CN112587709A

CN112587709A - 一种含多重生长因子的3d打印敷料粘带及制备方法

Info

Publication number: CN112587709A
Application number: CN202011555639.8A
Authority: CN
Inventors: 王培培; 马文君; 郑春阳
Original assignee: Robustnique Corp ltd
Current assignee: Robustnique Corp ltd
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2021-04-02

Abstract

本发明公开了一种含多重生长因子的3D打印敷料粘带及其制备方法，含有多重生长因子3D打印敷料由生长因子微球和水凝胶基质组成，生长因子微球含有表皮生长因子、成纤维生长因子，血小板生长因子、血管生成生长因子，多重生长因子共同作用，促进真皮层和表皮层组织再生，缩短患者创面愈合时间，减少愈合过程疤痕形成。打印敷料粘带的制备步骤创新性的对多重生长因子采用了复配包裹技术，和水凝胶基质的选择搭配，不仅促进创面愈合，还解决了普通敷料粘度不够，患者运动时不服帖的问题。

Description

一种含多重生长因子的3D打印敷料粘带及制备方法

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种含多重生长因子3D打印敷料粘带。

背景技术

创面敷料是用来覆盖因外科手术、烧伤、烫伤等引起的伤口，并具有固定伤口、避免感染和促进愈合作用的医用材料。创面愈合是一个复杂的生物学过程，涉及细胞趋化、分裂、新生血管形成、细胞外基质蛋白合成和瘢痕。传统的创面敷料通常作为止血和预防感染的临时屏障，不具备加速创面愈合，减少疤痕形成的功能性。目前，在创面敷料中添加生长因子成为研究热点，在体外已被证实参与调节创面愈合修复的各个阶段。国内外市场上含生长因子敷料产品有：含EGF的HEBERPROT冻干粉及凝胶产品、含PDGF的REGEN-DTM、含有bFGF的FIBLAST凝胶、喷雾剂型产品、TGF-β的胶原敷料、含FGF的创必复胶原敷料等，这些产品的共同特点是只含有单一的生长因子，不能满足伤口愈合对多重生长因子的需求。生长因子本身作为蛋白类活性物质极易受到皮肤分泌的蛋白酶酶解导致失活，现有产品生长因子添加量都是远高于所需生理浓度，在使用过程会存在初始浓度过高，给健康带来更多的负面影响。敷料基质单一，不能满足创面治疗过程对皮肤细胞外基质蛋白多样性的需求。敷料黏性不够，现有产品使用过程中均需要敷贴来配合固定，护理繁琐。

发明内容

针对上述问题，本发明目的在于提供一种含多重生长因子3D打印敷料粘带,以解决多重生长因子可持续释放的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种含多重生长因子3D打印敷料粘带的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种含多重生长因子3D打印敷料，主要由生长因子微球和水凝胶基质组成。

所述生长因子微球包括以下重量百分比组分：

海藻酸钠2.0-3.0%，氯化钙2.0-4.0%，表皮生长因子EGF 0.05-1%，成纤维生长因子FGE 0.05-1%，血小板生长因子PDGF 0.05-1%和血管生成生长因子VEGF 0.05-1%。

凝胶基质包括以下重量百分比组分：

甲基丙烯酸化明胶5-7%、甲基丙烯酸化壳聚糖1-2%，聚丙烯酸0.1-0.2%。

一种含多重生长因子3D打印敷料粘带的制备步骤如下：

（1）制备生长因子微球；

（2）制备水凝胶基质；

（3）将步骤（1）制备得到的包裹生长因子微球与步骤（2）制备得到的水凝胶基质按1：1-10的体积比例混合，充分混合均匀，制备待打印生物墨水；

（4）在聚乙烯涂层纸上3D打印水凝胶；

（5）将步骤4制备的试样进行紫外照射水凝胶使其交联固化。

进一步的，所述步骤（1）将海藻酸钠2.5%溶液和表皮生长因子EGF 0.05-1%，成纤维生长因子FGF 0.05-1%，血小板生长因子PDGF 0.05-1%和血管生成生长因子VEGF 0.05-1%混合均匀后，利用造粒机将混合均匀的溶液逐滴加入氯化钙3%中，形成生长因子的微球。

进一步的，所述步骤（2）甲基丙烯酸化明胶5-7%、甲基丙烯酸化壳聚糖1-2%和聚丙烯酸0.1-0.2%溶于75-80℃的磷酸盐缓冲溶液PBS，充分溶解后，向其中加入光敏剂2,4,6-三甲基苯甲酰，得到所需水凝胶基质。

进一步的，所述步骤（4）在聚乙烯涂层纸上3D打印水凝胶的方法为：将配好的待打印生物墨水倒入3D打印专用料筒中，聚乙烯涂层纸作为基底，将水凝胶试样打印在聚乙烯涂层纸上，使水凝胶与聚乙烯涂层纸结合；3D打印技术参数：料筒温度为15℃-30℃，打印压强为0.1MPa-0.5MPa，平台温度为0℃-±4℃，打印速度为2.0-5.0mm/s，针头直径为0.16-0.31mm，水凝胶高度为230-560μm，可根据病人实际伤口大小情况量身定做。

进一步的，所述步骤（5）将步骤（4）制备的试样进行交联的条件：在紫外280-285nm条件下，功率设为10-15 mW cm^-2，紫外照射20-25 min至水凝胶完全固化干燥，便于运输存放。

本发明提出一种含多重生长因子3D打印敷料粘带，基于活性保持和活性因子的释放动力学考虑，本发明对多重生长因子进行复配包裹，基于水凝胶具有保持伤口处水分、药物输送能力自身具有适宜粘附力，据此利用3D打印敷料粘带。与现有技术比，本发明的一种含多重生长因子3D打印敷料粘带具有以下优点：

（1）本敷料粘带具有可控制释放速率的包裹生长因子和水凝胶基质，在愈合过程中关键点释放生长因子蛋白分子实现可控给药；

（2）水凝胶基质为创面提供水润黏附状态，内部空间结构给予皮肤细胞增殖分化提供支撑，在组织液存在情况下不影响其黏附能力，加速创面愈合；

（3）可根据伤口形状大小及深度，设计符合伤口的敷料粘带打印尺寸，对于平面创面，可以直接剪裁；

（4）使用操作方便，提高创面愈合质量、减轻病人痛苦。

附图说明

图1为本发明的一种含多重生长因子3D打印敷料粘带结构示意图(A)、侧视图(B)和局部放大图(C)；

图2对照例和实施例1-6粘附力测试图；

图3对照例和实施例生长因子累计释放率；

图4对照例和实施例3，6伤口愈合率；

图5对照例和实施例1，4，6血管数量。

附图标记说明：1、聚乙烯涂层纸，2、完全固化水凝胶，3、生长因子粒子。

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种含多重生长因子3D打印敷料粘带做进一步详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

按照表1中的配方及制备条件，分别配制包裹生长因子粒子和水凝胶基质，混合成生物墨水后进行3D打印，并完成光固化。

表1敷料粘带的配方及打印条件表

对照例和实施例按照如下步骤制备：

（1）生长因子微球的制备；

（2）水凝胶基质的制备；

（4）在聚乙烯涂层纸3D打印水凝胶；

对照例和实施例的主要区别在于两点，第一，步骤（1）中对照例的生长因子没有进行包裹处理；第二，步骤（3）包裹生长因子微球和水凝胶基质的混合比例不同，并按照下表2进行混合。

表2 包裹生长因子微球与水凝胶基质的混合比例

本发明将实施例1～6和对比例制得的含多重生长因子3D打印敷料粘带分别进行动物皮肤刺激试验、皮肤致敏试验、体外细胞毒性试验，结果表明敷料粘带安全无毒。

为了验证本发明的优势，进行包括黏附能力、生长因子释放、创面愈合以及血管生成情况测试。具体测试结果如下：

（一）黏附能力测试

使用新鲜猪皮组织皮肤作为粘附物进行粘附力试验，以研究敷料粘带对宿主组织的粘附能力。将敷料粘带粘在在新鲜组织的表面（3 cm×1 cm），然后用美国美特斯MTS电子万能试验机对样品进行试验，传感器为50N，速度为5mm/min，共进行5次试验。

与对照组相比，实施例组更容易附着在伤口上，且黏附时间优于对照组，敷料基质有助于保持伤口湿润，生长因子可以加速伤口愈合。由图2可知，实施例组对猪皮组织的黏附能力均高于200 kpa,而对照组的黏附能力较弱不到30 kpa。由此可见，对生长因子进行包裹处理显著的增强了敷料粘带的黏附能力。本发明中起黏附作用的水凝胶基质是以胶原蛋白和壳聚糖为基础的可降解吸收生物大分子，随着创面愈合会逐渐降解，最后实现创面愈合。

（二）生长因子释放评价

为了评估生长因子的释放动力学，将对照例和实施例1裁剪重量为10.0-11.0 mg的粘带置于100 kDa透析膜中，并置于pH为7.4的0.1M DPBS溶液中。然后将样品置于37℃的轨道摇床上。在预定时间点，收集1 mL DPBS溶液，并在-20℃下储存以备以后使用分析，并补充等体积新鲜DPBS。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定释放过程中洗涤液中各种生长因子的浓度，间接测定EGF的负载效率。对所有样品进行为期6天的累积释放计算。

为了确定纤维网中生长因子的释放情况，通过酶联免疫吸附试验确定不同生长因子释放情况，如图3所示，对照例没有对生长因子进行包裹，实施例中初始的释放量为63%。在第1天几乎达到100%释放。相比之下，实施例通过对多重生长因子进行包裹后，在第一天的初始释放率为28%。随后表现出持续释放模式（第7天为40%）。实验结果表明，实施例通过包裹技术，具有明显的缓释特性，活性因子释放周期显著延长，与伤口愈合周期同步，更有利于创伤面的修复。

（三）创面愈合试验

采用全层皮肤缺损模型评估创面治疗。选取36只小鼠，分成4组，在小鼠背部造成厚度为30mm的圆形伤口，观察其0-4周创面愈合情况。第一个伤口作为对照，不进行治疗，其他伤口对照例和实施例粘带覆盖。在第1、2和4周，用数码相机拍摄伤口表面。然后，将所有图像调整到相同的大小，根据代表伤口的像素数测量伤口面积。伤口愈合速率用以下公式计算公式：其中A0表示伤口部位的原始像素数，而Ai代表测量时伤口部位的像素数。

为了评价我们的双重生长因子释放网片的体内性能，我们在小鼠背部建立了全厚度皮肤伤口。治疗1周、2周和4周后，观察每个伤口的大体外观。伤口愈合率随时间的变化如图4所示，在第1周和第2周，含有包裹生长因子的实施例3和6的伤口面积明显小于实施例1（p<0.05），而没有包裹生长因子的对照例的伤口面积几乎与开放性伤口对照组相同。治疗4周后，所有伤口均闭合；然而，实施例6表现出最小的疤痕形成和更多的毛发覆盖，愈合过程更快。同对照例相比，实施例比对照例的愈合速度提高了30%。

（四）愈合组织血管生成情况

采用全层皮肤缺损模型评估创面治疗。选用15只小鼠，评估在3D打印敷料粘带中包裹的VEGF是否会加速体内结构物的血管化。取老鼠背部的皮肤组织，用10%福尔马林固定。组织标本用石蜡包埋切片。切片用苏木精-伊红H&E染色观察血管浸润情况，在多个H&E染色切片上进行定量分析，在每个构建体中的单独切片上对血管（管腔内内皮细胞和红细胞呈阳性染色）进行计数，计算平均值。

两周后，苏木精和伊红（H&E）染色样本的组织学分析显示，实施例组中存在血管，但在对照组中没有明显的血管，血管内皮生长因子的血管主要分布在实施例粘带周围。四周后，三个实施例1，4，6均有成熟血管存在。如图5所示，实施例6的血管明显增多，是对照例血管生成数量的2倍，显著促进了血管生成，加速创面愈合。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims

1.一种含有多重生长因子的3D打印敷料，其特征在于，包括生长因子微球和水凝胶基质。

2.根据权利要求1所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料，其特征在于，生长因子微球包括以下重量百分比组分：

海藻酸钠2.0-3.0%，氯化钙2.0-4.0%，表皮生长因子EGF 0.05-1%，成纤维生长因子FGE0.05-1%，血小板生长因子PDGF 0.05-1%和血管生成生长因子VEGF 0.05-1%；

凝胶基质包括以下重量百分比组分：

3.根据权利要求1所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料粘带的制备步骤如下：

（1）制备生长因子微球；

（2）制备水凝胶基质；

（4）在聚乙烯涂层纸上3D打印水凝胶；

4.根据权利要求3所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料粘带的制备步骤，其特征在于，所述步骤（1）是将海藻酸钠2.5%溶液和表皮生长因子EGF 0.05-1%，成纤维生长因子FGF 0.05-1%，血小板生长因子PDGF 0.05-1%和血管生成生长因子VEGF 0.05-1%混合均匀后，利用造粒机将混合均匀的溶液逐滴加入氯化钙3%中，形成包裹生长因子的微球。

5.根据权利要求3所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料粘带的制备步骤，其特征在于，所述步骤（2）是将甲基丙烯酸化明胶5-7%、甲基丙烯酸化壳聚糖1-2%和聚丙烯酸0.1-0.2%溶于75-80℃的磷酸盐缓冲溶液PBS，充分溶解后，向其中加入光敏剂2,4,6-三甲基苯甲酰，得到所需水凝胶基质。

6.根据权利要求3所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料粘带的制备步骤，其特征在于，所述步骤（4）在聚乙烯涂层纸上3D打印水凝胶的方法为：

将配好的待打印生物墨水倒入3D打印专用料筒中，聚乙烯涂层纸作为基底，将水凝胶试样打印在聚乙烯涂层纸上，使水凝胶与聚乙烯涂层纸结合；

3D打印技术参数：料筒温度为15℃-30℃，打印压强为0.1MPa-0.5MPa，平台温度为0℃-±4℃，打印速度为2.0-5.0mm/s，针头直径为0.16-0.31mm，水凝胶高度为230-560μm。

7.根据权利要求3所述的一种含有多重生长因子的3D打印敷料粘带的制备步骤，其特征在于，

所述步骤（5）将步骤（4）制备的试样进行交联的条件：在紫外280-285 nm条件下，功率设为10-15 mW cm^-2，紫外照射20-25 min至水凝胶完全固化干燥。