACTGACCACATGGGGCAGGAGAACAGCTGGACAGCGGAGAAGGCCAGGCTGAGAAAACCCGGGCCTCCCTGGGCTGCTTTTGCCACTGATGAGCATCAGTGGCTGCAGATAGACCTTAACAAGGAGAAGAAGATAACAGGTATCGTAACCACTGGGTCTACCATGATAGAACACAGTTACTATGTGTCTGCCTACAGAGTCCTGTACAGTGACGATGGGCAGAGATGGACTGTGTACAGAGAACCTGGTGTGGACCAGGACAAGATATTTCAAGGAAACAAAGATTATCACAAGGATGTTCGTAATAACTTTTTGCCACCAATTATTGCACGTTTCATTAGAGTGAACCCTGTCCAGTGGCAACAGAAAATTGCCATGAAAGTGGAACTGCTCGGATGTCAGTTTACTCTCAAAGGTCGCCTTCCAAAGCTTACTCCACCTCCTCGGAACGGCAATAACCTCAGAAATACTACAGCTCGTCCCAAACTAGGTAAAGGTCGTGCCCCTAAATTTACTCAAGTGCTCCAACCTCGAAGTAGGAATGAACTTCCTGTGCAGCCGGCGGAGACAACTACCACTCCTGATATAAAAAACACGACTGTAACTCCCAGTGTAACCAAAGATGTCGCACTGGCTGCCGTTCTGGTCCCTGTGCTGGTCATGGCCCTCACCACACTCATCCTCATTCTAGTGTGTGCTTGGCACTGGAGAAACAGGAAGAAGAAAACTGAAGGCGCCTATGATTTACCCCACTGGGATCGGGCAG。

本发明所述引物对优选包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示：5’CCCTCACCACACTCATCCTCAT3’，所述下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示：5’ACATCCATCACCTGCCCGA3’。在本发明中，所述mmu_circRNA_29850在模型组(M组)小鼠主动脉组织中表达下降(P<0.05)，提示mmu_circRNA_29850是AS的潜在作用靶点，可作为检测动脉粥样硬化的生物标志物；且所述mmu_circRNA_29850的调控靶点为Scp2，所述Scp2的氨基酸或核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示：GGCTTTGGTTCTGCAAAGCCTCAGTCTGTAGGAGACCTTCGCTGCTGGAGCCATGCCTTCTGTCGCTTTGAAATCTCCGCGCCTGCGCCGGGTGTTCGTGGTCGGCGTTGGCATGACCAAGTTCATGAAGCCTGGAGGTGAGAACTCAAGAGACTATCCTGATATGGCAAAGGAAGCAGGCCAGAAGGCATTGGAAGATGCACAGATCCCTTACTCCGCAGTGGAACAGGCATGCGTTGGCTATGTGTATGGTGATTCCACCAGTGGGCAGAGGGCTATCTATCATAGTTTGGGACTGACTGGCATTCCTATAATTAATGTCAACAATAACTGTTCTACTGGTTCGACTGCTTTGTTTATGGCCCATCAACTGATTCAAGGAGGCTTGGCAAATTGTGTGTTGGCTCTTGGGTTTGAGAAGATGGAGAGGGGATCCATTGGAACAAAATTCTCAGATCGGACCACTCCAACTGATAAACATATTGAAGTCTTGATCGATAAGTATGGATTGTCTGCACATCCGATTACTCCTCAGATGTTTGGGTATGCTGGGAAAGAACATATGGAAAAATATGGAACAAAAGTTGAACACTTTGCAAAAATTGGATGGAAAAATCATAAACACTCAGTTAATAACACGTATTCCCAGTTCCAAGATGAATACAGCTTAGAAGAAGTAATGAAATCAAAACCAGTTTTCGATTTTCTGACTATCTTGCAATGCTGCCCCACCTCAGATGGTGCCGCTGCCGCGATTCTGTCCAGCGAGGAGTTTGTGCAGCAGTACGGCCTGCAGTCCAAAGCGGTGGAGATTGTGGCCCAGGAGATGATGACTGACTTACCCAGTACGTTTGAAGAGAAAAGTATTATTAAAGTGGTTGGCTATGATATGAGTAAAGAAGCTGCCAGGAGATGCTATGAGAAGTCCGGCCTGACACCCAACGATGTCGACGTGATAGAGCTTCACGATTGCTTCTCTGTCAATGAACTCATCACTTACGAAGCACTGGGGCTCTGTCCAGAAGGACAAGGTGGAACCCTGGTGGACAGAGGGGACAACACTTACGGAGGAAAGTGGGTCATCAACCCTAGTGGAGGCCTCATCTCAAAGGGACACCCACTGGGCGCAACAGGTCTGGCTCAGTGCGCGGAGCTCTGCTGGCAGCTGAGAGGCGAAGCCGGAAAGAGGCAGGTTCCCGGGGCAAAGGTGGCTCTGCAGCACAATCTAGGCCTCGGAGGAGCTGTGGTTGTCACCCTCTACAGGATGGGTTTTCCCGAAGCTGCCAGCTCCTTCAGGACGCACCAGGTTTCAGCTGCTCCCACCAGCTCTGCAGGGGATGGATTCAAGGCAAACCTCGTCTTTAAGGAGATTGAGAAGAAGCTTGAAGAGGAAGGGGAACAGTTCGTGAAGAAAATCGGTGGCATTTTTGCCTTCAAAGTGAAAGATGGCCCTGGAGGCAAAGAAGCTACCTGGGTGGTGGATGTGAAGAATGGCAAAGGATCTGTGCTTCCCAATTCAGATAAGAAGGCTGACTGCACAATCACCATGGCCGACTCAGACTTGCTGGCTTTGATGACTGGAAAAATGAACCCTCAGTCGGCCTTCTTTCAAGGGAAACTGAAGATTGCTGGTAACATGGGACTGGCCATGAAACTACAGAACCTTCAGCTTCAGCCGGGCAAAGCTAAGCTGTGAGGAGTCCCTTTGGCAACCTCAGGACATCAAGATGAGATGTGTAGATAGGTAGAGATCCACGTCTCGTCGTCAGGGCTTAGACTGACACCTCCCGAATAGCATGAGATAGATTTGTTGCTAATTGGGTGTGGTCAATTGTGTTTCCCCGAAGCTGGGAGGTACATAGGGCCTCCCTGCCTGCACTGCTGCTTTGAGGACTTGCATTCTACTGTGCTTGATGAAGCTACTATGTCAATGATGGTTTGGGGTAAACTTGAGTTTCAGAATAAAATTCAGAACAGTAAAATC。

在本发明中，扩增所述Scp2的引物对的核苷酸序列优选包括上游引物和下游引物，其中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：5'CTACCTGGGTGGTGGATGTGA3'；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：5'TGATGTCCTGAGGTTGCCAAA3'。本发明实施例中，利用qRT-PCR验证，Scp2在M组小鼠主动脉组织中表达上调(P<0.01)；westernblot进一步验证Scp2在M组表达上调(P<0.05)，提示Scp2是所述生物标志物mmu_circRNA_29850的调控靶点。

本发明还提供了一种检测动脉粥样硬化的方法，利用所述引物对进行qRT-PCR，且在进行所述qRT-PCR时，优选以GAPDH为内参基因，所述内参基因的引物对包括上游引物(SEQ ID NO.7，5’CACTGAGCAAGAGAGGCCCTAT3’)和下游引物(SEQ ID NO.8，5’GCAGCGAACTTTATTGATGGTATT3’)。本发明所述qRT-PCR的体系优选以10μl计，优选包括2×MasterMix 5μl、10μM上游引物0.5μl、10μM下游引物0.5μl、cDNA 2μl和余量的水；所述qRT-PCR的程序优选包括：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s(收集荧光))，为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，优选按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.075℃/s)。

本发明还提供了一种检测动脉粥样硬化的试剂盒，所述试剂盒中包括上述试剂。本发明所述试剂盒中优选还包括2X PCR master mix(Arraystar)。利用本发明所述试剂盒在检测动脉粥样硬化时，其方法优选与上述相同，在此不再赘述。

本发明还提供了上述试剂或上述试剂盒在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。本发明为诊断动脉粥样硬化提供了新的分子标记(生物标志物，mmu_circRNA_29850)和干预靶点(Scp2)，也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段，即促进所述生物标志物的表达，和/或抑制Scp2的表达。

本发明还提供了一种治疗动脉粥样硬化的药物，所述药物中能够促进所述mmu_circRNA_29850的基因表达，或抑制所述mmu_circRNA_29850的靶点Scp2的基因表达。

下面结合实施例对本发明提供的一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中使用的原料、设备均为已知产品，且如非特殊说明，均通过市售途径获得。

在实施例中，数据统计采用SPSS21.0软件统计分析，Cytoscape3.6.1、Graph PadPrism 5、Adobe Illustrator CS5等软件作图，实验数据以均数±标准差

表示，两组间比较采用独立样本t检验分析。检验水准取双侧α＝0.05，P<0.05为差异具有统计学意义。

实施例1

1、实验动物无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级12周龄ApoE-/-雄性小鼠(动物许可证号：SCXK(京)2016-0006)与同品系、同周龄C57BL/6雄性小鼠(动物许可证号：SCXK(浙)2018-0001)均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。于上海中医药大学SPF级动物实验室单笼喂饲，环境温度(24±1)℃，相对湿度50％～70％，明暗交替周期12/12h。动物实验操作流程严格遵循上海中医药大学动物实验伦理委员会的相关法规和各项规定，并已通过上海中医药大学实验动物福利与伦理审查(伦理号：PZSHUTCM181130001)。

2、模型制备与分组12周龄雄性ApoE-/-小鼠12只，予普通小鼠饲料适应性喂养1周后，予以小鼠高脂饮食喂饲(Model组，M)。小鼠高脂饲料配方为：小鼠常规基础饲料+21％脂肪+0.5％胆固醇。12只同品系、同周龄C57BL/6小鼠作为正常对照组(Control组，C)，予以普通小鼠饲料喂饲。各组干预周期均为12周。

3、HE、油红O染色2％戊巴比妥钠麻醉小鼠，4％多聚甲醛灌注，取出心脏连同主动脉组织，置于10％福尔马林中保存，以备石蜡、冰冻切片之用，分别用于HE、油红O染色。小鼠主动脉窦HE染色图像由Olympus光学显微镜(BX51，Japan)采集，油红O染色图像通过Pannoramic MIDI(3D Histech，Hungary)采集。小鼠主动脉窦斑块面积比、红染脂质面积比采用Image Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，USA)软件统计，具体计算如下：斑块面积比＝斑块面积/主动脉窦管腔总面积；红染脂质面积比＝阳性染色面积/主动脉窦管腔总面积。

HE染色结果如图1A所示，正常组小鼠主动脉窦有较小面积AS斑块；与正常组比较，模型组小鼠主动脉窦AS斑块面积显著增大(P<0.01)。

油红O染色结果如图1B所示，正常组小鼠主动脉窦无明显红染脂质；与正常组比较，模型组小鼠主动脉窦红染脂质显著增加(P<0.01)。

4、总RNA分离和质量评估采用TRIzol LS Reagent(Invitrogen，USA)试剂提取正常组、模型组小鼠主动脉组织总RNA，使用NanoDrop ND-1000仪器(NanoDrop，USA)测定总RNA浓度和纯度，并采用变性琼脂糖凝胶电泳测试总RNA完整性。

5、RNA标记和circRNA微阵列杂交采用Rnase R(Epicentre，USA)消化总RNA以除去线性RNA并富集环状RNA。然后，利用随机引发方法(Arraystar Super RNALabeling Kit；Arraystar，USA)扩增富集的circRNA，并将其转录为荧光cRNA。标记的cRNA通过RNeasyMini Kit(Qiagen，Germany)纯化。利用NanoDrop ND-1000测量cRNA(pmol Cy3/μg cRNA)的浓度和比活性；在1μg标记的cRNA中加入5μl 10×封闭剂和1μl 25×裂解缓冲液使之片段化，60℃孵育30min后加入25μl 2×杂交缓冲液稀释标记的cRNA。将50μl杂交溶液加样到载玻片上，并将其放置于circRNA表达芯片载玻片上(8×15K，Arraystar，USA)。在AgilentHybridization Oven中65℃温育17小时)。使用Agilent Scanner G2505C洗涤，固定并扫描杂交的芯片。

6、CircRNA表达谱数据分析使用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1软件(Agilent santa clara，USA)读取原始数据，R software limma package对质控合格数据进行归一化处理。两组间显著差异的CircRNAs差异倍数定为Fold Change>1.5。通过分层聚类区分组间circRNAs差异表达，火山图鉴定其显著表达的circRNA。

6.1小鼠主动脉组织circRNA鉴定

从M组和C组中鉴定了73个circRNA(较之C组，M组circRNA上调23个，下调50个)。其中circRNA的结构分类如图2中A所示：包括55个exonic circRNA(75.34％)，6个introniccircRNA(8.22％)，9个sense overlapping circRNA(12.33％)，2个intergenic circRNA(2.74％)和1个antisense circRNA(1.37％)；染色体分布如图2中B所示，circRNA广泛分布在所有染色体中，大约13.70％，9.59％和8.22％分别来自chr5，chr11和chr8，而来自其他任何染色体的circRNA百分比均不到7％。

6.2小鼠主动脉circRNA差异表达分析

由于不同样本之间具有差异性，首先利用R语言将各组别小鼠主动脉组织中获得的circRNA芯片数据的原始表达值进行标准化，以箱图形式直观展示标准化后的数据强度分布规律，结果显示各组间强度分布接近(图3中A)。将标化后的基因芯片数据进行微阵列分析得到M组和C组的差异基因表达谱，双聚类分析结果如图4所示，较之C组，M组差异表达的circRNA共73个(上调23个，下调50个；纳入标准：P<0.05，Fold Change>1.5)，基于P值前10，分别列举10个上调、下调的circRNA(表1和表2)；对差异基因表达谱进行可视化展示，采用R语言对circRNA表达值分别进行散点分析、火山分布分析。其中，散点图如图3中B所示，绿线代表差异倍数，绿线以上与以下的点分别表示小鼠主动脉组织中上调1.5倍和下调1.5倍的circRNA；火山图如图3中C所示，两条绿色竖线分别表示circRNA上调1.5倍和下调1.5倍，绿色横线表示P值为0.05，红色方块表示统计显著性差异表达的基因。

表1 P值前10的上调的circRNA信息

表2 P值前10的下调的circRNA信息

7、ceRNAnetwork construction为识别预测的circRNA和miRNA相互作用，在TargetScan和miRanda算法的基础上应用Arraystar的内部miRNA目标预测软件。为了提高预测的可靠性，将上下文+得分设置为小于-0.5。然后，使用miRanda和TargetScan数据库预测潜在的miRNA靶标，并使用Cytoscape软件绘制DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA的ceRNA网络。

7.1根据RI值＞200，序列全长＜2000，genesymbol有无意义等选择5个差异表达的circRNA：mmu_circRNA_31968、mmu_circRNA_29850、mmu_circRNA_24182、mmu_circRNA_24070、mmu_circRNA_42391，通过Cytoscape 3.6.1软件构建ceRNA网络，如图5所示。

7.2同时，对上述5个差异表达的circRNA进行qRT-PCR验证，结果显示mmu_circRNA_29850在M组小鼠主动脉组织中表达下降(P<0.05)，提示mmu_circRNA_29850＝是AS的潜在作用靶点，其中qRT-PCR所用的引物信息如表3所示，表达量差异如图6所示。

表3 qRT-PCR所用的引物信息

8、mRNA GO、KEGG通路分析采用DAVID生物信息学资源(https://david.ncifcrf.gov，版本6.8)在GO级别和KEGG级别进行功能增强分析。

使用R语言进行Ce分析，基于David Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov)数据库对与mmu_circRNA_29850可能存在功能相关性的mRNA进行GO功能分析和KEGG通路富集途径分析，如图7所示，GO功能分析主要包含Biological Process(BP，图7A)、Molecular Function(MF，图7C)、Cellular Component(CC，图7B)。其中，GO-BP分类主要涉及metabolic process、lipid metabolic process、lipid catabolicprocess、phosphorylation等生物过程；GO-MF分类主要涉及proteinbinding、nucleotidebinding、ATP binding、catalytic activity等分子功能；GO-CC分类主要涉及cytoplasm、membrane、cytosol、nucleus等细胞成分；KEGG通路富集的分析主要集中于Metabolicpathways、Peroxisome、mTOR signaling pathway、Hypertrophic cardiomyopathy(HCM)等相关通路(图7D)。

9、验证选定的circRNA和mRNA基于p值、倍数变化、原始强度和类型组合选择circRNAs(mmu_circRNA_31968、mmu_circRNA_29850、mmu_circRNA_24182、mmu_circRNA_24070、mmu_circRNA_42391)，基于mmu01100 metabolic pathways选择mRNAs(Scp2、Hmgcs2、Pld1)，采用SYBR GreenPCR试剂盒(Arraystar，美国)对其进行三次qRT-PCR验证。

9.1实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用RNase-R(Epicentre，USA)在37℃下处理2μg总RNA 15min以去除线性转录本。使用PrimeScript RT MasterMix(Perfect Real Time，TaKaRa，Japan)将处理的2μg总RNA逆转录为同源cDNA，并使用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(TianGen，China)逆转录2μg总RNA。然后用EvaGreen qPCRMastermix-s(Abm，China)和LightCycler480 II系统(Roche，Swidish)通过qRT-PCR分析cDNA。GAPDH用作circRNA和mRNA内参，使用2^-ΔΔCT方法计算RNA的相对表达水平。

涉及到的mRNA的引物如表4所示，相对表达水平如图8所示，qRT-PCR结果显示Scp2在M组小鼠主动脉组织中表达上调(P<0.01)，而Hmgcs2、Pld1无明显差异(P>0.05)。

表4 mRNA实时荧光定量PCR所用的引物

9.2Western blot提取小鼠主动脉组织总蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE分离蛋白(80V，120min)，湿转法将蛋白转移至PVDF膜上(280mA，70min)，5％脱脂牛奶室温封闭2h，加入一抗工作液兔抗Scp2(58kDa，1：1000)，兔抗GAPDH(37kDa，1：3000)，4℃摇床孵育过夜。次日，加入HRP标记的对应二抗(1：1000)，室温孵育1h。参照TanonTM High-sig ECLWestern Blotting Substrate试剂盒说明书1:1混合A液与B液显影。Invitrogen iBright(FL1000，Thermo Fisher Scientific，USA)蛋白印迹智能成像系统扫描。采用Image J(National Institutes ofHealth，USA)分析蛋白条带的积分光密度值(IntegratedAbsorbance，IA＝平均光密度值×面积)，以目的蛋白IA/GAPDH IA比值反映目的蛋白表达水平。westernblot结果如图9所示，Scp2在M组表达上调(P<0.05)，结合qRT-PCR结果，Scp2可被认为是circRNA_29850的调控靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海市中医老年医学研究所

<120> 一种检测动脉粥样硬化的试剂及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 1

gtgatggatg tggacacact gtactaggcc ctgagagtgg aacccttaca tccatcaact 60

acccacatac ctatcctaac agcactgtgt gtgaatggga gattcgagtc aggacgggag 120

aaaggattcg catcaaattc ggtgactttg acattgaaga ttctgattat tgtcacctta 180

attacctgaa aatctttaat ggaattggag tcagcagaac ggaaataggc aaatactgtg 240

gtctgggttt acaaatgaat cagtcaattg agtccaaagg cagtgaagtc acagtgctgt 300

tcatgagtgg aacccatgct gctgggcgag gatttttggc ttcatactca gttatagata 360

aagaagattt aatcacttgt ttggatactg tatctaattt tttggaacca gagttcagta 420

agtactgccc agctggctgt cttttgcctt ttgctgaaat atctggaaca attcctcatg 480

gatacagaga ttcttcacca ttgtgtatgg ctggaatcca tgcaggagta gtgtcaaacg 540

tgctgggtgg ccaaatcagc attgtgatta gcaaagggac cccatattat gaaagctctt 600

tggccaacaa tgtcacttcc acggtgggat acttatctgc aagtctgttt acatttaaga 660

caagtggttg ctatgggact ctggggatgg agtctggtgt gattgccgat ccccagataa 720

cagcatcgtc tgcactggag tggactgacc acatggggca ggagaacagc tggacagcgg 780

agaaggccag gctgagaaaa cccgggcctc cctgggctgc ttttgccact gatgagcatc 840

agtggctgca gatagacctt aacaaggaga agaagataac aggtatcgta accactgggt 900

ctaccatgat agaacacagt tactatgtgt ctgcctacag agtcctgtac agtgacgatg 960

ggcagagatg gactgtgtac agagaacctg gtgtggacca ggacaagata tttcaaggaa 1020

acaaagatta tcacaaggat gttcgtaata actttttgcc accaattatt gcacgtttca 1080

ttagagtgaa ccctgtccag tggcaacaga aaattgccat gaaagtggaa ctgctcggat 1140

gtcagtttac tctcaaaggt cgccttccaa agcttactcc acctcctcgg aacggcaata 1200

acctcagaaa tactacagct cgtcccaaac taggtaaagg tcgtgcccct aaatttactc 1260

aagtgctcca acctcgaagt aggaatgaac ttcctgtgca gccggcggag acaactacca 1320

ctcctgatat aaaaaacacg actgtaactc ccagtgtaac caaagatgtc gcactggctg 1380

ccgttctggt ccctgtgctg gtcatggccc tcaccacact catcctcatt ctagtgtgtg 1440

cttggcactg gagaaacagg aagaagaaaa ctgaaggcgc ctatgattta ccccactggg 1500

atcgggcag 1509

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 2

ccctcaccac actcatcctc at 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 3

acatccatca cctgcccga 19

<210> 4

<211> 1984

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 4

ggctttggtt ctgcaaagcc tcagtctgta ggagaccttc gctgctggag ccatgccttc 60

tgtcgctttg aaatctccgc gcctgcgccg ggtgttcgtg gtcggcgttg gcatgaccaa 120

gttcatgaag cctggaggtg agaactcaag agactatcct gatatggcaa aggaagcagg 180

ccagaaggca ttggaagatg cacagatccc ttactccgca gtggaacagg catgcgttgg 240

ctatgtgtat ggtgattcca ccagtgggca gagggctatc tatcatagtt tgggactgac 300

tggcattcct ataattaatg tcaacaataa ctgttctact ggttcgactg ctttgtttat 360

ggcccatcaa ctgattcaag gaggcttggc aaattgtgtg ttggctcttg ggtttgagaa 420

gatggagagg ggatccattg gaacaaaatt ctcagatcgg accactccaa ctgataaaca 480

tattgaagtc ttgatcgata agtatggatt gtctgcacat ccgattactc ctcagatgtt 540

tgggtatgct gggaaagaac atatggaaaa atatggaaca aaagttgaac actttgcaaa 600

aattggatgg aaaaatcata aacactcagt taataacacg tattcccagt tccaagatga 660

atacagctta gaagaagtaa tgaaatcaaa accagttttc gattttctga ctatcttgca 720

atgctgcccc acctcagatg gtgccgctgc cgcgattctg tccagcgagg agtttgtgca 780

gcagtacggc ctgcagtcca aagcggtgga gattgtggcc caggagatga tgactgactt 840

acccagtacg tttgaagaga aaagtattat taaagtggtt ggctatgata tgagtaaaga 900

agctgccagg agatgctatg agaagtccgg cctgacaccc aacgatgtcg acgtgataga 960

gcttcacgat tgcttctctg tcaatgaact catcacttac gaagcactgg ggctctgtcc 1020

agaaggacaa ggtggaaccc tggtggacag aggggacaac acttacggag gaaagtgggt 1080

catcaaccct agtggaggcc tcatctcaaa gggacaccca ctgggcgcaa caggtctggc 1140

tcagtgcgcg gagctctgct ggcagctgag aggcgaagcc ggaaagaggc aggttcccgg 1200

ggcaaaggtg gctctgcagc acaatctagg cctcggagga gctgtggttg tcaccctcta 1260

caggatgggt tttcccgaag ctgccagctc cttcaggacg caccaggttt cagctgctcc 1320

caccagctct gcaggggatg gattcaaggc aaacctcgtc tttaaggaga ttgagaagaa 1380

gcttgaagag gaaggggaac agttcgtgaa gaaaatcggt ggcatttttg ccttcaaagt 1440

gaaagatggc cctggaggca aagaagctac ctgggtggtg gatgtgaaga atggcaaagg 1500

atctgtgctt cccaattcag ataagaaggc tgactgcaca atcaccatgg ccgactcaga 1560

cttgctggct ttgatgactg gaaaaatgaa ccctcagtcg gccttctttc aagggaaact 1620

gaagattgct ggtaacatgg gactggccat gaaactacag aaccttcagc ttcagccggg 1680

caaagctaag ctgtgaggag tccctttggc aacctcagga catcaagatg agatgtgtag 1740

ataggtagag atccacgtct cgtcgtcagg gcttagactg acacctcccg aatagcatga 1800

gatagatttg ttgctaattg ggtgtggtca attgtgtttc cccgaagctg ggaggtacat 1860

agggcctccc tgcctgcact gctgctttga ggacttgcat tctactgtgc ttgatgaagc 1920

tactatgtca atgatggttt ggggtaaact tgagtttcag aataaaattc agaacagtaa 1980

aatc 1984

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 5

ctacctgggt ggtggatgtg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 6

tgatgtcctg aggttgccaa a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 7

cactgagcaa gagaggccct at 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 8

gcagcgaact ttattgatgg tatt 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 9

atggaccccc acatctttgc 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 10

tccccttctt tgtagtcctt ggtt 24

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 11

gctcacactg ccaacttcct 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 12

ccaagtcaag gatgtagaca cca 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 13

gcgatcggat ggtcatctac tt 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 14

tggttcatga aacatggggc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 15

tgatgtcgct cacatctagg ct 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 16

atcagtccat cctccgatac ga 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 17

caaggactgg gttcaactgg a 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 18

gctgtcgctt gagactttgg ta 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 19

catagatacc accaacgcct gt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequences)

<400> 20

gcatagcgac catcccagta g 21

Claims

1.一种检测动脉粥样硬化的试剂在制备诊断动脉粥样硬化的产品中的应用，其特征在于，所述试剂中包括扩增mmu_circRNA_29850的引物对，所述mmu_circRNA_29850的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。