CN112601540A

CN112601540A - 用于降低细胞中的脂质含量的生物制药剂

Info

Publication number: CN112601540A
Application number: CN201980055207.XA
Authority: CN
Inventors: 斯蒂芬·弗朗茨·托马斯·韦斯; 蒂龙·查德·奥德高; 埃洛伊丝·范德梅尔韦; 马丁·伯纳特; 加文·莫里斯
Original assignee: University of the Witwatersrand, Johannesburg
Current assignee: University of the Witwatersrand, Johannesburg
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2019-07-08
Publication date: 2021-04-02
Also published as: US20210277084A1; EP3817764A2; WO2020008442A2; EP3817764B1; ZA202100684B; WO2020008442A3

Abstract

本公开涉及用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，所述生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段。生物制药剂能够被官能化或非官能化的纳米颗粒包封，并且进一步能够被配制成包括载体以提供用于亲代或非亲代给药的药物组合物。在使用时，生物制药剂降低靶细胞中的脂质含量。本公开还涉及降低人或动物受试者的靶细胞中的脂质浓度的方法。

Description

用于降低细胞中的脂质含量的生物制药剂

技术领域

本公开涉及降低人或动物受试者的靶细胞中的脂质浓度的方法。本公开扩展到生物制药剂在治疗和/或预防人或动物受试者中的动脉粥样硬化和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病中的用途，该生物制药剂包括(i)37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，或(ii)用于表达LRP/LR的转染剂。在使用时生物制药剂的给药降低靶细胞处的脂质含量。

背景技术

动脉粥样硬化为涉及动脉阻塞的慢性进行性疾病，并且为心血管疾病(CVD)的主要形式。其为动脉粥样硬化斑块形成的结果，动脉粥样硬化斑块闭塞动脉并减少流向重要器官的血液。

动脉粥样硬化受氧化应激的影响极大，其中活性氧物种(ROS)在很大程度上有助于机体的氧化状态。ROS为在各种细胞过程(诸如细胞呼吸)期间形成的。它们是在氧分子失去电子时产生的，这使得它们容易参与氧化反应，并且从而有助于氧化应激(Chen等人，2003年)。ROS容易与低密度脂蛋白(LDL)反应形成氧化LDL(oxLDL)，这是一种与导致动脉粥样硬化斑块形成的炎症反应有关的分子(Grahame和Schlesinger，2012年)。

随着时间的推移，斑块的积聚使血管变窄并闭塞动脉，导致心脏泵送更困难，从而导致组织损坏和高血压(Tedgui和Mallat，1999年)。此外，这些斑块由于其柔软的细胞外脂质组分而易于破裂。当这些斑块破裂时，它们可导致血管完全闭塞，从而导致重大心血管事件，诸如心肌梗塞或脑血管疾病(Tedgui和Mallat，1999年)。

动脉粥样硬化为心血管相关死亡的主要原因，其中目前的治疗方法(诸如ACE抑制剂和β-受体阻滞剂)旨在通过减少由血管闭塞引起的高血压来降低心肌压力(Conte等人，2015年)。然而，目前的治疗方法并不旨在去除导致闭塞的动脉粥样硬化斑块，目前对动脉粥样硬化的唯一治疗为冠状动脉旁路或动脉扩张，这两者均是高度侵入性的。用降低血压的药物治疗动脉粥样硬化可防止器官获得足够的氧气和营养，因为斑块会防止足够的血液流动，从而可导致最终的器官衰竭(Conte等人，2015年)。此外，在这些斑块爆裂的事件中，可发生一个或多个血管的完全闭塞，并且根据位置的不同，可导致重大心血管事件，诸如心肌梗塞和脑血管事件。

因此，需要将减少和/或防止斑块的形成的新的创新。

动脉粥样硬化通常与肥胖症、胰岛素抵抗和/或糖尿病共病。富含脂质的饮食通常起主要促进作用。典型地，由于线粒体损伤，在肥胖症患者体内出现ROS水平增加。

导致这种胰岛素抵抗的分子机制为由脂肪组织触发的，脂肪组织在肥胖个体中具有代谢活性，从而持续进行脂肪分解并产生游离脂肪酸(FFA)(Gavin等人，2017年)。这些FFA充当胰岛素的拮抗剂(Salpea，2010年)，并且刺激肝脏产生葡萄糖，同时抑制骨骼肌对葡萄糖的摄取。增加的FFA水平降低骨骼肌细胞和肝细胞中的线粒体β-氧化。线粒体β-氧化减少导致二酰甘油(DAG)和长链酰基辅酶A(LCCoA)的积聚(Savage等人，2007年；Salpea，2012年)。这继而诱导IRS-1位点的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而抑制IRS-1磷酸化和3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)信号的激活。PI3P调节葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的合成(Savage等人，2007年；Salpea，2012年)。因此，抑制骨骼中PI3P的激活导致GLUT4合成减少，并且从而减少骨骼肌对葡萄糖的摄取。肝细胞中PI3P激活的抑制导致叉头框蛋白O(FOXO)磷酸化的减少，这继而导致肝糖异生的增加(Savage等人，2007年)。肥胖个体中FFA的增加导致高血糖症，并且诱导II型糖尿病患者体内出现胰岛素抵抗(Gavin，2017年；Mejia，2006年)。这些细胞改变促进肝脏和骨骼肌中特定脂质代谢物(二酰甘油和/或神经酰胺)的积聚，并且已发现糖尿病患者体内细胞的脂质含量增加，这也与胰岛素抵抗相关联(Gavin等人，2017年)

目前的II型糖尿病治疗方案针对血糖，而不是由长期胰岛素水平升高引起的胰岛素信号传导受损(Ford，2010年)。因此，需要针对受损胰岛素信号传导的新的创新。

本公开寻求改进现有技术中已知的缺点。

发明内容

根据本公开的第一方面，提供一种降低人或动物受试者的靶细胞中的脂质浓度的方法，该方法包含以下步骤：

(i)转染细胞以产生37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段；或者

(ii)向细胞提供LRP/LR和/或其片段，

其中细胞中的脂质浓度的降低治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病。

转染的步骤可包括包封用于位点特异性递送至细胞的转染剂，并且提供的步骤可包括包封用于位点特异性递送至细胞的LRP/LR。

转染剂和/或LRP/LR和/或LRP/LR的片段为生物制药剂。

包封可借助于纳米颗粒来形成用于转染剂和/或LRP/LR的递送工具。纳米颗粒可用化学、生物化学或生物部分官能化以确保位点特异性递送至细胞。

这些部分可充当配体以确保在细胞处的位点特异性递送。

细胞可为但不限于以下组中的至少一种：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞。

递送工具可被配制成药物组合物，该药物组合物可进一步包括用于对受试者胃肠外或非胃肠外给药的药物载体。

非胃肠外给药可包括但不限于以下组中的至少一种：口服、鼻内、直肠、阴道、光学和透皮给药。典型地，非胃肠外给药可为口服。胃肠外给药可包括静脉内、皮下和肌肉内给药中的至少一种。典型地，胃肠外给药可为静脉内给药。

药物组合物可进一步包括抗氧化剂，使得在靶细胞处使用时抗氧化剂清除活性氧物种。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

受试者可为人、动物、爬行动物、鸟类或两栖动物。典型地，受试者可为人和/或动物，优选地为人。

转染剂可为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

LRP/LR可包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表或其片段。

SEQ ID NO:1可为人LRP/LR的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：MSGALDVLQMKEEDVLKFLAAGTHLGGTNLDFQMEQYIYKRKSDGIYIINLKRTWEKLLL

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SEQ ID NO:2可为小鼠(小家鼠(Mus musculus))LRP/LR的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：

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应理解，LRP/LR为高度保守的，并且为了实施在此描述、说明和/或例示的本发明，还可利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的同源物或片段，和/或片段的同源物。

LRP/LR可包含肽/蛋白质序列表，其与如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的序列或其片段具有至少80％的同源性。

LRP/LR可包含其同源物或片段，以及片段的同源物，其中LRP/LR可包含如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表。

LRP/LR的肽/蛋白质序列或者其同源物或片段，或片段的同源物，可与附加的蛋白质序列、氨基酸序列、肽、蛋白质或抗体结合、或键合、或连接、或缀合或相关联。另选地和/或附加地，LRP/LR的肽/蛋白质序列可形成更大和/或更长的肽/蛋白质序列的一部分。在本发明的特定实施方案中，LRP/LR可可与FLAG蛋白结合、或键合、或连接、或缀合或相关联，使得在使用时，LRP/LR可用FLAG标记。FLAG蛋白可包括肽/蛋白质序列，其至少包括序列基序DYKDDDDK(SEQ ID NO:3)。对于本公开的所有实施方案，除了FLAG之外，还设想其它标志蛋白。

应理解，转染细胞以产生37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或片段的步骤可经由本领域已知的程序进行，包括将转染剂引入细胞中。转染细胞的步骤可上调LRP/LR，以导致LRP/LR的过表达。

肽/蛋白质序列表的片段的示例实施方案被例示为对应于SEQ ID NO:1的102至295的片段的SEQ ID NO:4和/或对应于SEQ ID NO:2的102至295的片段的SEQ ID NO:5。

SEQ ID NO:4可为人LRP/LR的片段的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：

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SEQ ID NO:5可为小鼠LRP/LR的片段的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：

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方法通常扩展到上调靶细胞中的LRP/LR表达。

根据本公开的第二方面，提供用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，该生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药。在使用时生物制药剂的给药降低靶细胞中的脂质含量。

LRP/LR可被包封到递送工具中。

递送工具可包括纳米颗粒。纳米颗粒可用化学、生物化学或生物部分官能化以确保位点特异性递送至靶细胞。

这些部分可充当配体以确保在靶细胞处的位点特异性递送。

靶细胞可为但不限于以下组中的至少一种：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

LRP/LR可包含如上文第一和第二方面中列出的如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表或其片段。

根据本公开的第三方面，提供一种生物制药剂，该生物制药剂包括用于表达37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的转染剂，该转染剂用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病，其中转染剂用于对有此需要的受试者的靶细胞给药。

转染剂可被包封到递送工具中。

这些部分可充当配体以确保在靶细胞处的位点特异性递送。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

转染剂可为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

根据本公开的第四方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含用于37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的转染剂和载体，该药物组合物用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病，其中LRP/LR和/或其片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药。

其中LRP/LR被包封的药物组合物提供递送工具。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

根据本公开的第五方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含用于表达37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的转染剂，以及载体，该药物组合物用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病。

其中转染剂被包封的药物组合物提供递送工具。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

转染剂可为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

根据本公开的第六方面，提供一种治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的方法，该方法包括以下步骤：

(ii)向细胞提供LRP/LR和/或其片段，

使得在使用时提供其中治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的靶细胞中的脂质浓度的降低。

转染剂和/或LRP/LR和/或LRP/LR的片段为生物制药剂。

包封可借助于纳米颗粒来形成用于转染剂和/或LRP/LR的递送工具。纳米颗粒可以用化学、生物化学或生物部分官能化以确保位点特异性递送至细胞。

这些部分可充当配体以确保在细胞处的位点特异性递送。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。

转染剂可为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

LRP/LR可包含如本文上述公开的第一方面中列出的如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表或其片段。

根据本公开的第七方面，提供(i)37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，或(ii)用于表达LRP/LR的转染剂在制造用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的药物组合物中的用途。

根据本公开的第八方面，提供一种用于将生物制药剂位点特异性递送至人或动物体内的特定靶位点的药物组合物，该药物组合物包括：

由载体基质包封的生物制药剂，使得在使用时载体基质便于生物制药剂的位点特异性递送，并且伴随着在到达靶位点之前或在该靶位点处阻止其降解，

其中生物制药剂为以下组中的至少一种：(i)37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，或(ii)用于表达LRP/LR的转染剂，和(iii)抗LRP/LR特异性抗体。

生物制药剂可附加地或另选地为用于上调或下调人或动物体内LRP/LR表达的任何工具。生物制药剂可为核酸。生物制药剂可为，例如，siRNA和/或shRNA。

载体基质可为聚合物载体基质。

聚合物载体基质可包括聚合物纳米颗粒。

聚合物纳米颗粒可包括合成或天然聚合物。

聚合物纳米颗粒可为可生物降解的，以在使用时提供对所述聚合物纳米颗粒的免疫原性应答的降低的风险。

聚合物纳米颗粒可为生物相容的，以减轻对所述聚合物纳米颗粒的任何免疫原性应答的风险。

聚合物纳米颗粒可为刺激响应的，使得在使用时纳米颗粒在暴露于某些刺激时经历构象改变，以便于将生物制药剂提供到其靶位点。纳米颗粒可对刺激作出响应，包括例如：pH、温度和电流。

聚合物纳米颗粒可为疏水的或亲水的，这取决于特定靶位点。

聚合物纳米颗粒可为交联的。典型地，交联剂用于交联。然而，交联可通过紫外线(U.V.)照射来进行。

聚合物纳米颗粒可被冻干。冻干典型地提供多孔性，以便于生物制药从纳米颗粒胶囊扩散并扩散到靶位点。

聚合物纳米颗粒可为选自但不限于以下组中的任何一种或多种：丙烯酸树脂、阿拉伯树胶、角叉菜胶、纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、甲壳质、果胶、支链淀粉、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(D-丙交酯)(PDLA)、聚乳酸(PLLA)、聚半乳糖醛酸酯、甲基纤维素(聚缩醛)、聚(ε-己内酯)、磷脂、多糖、聚阴离子多糖、羧甲基纤维素、羧甲基直链淀粉、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、纤维蛋白、丙烯酰胺、羟丙基甲基丙烯酰胺基共聚物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)、聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基乙酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(HEMA)、聚腈(polyphazene)、磷酰胆碱、透明质酸(HA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAAm)、聚(丙烯酸)(PAAc)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚丙烯腈(PAN)、聚氧化丁烯(PBO)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(甲基丙烯酸乙酯)(PEMA)、富马酸丙二醇酯(PF)、聚(甲基丙烯酸葡萄糖乙酯)(PGEMA)、聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、聚(乙烯胺)、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、聚赖氨酸、明胶、羧甲基甲壳质、葡聚糖、琼脂糖、普鲁兰多糖、聚酯、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PEG-PCL-PEG、PLA-PEG-PLA、聚(PF-共-EG)、聚(PEG/PBO-对苯二甲酸酯)、PEG-双-(PLA-丙烯酸酯)、PEG6CD、PEG-g-聚(AAm-共-乙烯基胺)、聚(NIPAAm-共-AAc)、聚(NIPAAm-共-EMA)、PNVP、聚(MMA-共-HEMA)、聚(AN-共-烯丙基磺酸酯)、聚(双羧基-苯氧基-磷腈)、聚(GEMA-硫酸酯)、聚(PEG-共-肽)、藻酸盐-g-(PEO-PPO-PEO)、聚(PLGA-共-丝氨酸)、胶原蛋白-丙烯酸酯、藻酸盐、藻酸盐-丙烯酸酯、聚(HPMA-g-肽)、HA-g-NIPAAm和聚(乙烯基甲基醚)(PVME)和/或上述任何一种或多种的衍生物。

在本公开的示例实施方案中，聚合物纳米颗粒可为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)纳米颗粒。

PLGA为可生物降解的、生物相容的，并且可穿过血脑屏障(BBB)。

纳米颗粒可用第一官能团官能化。第一官能团可为但不限于以下组中的至少一种：化学、生物化学和生物部分。

化学部分可包括有机、无机或有机和无机部分的组合。

生化部分可包括但不限于以下组中的至少一种：氨基酸、肽、多肽、寡肽、蛋白质、酶、抗体和编码上述中的任一种的RNA或DNA序列。

典型地，第一官能团在使用时充当配体以便于药物组合物的位点特异性递送。应理解，官能团可根据靶位点而不同。在使用时，第一官能团与靶位点键合、或连接、或缀合或相关联。

附加地或另选地，提供生物制药以包括至少一个第二官能团。

第二官能团可为但不限于以下组中的至少一种：化学、生物化学和生物部分。以这种方式，不仅纳米颗粒将有助于位点特异性递送，而且生物制药也将有助于位点特异性递送。

化学部分可包括有机、无机或有机和无机部分的组合。

生化部分可包括但不限于以下组中的至少一种：氨基酸、肽、多肽、寡肽、蛋白质、酶、抗体和编码上述中的任一种的RNA或DNA序列。在使用时，第二官能团与靶位点键合、或连接、或缀合或相关联。

特定靶位点可为包括但不限于以下组中的至少一种的细胞：脑细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞。

药物组合物可进一步包括用于对受试者胃肠外或非胃肠外给药的药物载体。

药物组合物可进一步包括抗氧化剂，使得在靶部位处使用时抗氧化剂清除活性氧物种。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。可包括活性药物成分(API)以治疗和/或预防共病性病症，诸如但不限于：炎症和疼痛。

API可为但不限于以下组中的至少一种：恩夫韦肽(enfuvirtide)；奥曲肽(octreotide)；环孢菌素(cyclosporine)；胰岛素；胰高血糖素；胰高血糖素样肽-1(GLP-1)；抗生素，包括环丙沙星(ciprofloxacin)或其它氟喹诺酮(fluoroquinolones)；肽抗生素，诸如多粘菌素和粘菌素；牛血清白蛋白(BSA)；非洛地平(felodipine)、尼莫地平(nimodipine)；干扰素β；鲑鱼降钙素；鳗鱼降钙素；鸡降钙素；大鼠降钙素；人降钙素；猪降钙素或降钙素的任何基因变体；甲状旁腺激素；甲状旁腺激素类似物PTH 1-31NH₂；甲状旁腺激素类似物PTH 1-34NH₂；任何基因变体的胰岛素；加压素(vasopressin)；去氨加压素(desmopressin)；布舍瑞林(buserelin)；促黄体激素释放因子；促红细胞生成素；组织纤溶酶原激活剂；人类生长因子；促肾上腺皮质激素(adrenocorticototropin)；各种白细胞介素；脑啡肽(encephalin)；依那西普(etanercept)；阿达木单抗(adalimumab)；利妥昔单抗(rituximab)；英夫利昔单抗(infliximab)；阿巴西普(abatacept)；曲妥单抗(traztuzumab)；feglymycin；肝素；以及所有已知的疫苗。

API也可为止痛剂，诸如对乙酰氨基酚或非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID包括阿司匹林(aspirin)(Anacin、Ascriptin、Bayer、Bufferin、Ecotrin、Excedrin)、胆碱和水杨酸镁(CMT、Tricosal、Trilisate)、水杨酸胆碱(Arthropan)、塞来昔布(Celebrex)、双氯芬酸钾(Cataflam)、双氯芬酸钠(Voltaren、Voltaren XR)、具有米索前列醇的双氯芬酸钠(Arthrotec)、二氟尼柳(Dolobid)、依托度酸(Lodine、Lodine XL)、非诺洛芬钙(Nalfon)、氟比洛芬(Ansaid)、布洛芬(Advil、Motrin、Motrin IB、Nuprin)、吲哚美辛(Indocin、Indocin SR)、酮洛芬(Actron、Orudis、Orudis KT、Oruvail)、水杨酸镁(Arthritab、BayerSelect、Doan's Pills、Magan、Mobidin、Mobogesic)、甲氯芬那酸钠(Meclomen)、甲芬那酸(Ponstel)、美洛昔康(Mobic)、萘丁美酮(Relafen)、萘普生(Naprosyn,Naprelan)、萘普生钠(Aleve、Anaprox)、奥沙普秦(Daypro)、吡罗昔康(Feldene)、罗非昔布(Vioxx)、双水杨酯(Amigesic、Anaflex 750、Disalcid、Marthritic、Mono-Gesic、Salflex、Salsitab)、水杨酸钠(各种非专利药物)、舒林酸(Clinoril)、托美丁钠(Tolectin)和伐地考昔(Bextra)。

药物组合物可进一步包含细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抑制剂。细胞色素P4503A4(CYP3A4)抑制剂可选自由聚乙二醇、多胺、聚甲基丙烯酸甲酯及其衍生物组成的组，其中抑制剂以基本上抑制生物制药和/或API的前系统代谢的有效量存在，从而提高生物制药和/或API的生物利用度。

药物组合物可进一步包含P-糖蛋白(P-gp)外排泵抑制剂。

在某些实施方案中，其中药物组合物被配制成用于口服递送，药物组合物可进一步包括其周围的包衣，优选肠溶包衣。在使用时包衣防止胃中生物制药剂的降解。

包衣可包括细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抑制剂和/或P-糖蛋白(P-gp)外排泵抑制剂。

转染剂可为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

应理解，可使用其它转染剂。FLAG为特殊的标签，并且如果需要的话可用其它标签替换，这是老生常谈了。

抗LRP/LR特异性抗体可包括igG1-iS18。应理解，igG1-iS18为市售的。

SEQ ID NO:1可为人LRP/LR的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：

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SEQ ID NO:2可为小鼠(小家鼠)LRP/LR的肽/蛋白质序列，并且可具有以下序列：

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AQPEVADWSEGVQVPSVPIQQFPTEDWSAQPATEDWSAAPTAQATEWVGATTEWS

应理解，LRP/LR为高度保守的，并且为了实施在此描述、说明和/或例示的本公开，还可利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的同源物或片段，和/或片段的同源物。

LRP/LR的肽/蛋白质序列或者其同源物或片段，或片段的同源物，可与附加的蛋白质序列、氨基酸序列、肽、蛋白质或抗体结合、或键合、或连接、或缀合或相关联。

另选地和/或附加地，LRP/LR的肽/蛋白质序列可形成更大和/或更长的肽/蛋白质序列的一部分。在本发明的特定实施方案中，LRP/LR可可与FLAG蛋白结合、或键合、或连接、或缀合或相关联，使得在使用时，LRP/LR可用FLAG标记。FLAG蛋白可包括肽/蛋白质序列，其至少包括序列基序DYKDDDDK(SEQ ID NO:3)。申请人设想采用其它标签。

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附图说明

下面将仅通过示例并参考附图来描述本公开的实施方案，其中：

图1示出在示例1中LRP::FLAG在THP-1细胞中的过表达；

图2示出在示例1中LRP::FLAG的过表达显著增加oxLDL处理的和未处理的THP-1细胞中的端粒酶活性；

图3示出在示例1中LRP::FLAG过表达增加oxLDL处理的THP-1细胞的细胞活力；

图4示出在示例1中提取的通过琼脂糖凝胶电泳分离的DNA，以确定LRP::FLAG过表达对DNA片段化的影响；

图5示出在示例1中LRP::FLAG的过表达显著降低THP-1细胞对oxLDL脂质的摄取；

图6示出在示例2中使用蛋白质印迹法(western blotting)检测THP-1细胞中的LRP::FLAG过表达；

图7示出在示例2中LRP::FLAG的过表达显著增加模拟糖尿病状态的THP-1细胞中的端粒酶活性；

图8示出在示例2中LRP::FLAG的过表达显著降低模拟II型糖尿病状态的THP-1细胞中的脂质含量；以及

图9示出在示例2中LRP::FLAG过表达诱导模拟糖尿病状态的THP-1细胞中葡萄糖摄取的增加。

具体实施方式

以上发明内容的内容在此以引用的方式完全重复，以避免不必要的重复。然而，本文提供本公开的非限制性方面以包括用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，该生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中靶细胞为以下组中的至少一种：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞。在使用时生物制药剂降低靶细胞中的脂质含量。

一个方面的示例包括用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的生物制药剂，该生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中靶细胞为以下组中的至少一种：血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。在使用时生物制药剂降低靶细胞中的脂质含量。

一个方面的另一个示例包括用于治疗和/或预防肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，该生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中靶细胞为以下组中的至少一种：包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞。在使用时生物制药剂降低靶细胞中的脂质含量。

LRP/LR典型地被包封到包含纳米颗粒的递送工具中，优选地纳米颗粒用化学、生物化学或生物部分官能化以确保位点特异性递送至靶细胞，其中所述部分充当配体以确保在靶细胞处的位点特异性递送

递送工具典型地被配制成药物组合物，该药物组合物包括用于对受试者胃肠外或非胃肠外给药的药物载体。

药物组合物可进一步包括活性药物成分(API)。API可治疗动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病和/或其共病性病症。

LRP/LR典型地包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表，或者如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中列出的其片段。

LRP/LR可形成用于表达37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的转染剂的一部分，优选地转染剂为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。换句话说，转染剂可用于上调LRP/LR。

纳米颗粒典型地为聚合物纳米颗粒且为可生物降解的，以在使用时提供对所述聚合物纳米颗粒的免疫原性应答的降低的风险，并且进一步其中聚合物纳米颗粒为生物相容的，以减轻对所述聚合物纳米颗粒的任何免疫原性应答的风险，并且进一步其中所述聚合物纳米颗粒为选自以下组中的一种或多种：丙烯酸树脂、阿拉伯树胶、角叉菜胶、纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、甲壳质、果胶、支链淀粉、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(D-丙交酯)(PDLA)、聚乳酸(PLLA)、聚半乳糖醛酸酯、甲基纤维素(聚缩醛)、聚(ε-己内酯)、磷脂、多糖、聚阴离子多糖、羧甲基纤维素、羧甲基直链淀粉、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、纤维蛋白、丙烯酰胺、羟丙基甲基丙烯酰胺基共聚物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)、聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基乙酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(HEMA)、聚腈(polyphazene)、磷酰胆碱、透明质酸(HA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAAm)、聚(丙烯酸)(PAAc)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚丙烯腈(PAN)、聚氧化丁烯(PBO)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(甲基丙烯酸乙酯)(PEMA)、富马酸丙二醇酯(PF)、聚(甲基丙烯酸葡萄糖乙酯)(PGEMA)、聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、聚(乙烯胺)、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、聚赖氨酸、明胶、羧甲基甲壳质、葡聚糖、琼脂糖、普鲁兰多糖、聚酯、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PEG-PCL-PEG、PLA-PEG-PLA、聚(PF-共-EG)、聚(PEG/PBO-对苯二甲酸酯)、PEG-双-(PLA-丙烯酸酯)、PEG6CD、PEG-g-聚(AAm-共-乙烯基胺)、聚(NIPAAm-共-AAc)、聚(NIPAAm-共-EMA)、PNVP、聚(MMA-共-HEMA)、聚(AN-共-烯丙基磺酸酯)、聚(双羧基-苯氧基-磷腈)、聚(GEMA-硫酸酯)、聚(PEG-共-肽)、藻酸盐-g-(PEO-PPO-PEO)、聚(PLGA-共-丝氨酸)、胶原蛋白-丙烯酸酯、藻酸盐、藻酸盐-丙烯酸酯、聚(HPMA-g-肽)、HA-g-NIPAAm和聚(乙烯基甲基醚)(PVME)和/或上述任何一种或多种的衍生物。。

典型地，递送工具被配制成用于口服递送，并且包括至少部分在其周围的包衣，该包衣包括选自由聚乙二醇、多胺、聚甲基丙烯酸甲酯以及其衍生物组成的组的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抑制剂，并且其中包衣进一步包括P-糖蛋白(P-gp)外排泵抑制剂。

基本上如本文所述的转染剂和/或LRP/LR和/或LRP/LR的片段均是用作本公开的一部分的生物制药剂的示例。应理解，LRP/LR为高度保守的，并且为了实施在此描述、说明和/或例示的本公开，还可利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的同源物或片段，和/或片段的同源物。

还可采用基本上相同的序列。如本文所用，基本上相同的序列为仅通过一个或多个保守取代，或者通过位于不破坏或基本上降低表达的多肽或由核酸分子编码的多肽中的一个或多个的活性的序列位置处的一个或多个非保守取代、缺失或插入而与参考序列不同的氨基酸或核苷酸序列。

在下面的示例中，转染剂为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。应理解，申请人设想另一种用于上调靶细胞中的LRP/LR表达的转染剂。不限制本公开的范围的本公开的详细示例实施方案在下文中作为示例1和2提供。

示例

示例1-动脉粥样硬化

材料和方法

THP-1(人白血病单核细胞)细胞的细胞培养

人单核细胞细胞系(THP-1)用于进行的所有实验程序。选择这种细胞系是因为它能够容易地吸收oxLDL(氧化的低密度脂蛋白)并变成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化斑块的主要组分。使用具有15％胎牛血清(FBS)、1％MEM非必需氨基酸的RPMI培养基为培养未转染的和转染的THP-1细胞提供必需的营养。此外，为了防止细菌污染，使用2％的青霉素/链霉素。THP-1细胞既贴壁生长又悬浮生长，并且因此需要额外的培养基才能生长；因此，这些细胞在5ml烧瓶中使用15ml培养基来培养。细胞被储存在预先设定为37℃且具有5％CO₂的孵育箱中，以便模拟人体内存在的体内条件。培养基更换每周执行两至三次。此外，当烧瓶达到大约70-80％的汇合时，执行1:10的分裂。

对于培养基更换和细胞传代，使用细胞刮刀轻轻刮取烧瓶，并且将培养基放置到离心管中，并且以4000rpm离心10分钟。丢弃旧的培养基，并且将沉淀重新悬浮在2ml的杜氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)中，以便去除碎片，并且以4000rpm再离心10分钟。然后将沉淀重新悬浮在1ml的培养基中，并且如果汇合低于70％，则将全部1ml放回烧瓶中。在汇合的烧瓶中，细胞以1:10的比率分裂。将剩余的细胞沉淀并重新悬浮在具有10％DMSO的90％FBS中，并且在-80℃下冷冻作为贮备。

过表达LRP::FLAG并处理THP-1细胞

为了过表达LRP::FLAG，使用Xfect转染试剂盒和方案用pCIneo-moLRP::FLAG质粒转染THP-1细胞。选择以大约70％汇合的烧瓶进行转染。简而言之，将Xfect反应缓冲液添加到5μg的pCIneo-moLRP::FLAG质粒中，以便制备100μl样品。此后，将1.5μl的Xfect聚合物添加到混合物中，并且将试剂在室温下孵育10分钟，以便允许形成纳米颗粒复合物。然后将反应混合物滴加到烧瓶中。每3周用10μl遗传霉素(50mg/ml)处理细胞一次，以便促进质粒的转录并确保转染已发生。

为了诱导动脉粥样硬化斑块形成，用oxLDL(伯乐(Bio-Rad))处理THP-1细胞。简而言之，将未转染的和转染的细胞接种到6、48或96孔板中，并且允许其恢复和生长24-48小时。当细胞达到70-80％汇合时，将由50μg/μl的oxLDL组成的处理添加到各自板的每个孔中，并且将细胞孵育48小时。此后，收获来自每个孔的细胞作为沉淀或在孔中执行实验。对于每个实验，使用以下处理：未处理的未转染的、未处理的转染的、处理的未转染的和处理的转染的。

二喹啉甲酸 ^TM (BCA)蛋白质测定

执行BCA测定以便获得从每个细胞处理中提取的蛋白质的浓度，并且确保蛋白质印迹法的等负载。对于此技术，刮取大约70％汇合的烧瓶中的细胞，并且以10000rpm离心10分钟。然后将沉淀重新悬浮在RIPA裂解缓冲液(由pH为7.4的50mM Tris-HCl，与50mM NaCl、2mM EDTA和0.1％SDS混合组成)中。缓冲液中的SDS使提取的蛋白质线性化，并且提供与蛋白质分子质量成比例的负电荷。接下来，将5μl的每种裂解液与20μl蒸馏水一起负载到96孔板中。此外，负载由牛血清白蛋白(BSA)的系列稀释液(1:10)组成的25μl的一组标准品(0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml和1mg/ml)。这样做是为了构建标准曲线，用于确定未知裂解液的蛋白质浓度。此后，将200μl二喹啉甲酸和硫酸铜(930μl:30μl)的混合物添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育30分钟。这使得肽键有时间将Cu²⁺还原为Cu⁺，以便产生与存在的蛋白质的量成比例的颜色改变。Sunrise Teccan ELISA板读取仪用于测量562nm处的颜色改变，并且样品的浓度从标准曲线获得。

蛋白质印迹法和SDS-PAGE

蛋白质的免疫检测和定量使用SDS PAGE和蛋白质印迹法。这是一种成熟的技术，其使用简单并在本研究中特别有用，因为它允许检测LRP::FLAG以便证实转染。此外，它对于检测过表达LRP::FLAG的细胞中的CVD标志的改变为有用的，并且因此它优于其它蛋白质检测技术而被选择。此技术的不足之处在于包括抗体的非特异性结合的可能性、程序的长度以及其可受到污染物的影响。该技术利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后在PVDF膜上印迹并用靶向感兴趣蛋白质的特异性抗体复合物进行检测。将从THP-1细胞中提取的LRP::FLAG和β-肌动蛋白负载对照稀释至100μl/ml的最终浓度。这允许在SDS-PAGE期间蛋白质的相等和准确分离。

SDS-PAGE

执行SDS-PAGE，以便根据不同蛋白质的分子质量将其线性化和分离。RIPA缓冲液中的SDS与蛋白质的大小成比例结合，使它们具有相等的荷质比，并且允许它们仅根据其分子大小进行分离。这允许通过使用分子量标志来准确检测已知分子量的蛋白质。分两部分制备10％聚丙烯酰胺凝胶。首先，分离凝胶是通过将4.8ml蒸馏水、2.5ml的40％丙烯酰胺、2.5ml分离缓冲液(pH为8.8的187g Tris碱和1升蒸馏水中的0.4％SDS)、100μl的10％SDS和100μl的3％APS和5μl的TEMED混合在一起制备的。然后将其添加到板中，并且使其聚合。此后，通过将3.65ml蒸馏水添加到625μl的40％丙烯酰胺、625μl积层缓冲液(pH为6.8的60.5gTris碱和1升蒸馏水中的4％SDS)、50μl的10％SDS和50μl的APS和5μl的TEMED中来制备积层凝胶。将其添加到分离凝胶的顶部、插入梳子并使凝胶聚合。积层凝胶允许蛋白质在孔的底部以单个条带的形式积聚，而分离凝胶允许不同的蛋白质作为穿过凝胶的单个条带进行分离。然后将提取的裂解液与负载染料混合，并且将样品在95℃下孵育5分钟，以便使染料嵌入蛋白质。此后，将5μl的每个样品和分子量标志负载到孔中。以120V在运行缓冲液中分离蛋白质，直到染料前沿距凝胶的底部大约1cm(大约45分钟)。

蛋白质印迹法

在蛋白质分离后，它们被印迹到PVDF膜上，在此它们可与合适的抗体一起孵育(表5.4.1)。首先，将膜放置在甲醇中(以活化)，并且然后与吸墨纸一起放置在转移缓冲液中(以平衡)。此后，将凝胶位于顶部的膜放置在吸墨纸之间，吸墨纸放置在半干转移印迹装置中，在120V下执行45分钟的电印迹。一旦转移完成，就用10ml的3％BSA封闭PVDF膜，以便防止非特异性抗体结合。然后将膜与合适的初级抗体(表5.4.1)在4℃下孵育过夜。此后，用PBS-吐温洗涤五次，每次5分钟。如果适用，则将膜与适当的次级抗体一起孵育(表5.4.1)，并且在室温下孵育一小时。随后再洗涤五次。接下来，将膜与4ml Clarity Western ECL底物(伯乐)在黑暗中孵育1分钟，并且然后用拍摄图像的ChemiDock成像系统(伯乐)观察。光密度分析允许蛋白质水平的定量。然而，oxLDL处理的延迟递送与持续的污染一起导致执行光密度分析和定量提取的蛋白质的时间不足。

表5.4.1：蛋白质印迹方案中使用的初级和次级抗体的列表。

检测端粒酶活性

端粒缩短为CVD的标志，并且主要是由于端粒酶活性降低引起的。qPCR用于评估LRP::FLAG过表达对差异处理的细胞中的端粒酶活性的影响。TRAPeze

端粒酶检测试剂盒(Merck Millipore^TM)用于提取活性端粒酶并允许端粒底物扩展，以便提供端粒酶活性的相对指示。这项技术在确定端粒酶活性方面非常准确，因为它相对于可用的蛋白质量扩展底物，因此选择这项技术。最初将细胞接种到6孔板中并用oxLDL处理。48小时后，将孔沉淀并重新悬浮在200μl的Chaps裂解缓冲液中。然后将样品在4℃下孵育30分钟，以便提取蛋白质。此后，样品在4℃下以12000rpm离心20分钟，并且使用Nanodrop ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific))确定蛋白质浓度。然后将蛋白质样品稀释至500ng/μl，并且将30μl蛋白质样品在100℃下孵育20分钟，以便提供热处理的阴性对照，其中端粒酶被失活。使用PCR级水、Taq聚合酶和对照或反应混合物制备对照和反应混合物。在96孔板中，将对照混合物添加到热处理的样品和chaps阴性对照中，同时将反应混合物添加到所有蛋白质样品、标准品和阳性对照中。然后用盖玻片覆盖板，并且将其放置在AryaqPCR机中。使用以下参数：在95℃下最初10分钟的变性步骤，然后45个扩增循环，每个循环由以下组成：在95℃下变性10秒、在58℃下退火10秒并在72℃下扩展60秒。数据归一化为标准曲线，并且使用学生t检验进行分析。

细胞计数

为了获得准确的数据，需要确定细胞的数目，以便为测定(诸如MTT测定和油红染色)接种等量的细胞。血细胞计数器用于确定接种所需的细胞的数目。简而言之，刮取细胞，并且将10μl细胞悬浮液与10μl过滤的台盼蓝混合。然后用血细胞计数器对细胞进行计数，并且使用以下等式确定细胞浓度：

然后使用细胞浓度将等浓度的细胞接种到所用板的每个孔中，以便确保获得的数据为准确的。

检测过表达LRP::FLAG的细胞中细胞活力的改变

MTT细胞活力测定为用于确定细胞活力的成熟技术。此测定利用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)，这是一种在活细胞线粒体中转化为不溶性甲臜的化学物质(van Meerloo等人，2011年)。用oxLDL处理的细胞在变成泡沫细胞时经历凋亡(Wintergerst等人，2000年)，因此检测细胞活力可确定过表达LRP::FLAG是否拯救细胞免于凋亡。对于此测定，将8000个细胞接种到48孔板中，用50μg/μl的oxLDL处理并孵育48小时。此后，将7mg MTT(Duchefa Biochemie)溶解在1.5ml PBS中，并且然后过滤灭菌。接下来，将100μl的0.5mg/mlMTT溶液添加到每个孔中，并且将板在37℃下孵育大约3小时。最后，将形成的甲臜晶体溶解在250μl DMSO中，并且使用Sunrise Teccan ELISA板读取仪在590nm处检测颜色改变。获得的数据使用学生t检验进行分析，并且然后绘制成直方图。

评估过表达LRP::FLAG的细胞中的脂质含量

在处理的细胞中，由于脂蛋白的脂质部分，oxLDL的摄取导致细胞中的脂质含量增加(Grahame和Schlesinger，2012年)。此外，oxLDL促进细胞摄取胆固醇和三酰甘油(Batt等人，2004年)。因此，评估细胞中的脂质含量提供关于LRP::FLAG的过表达如何影响oxLDL摄取以及后续动脉粥样硬化斑块形成的可能见解。来自

的Oil Red O脂质染色试剂盒对细胞中的脂质进行染色，允许定量测量细胞中存在的oxLDL。此技术为一种快速简单的技术，可准确地确定脂质含量。此外，提取染料以便定量存在的脂质的量，给出LRP::FLAG过表达的效果的更准确的指示。此技术的不足之处在于大量所需的洗涤可去除一些细胞，从而导致数据偏斜。此技术优于其它技术而被选择，因为它提供定性和定量数据。一旦使用血细胞计数器获得细胞的数目，就将16000个转染的和未转染的细胞接种到96孔板中，其中用oxLDL处理合适的孔并孵育48小时。此后，用100μl的PBS洗涤细胞两次，并且然后在室温下用10％福尔马林孵育45分钟以便固定它们。孵育期后，用蒸馏水洗涤细胞两次，然后用60％异丙醇孵育5分钟。接下来，制备3份原料和2份蒸馏水的工作油红色溶液，并且将200μl添加到每个孔中并孵育15分钟。用水洗涤细胞3次，并且用倒置光学显微镜拍摄图像。此外，使用100％异丙醇提取染料，并且在490nm处定量，以便准确地确定脂质含量的改变。获得的数据经由学生t检验进行分析，并且绘制成直方图。

统计分析

在实验期间获得的所有数据均经过严格的统计分析，使用的是MicrosoftExcel2010，以便确保数据的相关性和重要性。此外，每个实验至少分三次进行，以便确保数据的准确性，以及计算标准偏差。双尾学生t检验用于95％置信区间的分析。其中*p<0.05的值被认为具有统计显著性，而其中**p<0.01和***p<0.001的值被认为具有高度显著性。

结果

证实转染的THP-1细胞中的LRP::FLAG过表达。

为了确定LRP/LR在CVD中是否有潜在作用，使用pCIneo-moLRP::FLAG质粒稳定转染THP-1细胞，以便在THP-1细胞中过表达LRP::FLAG。转染后，执行蛋白质印迹法以便证实LRP::FLAG的过表达(图1)。β-肌动蛋白(负载对照)存在于未转染的和转染的THP-1细胞中(泳道1-8)，而LRP::FLAG仅存在于转染的细胞中(泳道5-8)，这指示转染成功且LRP::FLAG过表达。在转染的(泳道1-4)和未转染的(泳道5-8)THP-1细胞中评估LRP::FLAG通过pCIneo-LRP::FLAG质粒的过表达。使用鼠抗-FLAG初级抗体和鼠抗-IgG-HRP次级抗体检测LRP::FLAG，而使用鼠抗-肌动蛋白-过氧化物酶抗体检测β-肌动蛋白。

LRP::FLAG的过表达显著增加用oxLDL处理的转染的THP-1细胞中的端粒酶活性

CVD的关键因素为端粒严重缩短，这是由于高水平的氧化应激阻碍端粒酶活性而发生的。为了确定LRP::FLAG的过表达是否随后影响端粒酶活性，对用oxLDL处理的转染的和未转染的THP-1细胞执行qPCR。相对于未处理的未转染的THP-1细胞，在未转染的处理的细胞中观察到端粒酶活性显著降低57.43％。此外，当与未转染的和未处理的THP-1细胞相比时，在转染的未处理的和处理的细胞中分别观察到端粒酶活性增加272.72％和283.47％(图2)。

图表描绘LRP::FLAG过表达后相对端粒酶活性的改变。为了绘制图表，数据被归一化。当用oxLDL处理时，在未转染的细胞(蓝色)中发现端粒酶活性显著降低57.43％(**p<0.01)，而在过表达LRP::FLAG的细胞(红色)中的端粒酶活性显著增加，与oxLDL处理无关(**p<0.01)。细胞转染使端粒酶活性显著增加3.8倍，这指示LRP::FLAG可在维持CVD环境中的端粒酶活性中起作用。

LRP::FLAG的过表达显著增加用oxLDL处理的THP-1细胞中的细胞活力

细胞中oxLDL摄取的标志中的一个为诱导凋亡，并且从而降低细胞活力。用oxLDL处理细胞，以便模拟动脉粥样硬化环境，并且研究过表达LRP::FLAG对CVD的影响。为了评估过表达LRP::FLAG对细胞活力的影响，使用转染的和未转染的THP-1细胞执行MTT细胞活力测定。在未处理的和oxLDL处理的未转染的THP-1细胞之间，发现细胞活力显著降低45.53％。当细胞被转染时，无论如何处理，细胞活力保持在近似正常(未转染的未处理的)水平(图3)。图表描绘当细胞被处理和/或转染时细胞活力的改变。用oxLDL处理的未转染的细胞(蓝色)示出细胞活力显著降低1.8倍(***p<0.001)。当细胞被转染(红色)时，在oxLDL处理后没有观察到细胞活力的显著降低，这指示LRP::FLAG从oxLDL诱导的细胞毒性中拯救细胞。

LRP::FLAG的过表达对DNA片段化的影响

当单核细胞通过凋亡变成泡沫细胞时，发生动脉粥样硬化斑块形成。在凋亡期间，DNA被片段化，当通过琼脂糖凝胶电泳分离时，片段化的DNA产生涂片。因此，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段化的改变用于评估LRP::FLAG过表达在DNA片段化中的作用。然而，DNA仍然被捕获在凝胶的孔内(图4)。当与未转染的处理的细胞相比时，预期转染的处理的细胞涂抹减少，然而由于时间限制，此实验不可重复。

从未转染的未处理的(泳道2-4)、未转染的oxLDL处理的(泳道5-7)、转染的未处理的(泳道8-10)和转染的oxLDL处理的(泳道11-13)中提取的DNA均被捕获在孔中。这可以是由于基因组DNA片段对于凝胶来说过大，导致DNA保留在孔中而发生的。限制酶的使用可能已解决此问题。此外，此技术的灵敏度较低，因此，由于提取的DNA浓度低，可能无法检测到任何离开孔的片段。

LRP::FLAG的过表达显著降低用oxLDL处理的THP-1细胞中的脂质含量

动脉粥样硬化斑块形成需要单核细胞吸收oxLDL，这导致细胞脂质含量增加。使用油红脂质染色测定对这一主要标志进行研究，以便评估LRP::FLAG过表达是否在动脉粥样硬化斑块形成中起作用。测定示出，当与未处理的未转染的细胞相比时，用oxLDL处理导致未转染的细胞中的脂质含量增加(红色染色)(图5Aa-b)。此外，与未转染的和未处理的细胞相比，转染导致用oxLDL处理的THP-1细胞和未处理的细胞中的脂质含量降低(图5Aa、c和d)。此外，染色的定量示出未处理的和处理的未转染的THP-1细胞之间的脂质含量显著增加。在未转染的处理的和转染的处理的细胞之间观察到脂质含量的显著降低，而转染的未处理的细胞恢复到正常(未处理的未转染的THP-1细胞)脂质水平(图5B)。

A图定性示出当THP-1细胞被处理和/或转染时观察到的差异。所选图像代表所有6个孔中存在的染色。图像示出，与未转染的和未处理的细胞(a)相比，用oxLDL处理的未转染的细胞(b)的红色染色增加。无论如何处理(c和d)，转染的细胞均示出油红染色的减少。B图示出染色细胞的定量表示。用oxLDL处理的未转染的细胞(蓝色)显著增加细胞内的oxLDL脂质浓度(**p<0.01)。转染导致细胞中的脂质含量显著降低(**p<0.01)，使浓度回到未转染的和未处理的细胞水平(红色)。

论述

众所周知，倾向于oxLDL摄取的单核细胞的端粒长度显著减少，并且已示出这些单核细胞的端粒酶减少(Fitzpatrick等人，2007年)。还已示出，一旦斑块形成，端粒酶活性就上调，随后端粒长度增加，但对斑块没有明显影响(Huzen等人，2011年)。因此，LRP/LR的上调预计不对斑块产生任何影响。因此，令人惊讶和意想不到的是，通过使用LRP::FLAG上调端粒酶活性导致动脉粥样硬化斑块形成减少，并且从oxLDL诱导的凋亡中拯救细胞。

LRP::FLAG在THP-1细胞中的过表达。

人白血病单核细胞(THP-1)细胞因其易于吸收oxLDL并变成泡沫细胞的能力而被使用。为了评估LRP::FLAG在这些细胞中的功能，使用pCIneo-moLRP::FLAG构建体转染这些细胞，并且通过蛋白质印迹法证实转染。蛋白质印迹法示出LRP::FLAG在转染的THP-1细胞中表达，而不是在未转染的细胞中表达(图1)。

LRP::FLAG对端粒酶活性的影响

在证实转染后，评估LRP::FLAG过表达对心血管细胞(动脉粥样硬化)培养模型中的端粒酶活性的影响。

单核细胞中的端粒酶活性低，这是因为这些细胞的周转率低的事实(Demissie等人，2006年)。结果，当oxLDL被这些细胞吸收时，端粒被损坏和侵蚀。此外，由于诱导细胞处于氧化状态而降低端粒酶活性，导致hTERT亚基向线粒体募集(Cong等人，2002年)。这阻止它在位于细胞核中的端粒酶中发挥作用。使用qPCR分析以便评估LRP::FLAG的过表达如何影响端粒酶活性。结果证实在转染的THP-1细胞中相对端粒酶活性被上调(图2)。事实上，当用oxLDL处理未转染的THP-1细胞时，看到相对端粒酶活性显著降低(图2)。

这些研究示出，oxLDL以浓度依赖的方式降低端粒酶活性。不限于理论，这可以是经由去磷酸化使PI3K/Akt失活。感兴趣的是，进一步示出当THP-1细胞被转染时，无论如何处理，端粒酶活性急剧增加。不限于理论，这可以是由于LRP::FLAG诱导hTERT表达增加。由于hTERT为端粒酶的限制因素，因此hTERT浓度的增加可为端粒酶活性增加的原因。然而，由于hTERT具有额外的端粒效应，因此其浓度的增加可能不是端粒酶活性增加的唯一原因(Cong等人，2002)。

发现端粒酶活性的增加足以逆转oxLDL处理的效果。此外，观察到未转染的未处理的细胞和转染的处理的细胞之间的端粒酶活性增加3.8倍(图2)，并且在未处理的和处理的转染的THP-1细胞中均是明显的。观察到的端粒酶活性上调将可导致端粒长度增加，从而抵消观察到的与动脉粥样硬化相关联的端粒长度缩短。这导致斑块形成减少和/或逆转和/或预防动脉粥样硬化。

LRP::FLAG对细胞活力的影响

为了确定动脉粥样硬化中的端粒酶活性上调的作用，使用MTT测定来评估细胞活力。oxLDL处理的未转染的THP-1细胞的细胞活力显著降低1.8倍(图3)。这与文献中已示出的oxLDL通过快速激活半胱天冬酶-3凋亡途径来诱导凋亡相一致(Wintergerst等人，2000年)。

在转染的未处理的细胞中，细胞活力保持与未转染的未处理的细胞相似，这指示转染不导致过度增殖。这指示LRP::FLAG过表达不导致细胞变得致瘤，这是令人惊讶的。类似地，未转染的未处理的细胞和转染的处理的细胞之间的细胞活力没有显著改变，这指示转染从oxLDL诱导的凋亡中拯救细胞。由于单核细胞经历凋亡变成泡沫细胞，从凋亡中拯救它们对于防止动脉粥样硬化斑块形成至关重要。细胞活力的增加可以是由于先前示出的端粒酶活性增加，这导致端粒扩展。

感兴趣的是，检测到转染的处理的细胞的细胞活力略有增加(图3)。虽然微不足道，但此增加可以是由于oxLDL诱导细胞过度增殖。不限于理论，示出转染可通过从oxLDL诱导的凋亡中拯救细胞来增加oxLDL处理的细胞的细胞活力。这表明LRP::FLAG在心血管(特别是动脉粥样硬化)细胞培养模型中具有预防/减少动脉粥样硬化的影响的作用。

LRP::FLAG对脂质含量的影响。

动脉粥样硬化的主要标志为细胞中的脂质含量增加。这在oxLDL的脂质含量被细胞吸收时，通过上调LOX-1和ACAT1、2，增加细胞胆固醇和三酰甘油含量来发生(Batt等人，2004年)。为了进一步证明LRP::FLAG的过表达和随后端粒酶活性的增加在动脉粥样硬化或心血管疾病中起作用，评估细胞脂质含量。

为了评估这一点，油红色脂质染色用于获得脂质含量的定性以及定量测量(图5)。由于动脉粥样硬化斑块中的脂质含量增加，因此脂质含量的降低提供转染有助于逆转和/或预防动脉粥样硬化斑块形成的证据。发现用oxLDL处理确实导致未转染的THP-1细胞中的脂质含量增加。这与文献中示出的oxLDL摄取由于oxLDL的脂质组分而导致脂质含量增加以及由此导致的后续脂质摄取相对应(Batt等人，2004年)。当用oxLDL处理时，转染的细胞示出脂质含量的减少，其显著低于未转染的处理的细胞(11％)。可能的原因是LRP::FLAG可在增加细胞中的脂质代谢中起作用。

结论

总之，示出在THP-1动脉粥样硬化细胞培养模型中，过表达LRP::FLAG增加端粒酶活性。此外，LRP::FLAG的过表达增加用oxLDL处理的细胞的活力。此外，示出转染可从动脉粥样硬化斑块中特征性地观察到的脂质含量增加中拯救oxLDL处理的细胞。油红染色测定揭示，LRP::FLAG在用oxLDL处理或未处理的细胞中的过表达导致细胞脂质含量显著降低，这通常在动脉粥样硬化中增加。这些发现示出，LRP/LR可能在动脉粥样硬化中起作用，过表达LRP::FLAG可提供潜在的新的治疗处理来减少或阻碍动脉粥样硬化斑块形成。

已示出斑块形成后增加端粒长度对斑块本身没有影响。因此，上调LRP/LR预计不对斑块和/或其形成产生任何影响。因此，通过向细胞提供LRP/LR来上调端粒酶活性和/或上调LRP/LR导致脂质含量降低和/或从oxLDL诱导的凋亡中拯救细胞为出乎意料和令人惊讶的。

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示例2–肥胖症、胰岛素抵抗和/或糖尿病：

材料和方法

细胞培养

将THP-1人白血病单核细胞系用于示例2，因为当用高葡萄糖(HG)处理时，它激活单核细胞并经由氧化剂应激和核因子-kB转录因子诱导肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达(Shanmugum，2003年)。此细胞系(单核细胞)通常在悬浮液中生长，但会变得粘附到内皮细胞上，当维持在高葡萄糖因子时，导致二(II)型糖尿病个体的内皮功能障碍(Shanmugum，2003年)。THP-1细胞在RMPI(赛默飞世尔科技(Thermofisher Scientific))中培养，该RMPI补充有10％的FBS(西格玛(sigma))以改进生长、2％的青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技)以防止细菌污染和1％的MEM非必需氨基酸(龙沙(lonza))。为了诱导糖尿病状态，将THP-1细胞维持在20mM葡萄糖中，然后用于下游实验程序。这产生THP-1细胞的四种不同条件：(1)未处理的非转染的细胞、(ii)未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞、(iii)葡萄糖处理的非转染的细胞和(iv)葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞。

这些细胞在37℃下的5％CO₂中培养，以模拟体内条件。通过每周两次更换培养基来培养细胞，以补充营养。当需要时(达到70-80％的汇合)，THP-1细胞也进行亚培养，并且以合适的密度接种，用于下游实验程序。细胞的接种和传代培养涉及刮取细胞并以4500rpm离心10分钟。然后丢弃培养基，随后用2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)重新悬浮细胞以去除多余的培养基。然后以4500rpm离心10分钟，然后丢弃上清液并将细胞沉淀重新悬浮在新鲜细胞培养基中。此后，用新鲜培养基重新悬浮细胞，并且转移回烧瓶。

转染

用pCIneo-moLRP-FLAG质粒转染细胞，以诱导LRP::FLAG蛋白的过表达。此程序示出，LRP::FLAG的过表达增加端粒酶活性，并且降低细胞中的脂质含量，并且因此降低糖尿病状态。然后使用Xfect转染试剂(Clontech)执行转染程序。将Xfect反应缓冲液添加到5μg的pCIneo-moLRP::FLAG质粒中，使总体积为100μl。然后添加1.5μl的Xfect聚合物，将其在室温下孵育10分钟。这样做是为了允许纳米颗粒的复合物形成。此后，将此Xfect转染试剂轻轻添加到烧瓶中的细胞中。然后将细胞在37℃下用包含pCIneo-moLRP-FLAG构建体和Xfect试剂的主混合物孵育72小时。这允许LRP::FLAG的转录和翻译，从而导致LRP::FLAG蛋白在THP-1细胞中的过表达。为了使细胞持续转录LRP::FLAG质粒，细胞偶尔用50μg/ml遗传霉素处理。然后将转染的细胞用于下游实验程序。

细胞计数

进行细胞计数是为了确保相同数目的细胞用于下游实验。程序涉及用过滤的台盼蓝(0.4％)染色细胞。这允许死细胞被染成蓝色，而活细胞保持未染色，因为它们的膜仍然完整，因此对穿过膜的化合物具有选择性。使用约10μl样品，并且与10μl台盼蓝混合。此后，将10μl此溶液放置在血细胞计数器上，并且在显微镜下计数16个小方块中的活细胞和死细胞的平均数。为了计算活细胞的总数，使用以下公式：

蛋白质裂解液的制备

刮取细胞以便于细胞分离。然后细胞以6600rpm离心15分钟。丢弃培养基，沉淀用PBS重新悬浮并离心。然后丢弃上清液，同时将沉淀重新悬浮在210μl的非变性(CHAPS)裂解缓冲液中，并且在4℃下孵育30分钟。然后在4℃下以12000rpm离心20分钟。然后将含有蛋白质提取物的上清液转移到新的Eppendorf管中，并且丢弃含有细胞碎片的沉淀。蛋白质裂解液用于下游应用，包括端粒酶活性和葡萄糖测定。对于端粒酶活性，提取的蛋白质裂解液通过Nanodrop光谱法、NanodropND-1000进行定量，以确保样品被稀释至500ng/μl蛋白质的等浓度。

二喹啉甲酸^TM(BCA)蛋白质测定：

执行BCA以便确保等浓度的蛋白质用于下游实验，诸如SDS-PAGE和蛋白质印迹法。之所以将此程序用于其它蛋白质测定，是因为BCA测定中的肽主链也有助于颜色的形成、有助于将由蛋白质组成差异引起的可变性降至最低。它也非常敏感，并且不受蛋白质不同组成的影响。

程序涉及用100μl的RIPA缓冲液重新悬浮从汇合烧瓶(70-80％汇合)获得的细胞沉淀。RIPA缓冲液用于裂解细胞，以便收获细胞裂解液，因为RIPA缓冲液含有SDS，SDS使蛋白质线性化，然后赋予总负电荷。此后，用20μl蒸馏水稀释5μl提取的裂解液，并且一式三份负载在96孔板中。制备0、0.2、0.4、0.6、0.8和1mg/ml的BCA标准品，并且将25μl的每种标准品一式两份负载在板上。随后将200μl的BCA添加到每个孔中，然后在37℃下孵育30分钟。然后在ELISA板读取仪上在562nm处读取板。然后绘制标准曲线，并且将其用于推断样品的蛋白质浓度。然后将样品稀释至2mg/ml的最终浓度，然后将其用于下游实验，诸如SDS PAGE和蛋白质印迹法。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法

SDS-PAGE和蛋白质印迹法用于分析转染的和非转染的THP-1细胞中蛋白质的存在和含量。

此实验程序用于证实LRP::FLAG的过表达。这是在转染的未处理的、非转染的未处理的、转染的处理的和非转染的处理的THP-1细胞之间进行的。它是通过采用SDS-PAGE基于大小和蛋白质印迹法而分离蛋白质来实现的，蛋白质印迹法利用初级和次级抗体进行特异性蛋白质检测。

SDS-PAGE

用RIPA缓冲液将提取的裂解液稀释至2mg/ml。RIPA含有SDS，它通过添加与其大小和形状成比例的负电荷来线性化蛋白质。由于提取的样品被赋予总负电荷，当暴露于电流时，通过蛋白质从阳极向阴极的迁移，它基于大小被分成条带。由于LRP::FLAG和β-肌动蛋白的分子量分别为±40kDa和42kDa，样品被负载在10％(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶上。

SDS-PAGE由分离和积层凝胶构成。通过添加2.5ml含4.8ml蒸馏水的40％丙烯酰胺、2.5ml分离缓冲液、100μl的10％APS和5μl TEMED来制备分离凝胶。然后将分离凝胶倾倒在凝胶浇铸板之间，并且用异丙醇覆盖以去除气泡，因为气泡阻止聚合。然后使其聚合。此后，通过将625μl的40％丙烯酰胺与3.65ml蒸馏水、625μl积层缓冲液、50μlAPS和5μlTEMED混合来制备积层凝胶。然后丢弃异丙醇，将积层凝胶倾倒在聚合的分离凝胶上。然后插入梳子并使凝胶聚合。一旦凝胶聚合，就将板放置到电泳仪中。然后添加运行缓冲液，并且去除梳子。此后，将第3.4节中获得的2mg/ml提取的裂解液与1倍负载染料混合，并且然后在95℃下加热5分钟。将加热的样品涡旋，并且将5μl样品与2μl分子量标志一起负载在凝胶孔中。凝胶在120V下分离45分钟(直到染料前沿距凝胶底部1cm)。

蛋白质印迹法

将电泳转移应用于SDS-PAGE凝胶上，以便将分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。最初，PVDF膜在甲醇中浸泡并活化2分钟。此后，将PVDF膜组装到电印迹设备上，并且将凝胶放置在膜的顶部上，并且在120V下进行45分钟的电印迹。然后使用10ml的3％BSA封闭溶液封闭PVDF膜1小时，以防止初级抗体的非特异性结合。此后，将PVDF膜与2μl对我们感兴趣的蛋白质特异的初级抗体在4℃下孵育过夜。用5次10ml的PBS吐温洗涤来洗掉未结合的初级抗体，每次5分钟。然后在室温下，在10ml的3％BSA中添加与HRP酶缀合的2μl抗人次级抗体1小时。孵育后，进行5次10ml的PBS吐温洗涤，每次5分钟，以去除未结合的次级抗体。随后添加化学发光底物，并且使用Biorad Chemi-doc软件检测和分析其信号。执行光密度测定以定量蛋白质水平，这是使用ImageJTM软件对非转染的细胞和pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞进行的。

使用qPCR评估过表达LRP::FLAG的细胞中的端粒酶活性

定量/实时PCR

检测转染的未处理的、非转染的未处理的、转染的处理的和非转染的处理的THP-1细胞中的端粒酶活性，以确定LRP::FLAG的过表达是否增强糖尿病环境中的端粒酶活性。根据制造商的方案，使用端粒酶活性检测试剂盒：TRAPeze

(Merck MilliporeTM)测定端粒酶活性。使用半反应，并且使用实时qPCR分析端粒酶活性。

端粒酶活性检测试剂盒由一个缓冲液、扩增引物和两个酶系统构成，这使得通过实时qPCR能够进行荧光检测。为了使提取的端粒酶将端粒重复序列添加到底物的3’端，将从第3.2节获得的2μl提取的裂解液(含有端粒酶)与12.5μl反应混合物在96孔板中在37℃下孵育。还将反应混合物添加到标准品和阳性对照中。将热灭活端粒酶用作对照，并且将水和chaps用作阴性对照。将约2μl的这些对照添加在96孔板上，并且与12.5μl对照混合物在37℃下孵育。通过在100℃下孵育30μl提取的裂解液20分钟来进行热灭活对照。通过将2.5μl的5X TRAPeze RT反应混合物、0.2μl Taq聚合酶和8.8μl的PCR级水添加到每个孔中来完成反应混合物。同时，通过将2.5μl的5X TRAPeze RT对照反应混合物、0.2μl Taq聚合酶和7.8μl的PCR级水添加到每个孔中来完成对照混合物。THP-1细胞的端粒酶活性一式两份进行(3个生物重复和2个技术重复)，并且使用运行45个循环的Roche LightCycler 480进行分析。生成的数据被归一化为由连续稀释的TSR8样品生成的标准曲线。数据使用学生t检验进行分析。

在过表达LRP::FLAG的细胞中使用红油染色评估脂质含量。

油红染色

检测THP-1细胞中的脂质含量，以确定LRP::FLAG的过表达是否降低模拟II型糖尿病的转染的细胞中的脂质含量(糖尿病状态)。如第3.1节所述，在96孔板中每孔接种8000个细胞。对于此程序中使用的所有油红色染料组分，每个孔使用100μl的体积。轻轻去除培养基，并且用PBS洗涤细胞一次。此后，向细胞中添加福尔马林，并且在室温下孵育45分钟，以将细胞固定在板上。在孵育时间期间，通过将3.6ml贮备溶液与20ml异丙醇和2.4ml蒸馏水混合来制备油红色工作溶液。一旦孵育时间结束，就丢弃福尔马林，并且然后使用水洗涤细胞两次。然后通过用60％异丙醇孵育细胞5分钟来使细胞通透。然后丢弃60％的异丙醇，并且然后用油红色工作溶液对细胞进行染色。将其在温和搅拌下孵育15分钟。此后，丢弃油红o溶液，并且用水洗涤细胞3次，然后添加苏木精将细胞核染成蓝色，并且孵育1分钟以使得其能够可视化。然后丢弃苏木精，并且用水洗涤细胞3次。然后用水覆盖细胞，并且在显微镜下观察，以可视化和检查细胞内脂质的积聚。然后通过添加100μl的100％异丙醇并使用ELISA板读取仪在572nm波长处准确读取板来定量染色。数据使用学生t检验进行分析。

评估过表达LRP::FLAG的细胞中的葡萄糖摄取。

比色ELISA

执行这种基于板的测定以确定LRP::FLAG的过表达是否导致高葡萄糖培养的细胞中的葡萄糖摄取的改进。因此，我们使用比色ELISA评估未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的、未处理的非转染的、葡萄糖处理的非转染的和葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的THP-1细胞之间的葡萄糖摄取。选择比色ELISA是因为其快速、高度灵敏和特异性。使用来自

的葡萄糖测定试剂盒评估THP-1细胞对葡萄糖的摄取。此试剂盒由缓冲液、葡萄糖探针、葡萄糖标准品和葡萄糖酶混合物构成，该葡萄糖酶混合物氧化存在的葡萄糖并产生与探针反应以产生颜色改变的产物。颜色的强度与样品中存在的葡萄糖量成比例。

然后将约20μl的提取的裂解液一式四份负载，然后添加30μl的葡萄糖测定缓冲液，使总体积为50μl，而将chaps和葡萄糖缓冲液用作阴性对照。此后，将50μl的葡萄糖试剂混合物(其通过将46μl的葡萄糖测定缓冲液与2μl的葡萄糖探针和2μl的葡萄糖酶混合物混合来制备)添加到所有含有提取的裂解液的板和对照中。然后将其在37℃下孵育30分钟，并且用箔片覆盖，因为试剂为光敏的。然后使用酶联免疫吸附测定(ELISA)板读取仪在570nm的吸光度下读取板。使用学生t检验分析从ELISA板读取仪获得的数据。

结果

使用蛋白质印迹法检测THP-1细胞中的LRP::FLAG过表达

细胞培养模型THP-细胞用pCIneo-moLRP::FLAG质粒稳定转染。这样做是为了诱导LRP::FLAG的过表达，这是使用蛋白质印迹法证实的。β-肌动蛋白被确定为负载对照，以证实整个凝胶中的蛋白质负载为相同的，并且确保结果不是由于负载或蛋白质转移误差引起的。如图6所示，β-肌动蛋白在pCIneo-moLRP::FLAG转染的和非转染的细胞中检测到。LRP::FLAG仅在pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞中检测到，这示出转染程序为成功的(泳道1-4)。图6示出使用蛋白质印迹法检测THP-1细胞中的LRP::FLAG过表达。THP-1转染的细胞(泳道1-4)和THP-1非转染的细胞(泳道5-8)中β-肌动蛋白和LRP::FLAG过表达的蛋白质印迹分析。LRP::FLAG蛋白的检测是使用鼠抗-FLAG初级抗体和抗-鼠IgG次级抗体偶联HRP实现的。此外，在pCIneo-moLRP::FLAG转染的和非转染的细胞中还确定负载对照(β-肌动蛋白)。使用单克隆抗β-肌动蛋白过氧化物酶缀合抗体来检测β-肌动蛋白。LRP::FLAG被确定为仅在THP-1pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞中表达。

LRP::FLAG的过表达显著增加THP-1细胞中的端粒酶活性，而与葡萄糖处理无关。

在未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的、未处理的非转染的、葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的和葡萄糖处理的非转染的THP-1细胞之间确定端粒活性。发现相对于未处理的非转染的THP-1细胞，LRP::FLAG的过表达导致未处理的THP-1pCIneo-moLRP::FLAG转染的、葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG和葡萄糖处理的非转染的THP-1细胞的端粒酶活性增加(图7)。葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞和葡萄糖处理的非转染的细胞之间端粒酶活性的增加。图7示出LRP::FLAG的过表达显著增加模拟糖尿病状态的THP-1细胞中的端粒酶活性。结果表明，当与未处理的非转染的细胞相比时，未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染(p＝1×10^-4)和葡萄糖处理的非转染的THP(p＝8×10^-4)的端粒酶活性分别增加4.7倍和1.7倍。申请人还观察到葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的和未处理的非转染的细胞(p＝1×10^-4)之间显著增加4.7倍，葡萄糖处理的非转染的细胞和葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞(p＝4×10^-5)之间增加2.8倍。绘制的数据是相对于设定为100％的未处理的非转染的THP-1细胞。

LRP::FLAG的过表达显著降低THP-1 pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞中的脂质含量。

脂质含量为在未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的、未处理的非转染的、葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG和葡萄糖处理的非转染的THP-1细胞中确定的。为了评估脂质含量，使用油红染色对脂质进行染色，将其在ELISA板读取仪上进行定量。油红染色表明，如图8所示，与葡萄糖处理的非转染的细胞相比，LRP::FLAG的过表达显著降低葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞中示出为粉红色染色的脂质含量。

图8示出LRP::FLAG的过表达显著降低模拟II型糖尿病状态的THP-1细胞中的脂质含量。(a)放大10倍后获得的图像示出，与葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞、未处理的非转染的细胞和未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞相比，葡萄糖处理的非转染的细胞中的脂质含量较高(示出为粉红色染色)。葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的THP-1细胞的细胞的粉红色染色中示出的脂质含量降低至与未处理的非转染的THP-1细胞大约相同的水平。(b)当与葡萄糖处理的非转染的细胞(p＝4×10^-5)相比时，发现葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞的脂质含量显著降低1.21倍。我们还观察到未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞和未处理的非转染的细胞之间的脂质含量降低1.1倍，而未处理的非转染的细胞和葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞(p＝0.008)之间的脂质含量增加1.04倍。未处理的非转染的细胞和葡萄糖处理的非转染的细胞(p＝3.7×10^-6)之间的脂质含量显著增加1.3倍。绘制的数据是相对于设定为100％的未处理的非转染的THP-1细胞。

LRP::FLAG过表达诱导模拟糖尿病状态的THP-1细胞中的葡萄糖摄取增加

发现LRP::FLAG的过表达对细胞摄取葡萄糖的能力有影响，并且通过基于ELISA的葡萄糖测定得到证实。THP-1细胞的葡萄糖摄取为在未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的、未处理的非转染的、葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG和葡萄糖处理的非转染的细胞之间确定的。基于ELISA的葡萄糖测定表明，相对于葡萄糖处理的非转染的细胞，葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞的葡萄糖摄取显著增加，并且在未处理的pCIneo-moLRP::FLAG和未处理的非转染的细胞之间也是如此。此外，我们观察到，相对于THP-1未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的培养基，培养THP-1未处理的非转染的细胞的培养基中的葡萄糖增加。

图9示出LRP::FLAG过表达诱导模拟糖尿病状态的THP-1细胞中的葡萄糖摄取增加。相对于未处理的非转染的细胞(p＝0.03)，确定未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞的葡萄糖摄取增加1.18倍。结果还表明，葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞和葡萄糖处理的非转染的细胞(p＝7×10^-4)之间的葡萄糖摄取增加1.1倍，而未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的细胞和未处理的非转染的细胞的培养基之间的葡萄糖摄取降低1.12倍。

论述和结论：

蛋白质印迹法揭示pCIneo-moLRP::FLAG THP-1转染的细胞中的LRP::FLAG过表达。这示出转染程序为成功的。结果示出，在未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的、葡萄糖处理的非转染的和葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的THP-1中的端粒酶活性增加。这示出端粒酶活性增强，从而延长端粒。伴随着端粒酶活性的增加，进一步发现过表达LRP::FLAG降低THP-1细胞中的脂质含量。

进一步示出，LRP::FLAG依赖性端粒酶激活导致葡萄糖处理的pCIneo-moLRP::FLAG的脂质含量显著降低至与对照(未处理的非转染的和未处理的pCIneo-moLRP::FLAG转染的THP-1细胞)大约相同的水平。已发现糖尿病细胞的脂质含量增加，这也与胰岛素抵抗相关联(Gavin等人，2017年)。研究已示出，脂质含量的增加导致胰岛素抵抗(Palmer等人，2015年)。

因此，通过在THP-1细胞中过表达LRP::FLAG，端粒酶活性增加。不限于理论，这可导致ROS物种的减少，ROS物种也通过增加固醇调节元件结合蛋白(SREBP)切割激活蛋白的表达来激活脂肪酸合酶(FAS)，从而在脂质代谢的调节中发挥作用(Ryu等人，2015)。FAS为刺激脂肪生成的脂肪生成基因，并且这有助于胰岛素抵抗。我们知道增加的FAS水平降低骨骼肌细胞和肝细胞中的线粒体β-氧化。这导致(DAG)和(LCCoA)增加，诱导IRS-1位点的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，从而抑制IRS-1磷酸化和3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)信号的激活。(Savage等人，2007年)。抑制骨骼中PI3P的激活导致GLUT4合成减少，从而减少骨骼肌对葡萄糖的摄取。肝细胞中PI3P激活的抑制导致叉头框蛋白O(FOXO)磷酸化的减少，这继而导致肝糖异生的增加(Savage等人，2007年)。因此，但不限于理论，LRP::FLAG的过表达可导致ROS物种减少，这可导致脂质代谢和脂质含量降低，如图所示。脂质含量的降低可能通过改进胰岛素敏感性来抑制胰岛素抵抗。

胰岛素敏感性的改进和胰岛素抵抗的降低导致细胞对葡萄糖摄取的增加和葡萄糖产生的减少。胰岛素激活MAPK、PI3K-Akt和CAP/Cbl和小G蛋白TC10途径以增加葡萄糖摄取。MAPK抑制糖异生，PI3K-Akt增加GLUT-4和CAP/Cbl，并且小G蛋白TC10增加对脂肪生成的抑制(Hajiaghaalipour等人，2015年)。这与我们的结果相一致，在我们的结果中，我们观察到模拟II型糖尿病的THP-1pCIneo-moLRP-FLAG转染的细胞中的葡萄糖摄取增加。这种细胞对葡萄糖摄取的增加意指高血糖状态(糖尿病的主要标志)降低。

因此，通过使用LRP::FLAG，增加hTERT水平和端粒酶活性，它可导致ROS降低，并且从而导致高血糖状态的降低，如II型糖尿病中所见，如图7所示。

降低糖尿病细胞中的脂质浓度将改进其中受损的胰岛素信号，从而治疗和/或预防肥胖症、胰岛素抵抗和/或糖尿病。

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申请人相信，本文公开的主题至少改进现有技术中已知的缺点中的一个。

虽然已关于特定实施方案和/或其示例详细描述本公开的主题，但应理解，本领域技术人员在理解前述内容后，可容易地想到这些实施方案的变更、变化和等同物。因此，本公开的范围应当被评估为权利要求及其任何等同物的范围，权利要求附于此。

序列表

<110> 约翰内斯堡威特沃特斯兰德大学（University of the Witwatersrand,Johannesburg）

<120> 用于降低细胞中的脂质含量的生物制药剂

<130> P1181PC

<140>

<141>

<150> 2018/04509

<151> 2018-07-06

<160> 5

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 295

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ser Gly Ala Leu Asp Val Leu Gln Met Lys Glu Glu Asp Val Leu

1 5 10 15

Lys Phe Leu Ala Ala Gly Thr His Leu Gly Gly Thr Asn Leu Asp Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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275 280 285

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<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Ser Gly Ala Leu Asp Val Leu Gln Met Lys Glu Glu Asp Val Leu

1 5 10 15

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20 25 30

Gln Met Glu Gln Tyr Ile Tyr Lys Arg Lys Ser Asp Gly Ile Tyr Ile

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

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260 265 270

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275 280 285

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290 295

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 3

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 4

<211> 194

<212> PRT

<213> 人类（Homo sapiens）

<400> 4

Arg Phe Thr Pro Gly Thr Phe Thr Asn Gln Ile Gln Ala Ala Phe Arg

1 5 10 15

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Trp Ser

<210> 5

<211> 194

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 5

Arg Phe Thr Pro Gly Thr Phe Thr Asn Gln Ile Gln Ala Ala Phe Arg

1 5 10 15

Glu Pro Arg Leu Leu Val Val Thr Asp Pro Arg Ala Asp His Gln Pro

20 25 30

Leu Thr Glu Ala Ser Tyr Val Asn Leu Pro Thr Ile Ala Leu Cys Asn

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Glu Trp Thr Ala Pro Ala Pro Glu Phe Thr Ala Ala Gln Pro Glu Val

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

Ala Ala Pro Thr Ala Gln Ala Thr Glu Trp Val Gly Ala Thr Thr Glu

180 185 190

Trp Ser

Claims

1.一种用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，所述生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其所述片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中所述靶细胞为以下组中的至少一种：血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞，使得在使用时所述生物制药剂的给药降低所述靶细胞中的脂质含量。

2.根据权利要求1所述的生物制药剂，其中所述LRP/LR被包封到包含纳米颗粒的递送工具中，优选地所述纳米颗粒用化学、生物化学或生物部分官能化以确保位点特异性递送至所述靶细胞，其中所述部分充当配体以确保在所述靶细胞处的位点特异性递送

3.根据权利要求2所述的生物制药剂，其中所述递送工具被配制成药物组合物，所述药物组合物包括用于对所述受试者胃肠外或非胃肠外给药的药物载体。

4.根据权利要求3所述的生物制药剂，其中所述药物组合物进一步包括活性药物成分(API)。

5.根据权利要求4所述的生物制药剂，其中所述药物组合物进一步包括抗氧化剂，使得在所述靶细胞处使用时所述抗氧化剂清除活性氧物种。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生物制药剂，其中所述LRP/LR包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表，或如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中列出的其片段。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的生物制药剂，其中所述LRP/LR形成用于表达37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段的转染剂的一部分，优选地所述转染剂为pCIneo-moLRP::FLAG质粒。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的生物制药剂，其中所述纳米颗粒为聚合物纳米颗粒且为可生物降解的，以在使用时提供对所述聚合物纳米颗粒的免疫原性应答的降低的风险，并且进一步其中所述聚合物纳米颗粒为生物相容的，以减轻对所述聚合物纳米颗粒的任何免疫原性应答的风险，并且进一步其中所述聚合物纳米颗粒为选自以下组中的一种或多种：丙烯酸树脂、阿拉伯树胶、角叉菜胶、纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、甲壳质、果胶、支链淀粉、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚氯乙烯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚(D-丙交酯)(PDLA)、聚乳酸(PLLA)、聚半乳糖醛酸酯、甲基纤维素(聚缩醛)、聚(ε-己内酯)、磷脂、多糖、聚阴离子多糖、羧甲基纤维素、羧甲基直链淀粉、6-硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、胶原蛋白、纤维蛋白原、白蛋白、纤维蛋白、丙烯酰胺、羟丙基甲基丙烯酰胺基共聚物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(pNIPAAm)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)、聚(N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(羟基乙酸)(PGA)、聚(乳酸)(PLA)、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(HEMA)、聚腈、磷酰胆碱、透明质酸(HA)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、亚甲基-双-丙烯酰胺(MBAAm)、聚(丙烯酸)(PAAc)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚丙烯腈(PAN)、聚氧化丁烯(PBO)、聚己内酯(PCL)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(甲基丙烯酸乙酯)(PEMA)、富马酸丙二醇酯(PF)、聚(甲基丙烯酸葡萄糖乙酯)(PGEMA)、聚(羟基丁酸酯)(PHB)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(PHEMA)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)(PHPMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(PNVP)、聚(环氧丙烷)(PPO)、聚(乙酸乙烯酯)(PVAc)、聚(乙烯胺)、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、聚赖氨酸、明胶、羧甲基甲壳质、葡聚糖、琼脂糖、普鲁兰多糖、聚酯、PEG-PLA-PEG、PEG-PLGA-PEG、PEG-PCL-PEG、PLA-PEG-PLA、聚(PF-共-EG)、聚(PEG/PBO-对苯二甲酸酯)、PEG-双-(PLA-丙烯酸酯)、PEG6CD、PEG-g-聚(AAm-共-乙烯基胺)、聚(NIPAAm-共-AAc)、聚(NIPAAm-共-EMA)、PNVP、聚(MMA-共-HEMA)、聚(AN-共-烯丙基磺酸酯)、聚(双羧基-苯氧基-磷腈)、聚(GEMA-硫酸酯)、聚(PEG-共-肽)、藻酸盐-g-(PEO-PPO-PEO)、聚(PLGA-共-丝氨酸)、胶原蛋白-丙烯酸酯、藻酸盐、藻酸盐-丙烯酸酯、聚(HPMA-g-肽)、HA-g-NIPAAm和聚(乙烯基甲基醚)(PVME)和/或上述任何一种或多种的衍生物。

9.根据权利要求8所述的生物制药剂，其中所述递送工具被配制成用于口服递送，并且包括至少部分在其周围的包衣，所述包衣包括选自由聚乙二醇、多胺、聚甲基丙烯酸甲酯及其衍生物组成的组的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)抑制剂，并且其中所述包衣进一步包括P-糖蛋白(P-gp)外排泵抑制剂。

10.一种降低人或动物受试者的靶细胞中的脂质浓度的方法，所述方法包含以下步骤：

转染所述细胞以产生37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段；或者

向所述细胞提供LRP/LR和/或其片段，

其中所述细胞中的脂质浓度的降低治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病。

11.一种用于治疗和/或预防动脉粥样硬化的生物制药剂，所述生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其所述片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中所述靶细胞为以下组中的至少一种：血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，在使用时所述生物制药剂降低所述靶细胞中的脂质含量，并且其中所述LRP/LR包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表，或如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中列出的其片段。

12.一种用于治疗和/或预防肥胖症和/或胰岛素抵抗和/或糖尿病的生物制药剂，所述生物制药剂包括37kDa/67kDa层粘连蛋白受体前体/高亲和力层粘连蛋白受体(LRP/LR)和/或其片段，其中LRP/LR和/或其所述片段用于对有此需要的受试者的靶细胞给药，并且其中所述靶细胞为以下组中的至少一种：包括α(α)细胞、β(β)细胞、δ(δ)细胞和γ(γ)细胞的胰腺细胞，在使用时所述生物制药剂降低所述靶细胞中的脂质含量，并且其中所述LRP/LR包含如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中列出的肽/蛋白质序列表，或如SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:5中列出的其片段。