CN112574967A - 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用 - Google Patents

植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112574967A
CN112574967A CN202011626161.3A CN202011626161A CN112574967A CN 112574967 A CN112574967 A CN 112574967A CN 202011626161 A CN202011626161 A CN 202011626161A CN 112574967 A CN112574967 A CN 112574967A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glutamine synthetase
gly
glufosinate
mutant
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011626161.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112574967B (zh
Inventor
邓龙群
陈容
张震
候清江
胥南飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Tianyu Xinghe Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Sichuan Tianyu Xinghe Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Tianyu Xinghe Biological Technology Co ltd filed Critical Sichuan Tianyu Xinghe Biological Technology Co ltd
Priority to CN202011626161.3A priority Critical patent/CN112574967B/zh
Publication of CN112574967A publication Critical patent/CN112574967A/zh
Priority to PCT/CN2021/133918 priority patent/WO2022142936A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112574967B publication Critical patent/CN112574967B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/01—Acid-ammonia (or amine)ligases (amide synthases)(6.3.1)
    • C12Y603/01002—Glutamate-ammonia ligase (6.3.1.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了植物来源的植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用，涉及基因工程技术领域。本发明公开的谷氨酰胺合成酶突变体相较于野生型谷氨酰胺合成酶第n位具有突变，突变后为D、E、G、H、N、P、Q、V或删除，该突变赋予谷氨酰胺合成酶草铵膦抗性。该谷氨酰胺合成酶突变体可以用于培育草铵膦抗性的植物新品种。

Description

植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸 分子以及应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用。
背景技术
谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)是植物氮代谢的关键酶，它在谷氨酸合成酶循环中催化谷氨酸(Gln)与NH3缩合形成谷氨酰胺(Glu)，参与植物含氮化合物的新陈代谢。根据分布及亚细胞定位，可将高等植物GS(属GSII类)同工酶分为两种：一种位于细胞质内称为胞质型GS(GS1)，分子量为38-40kDa；另一种位于叶绿体(或质体)内称为质体型GS(GS2)，分子量为44-45kDa。
草铵膦(glufosinate，glufosinate ammoniμM，商品名称Basta)是由安万特公司(现为拜耳公司)开发的谷氨酰胺合成酶(GS1)抑制剂，其有效成分为phosphinothricin(简称PPT)，化学名称为(RS)-2-氨基-4-(羟基甲基氧膦基)丁酸铵。该产品于1986年上市，销售额逐年上升。草铵膦的靶标酶是GS，在正常情况下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate。但在PPT处理后，PPT先与ATP结合，磷酸化的PPT占据GS分子的8个反应中心，使GS的空间构型发生变化，从而GS的活性受到抑制。PPT能抑制GS所有已知的形式。
草铵膦抑制GS的结果，可以导致植物体内氮代谢紊乱，铵的过量积累，叶绿体解体，从而光合作用受抑制，最终导致植物死亡。
目前培育抗草铵膦品种的主要方法是应用基因工程手段将来自细菌的抗草铵膦基因导入农作物中，从而培育出转基因抗草铵膦作物新品种。目前农业上应用最广的抗草铵膦基因是来源于菌株Streptomyces hygroscopicus的bar基因和菌株S.viridochromogenes的pat基因。Bar基因和pat基因具有80％的同源性，都可以编码草铵膦乙酰化酶，而该酶可以使草铵膦乙酰化而失活。抗草铵膦品种具有极大的使用价值，其中抗性油菜、玉米等已大面积商业化种植。
但是由于反转基因浪潮，转基因作物在全世界的接受程度仍然较低，即使在转基因作物种植面积最大的美洲，转基因也主要局限于玉米、大豆、棉花等几个作物。特别是bar基因和pat基因来源于微生物，而不是来源于农作物本身，更容易造成消费者的抵触心理。
Bar基因和pat基因编码的草铵膦乙酰化酶可以使草铵膦乙酰化而失活，但是在草铵膦接触GS之前，该酶很难使草铵膦完全失活，因为很多GS分布在细胞膜上，因此草铵膦在转bar基因和pat基因农作物上应用时，会不同程度的干扰植物的氮代谢，同时影响植物正常的生长和发育。在植物中过量表达野生型GS可以降低转基因植物对草铵膦的敏感程度，但其耐性程度不足以商业化应用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用。本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体原始来源于植物，通过突变后具有了草铵膦抗性，转化该谷氨酰胺合成酶突变体的植物不仅具有草铵膦抗性，也能够正常生长和发育。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其如下(1)或(2)所示：
(1)：其由来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；所述第n位的位置通过如下方式确定：所述野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，所述野生型谷氨酰胺合成酶的所述第n位对应于所述参考序列的第68位，其中，所述参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述谷氨酰胺合成酶突变体的所述第n位的氨基酸为X，X＝D、E、G、H、N、P、Q、V或删除。
(2)：其与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体在所述第n位的氨基酸相同、以及具有草铵膦抗性。
本发明的研究发现，将植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列进行比对，将其序列上对应于参考序列第68位的氨基酸位点即第n位进行突变，突变为D、E、G、H、N、P、Q、V或删除，所得到的谷氨酰胺合成酶突变体具有草铵膦抗性，同时保持自身的生物酶催化活性。转化本发明提供的植物谷氨酰胺合成酶突变体的植株或重组菌均能够在草铵膦存在的条件下正常生长和发育，该植物谷氨酰胺合成酶突变体不仅用于转基因作物培育，也可应用于培育抗草铵膦非转基因植物或转基因植物例如水稻、烟草、大豆、玉米、小麦、油菜、棉花和高粱等，具有广阔的应用前景。
上述参考序列为水稻来源的野生型谷氨酰胺合成酶。
序列比对方法可使用Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行Protein Blast比对；采用本领域熟知的其他序列比对方法或工具也可以得到相同的结果。
需要说明的是，野生型谷氨酰胺合成酶的第n位在其自身序列上可能也是第68位(例如玉米、小麦、大豆、油菜等)，但也可能不是第68位，第n位的具体位置根据前述序列比对后确定，只要其通过与参考序列比对后，对应于参考序列第68位的位点即为本发明所述的第n位，也就是突变位点。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述植物包括但不限于小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯中的任意一种。
所有植物的野生型谷氨酰胺合成酶都具有同源性，在植物体内具有基本相同的功能和结构域。因此，任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶在第68位作上述突变后所得到的谷氨酰胺合成酶突变体都具有草铵膦抗性。因此，由任意植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶作上述突变后得到的谷氨酰胺合成酶突变体均属于本发明的保护范围。
此外，本领域技术人员知晓并容易实现，在(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体的非保守区域进行简单的氨基酸替换或删除或增加等操作并维持第n位为上述突变后的氨基酸，并使进一步突变得到的谷氨酰胺合成酶突变体与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％等)以上的同一性，且其功能包括酶催化活性和草铵膦抗性与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体相当或略有下降或略有提高或大幅提高等。因此，此类谷氨酰胺合成酶也应属于本发明的保护范围。
需要说明的是，X＝删除，是指野生型谷氨酰胺合成酶第n位氨基酸被删除，即缺失突变。
本发明的研究还发现，针对不同的植物来源的谷氨酰胺合成酶，将其第n位突变为D、E、G、H、N、P、Q、V或删除之外，将其突变为其他的氨基酸也会使得谷氨酰胺合成酶具有草铵膦抗性。
例如，可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为水稻或玉米时，X＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y或删除；
当所述植物为大豆时，X＝D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、V、Y或删除；
当所述植物为小麦时，X＝D、E、G、H、N、P、Q、V或删除；
当所述植物为油菜时，X＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、T、V、W、Y或删除。
本发明的研究还发现，针对不同的植物来源的谷氨酰胺合成酶，将其第n位突变为D、E、G、H、N、P、Q、V和删除之外其他的氨基酸也会使得谷氨酰胺合成酶具有草铵膦抗性。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为水稻时，水稻野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.1：
MASLTDLVNLNLSDTTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLSGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILVMCDCYTPAGEPIPTNKRHNAAKIFSSPEVASEEPWYGIEQEYTLLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGIGADKSFGRDIVDSHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISAGDQVWVARYILERITEIAGVVVSFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTKSMRNDGGYEIIKSAIEKLKLRHKEHISAYGEGNERRLTGRHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYIVTSMIAETTIIWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为玉米时，玉米野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.2：
MACLTDLVNLNLSDNTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLSGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDCYTPAGEPIPTNKRYNAAKIFSSPEVAAEEPWYGIEQEYTLLQKDTNWPLGWPIGGFPGPQGPYYCGIGAEKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISSGDQVWVARYILERITEIAGVVVTFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTESMRKEGGYEVIKAAIEKLKLRHREHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTIIWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为大豆时，大豆野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.3：
MSLLSDLINLNLSDTTEKVIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLPGPVSDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVIIYPQAIFRDPFRRGNNILVICDTYTPAGEPIPTNKRHDAAKVFSHPDVVAEETWYGIEQEYTLLQKDIQWPLGWPVGGFPGPQGPYYCGVGADKAFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISAGDEVWAARYILERITEIAGVVVSFDPKPIQGDWNGAGAHTNYSTKSMRNDGGYEVIKTAIEKLGKRHKEHIAAYGEGNERRLTGRHETADINTFLWGVANRGASVRVGRDTEKAGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIADTTILWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为小麦时，小麦野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.4：
MALLTDLLNLDLTDSTEKIIAEYIWIGGSGMDLRSKARTLPGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRKGNNILVMCDCYTPAGVPIPTNKRYNAAKIFSNPDVAKEEPWYGIEQEYTLLQKDINWPLGWPVGGFPGPQGPYYCSIGADKSFGRDIVDSHYKACLFAGVNISGINGEVMPGQWEFQVGPTVGISAGDQVWVARYLLERITEIAGVVVTFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTESMRKDGGFKVIVDAVEKLKLKHKEHIAAYGEGNERRLTGKHETADINTFSWGVANRGASVRVGRETEQNGKGYFEDRRPASNMDPYVVTSMIAETTILWKP。
可选的，在本发明的一些实施方案中，当所述植物为油菜时，油菜野生型谷氨酰胺合成酶为SEQ ID NO.5：
MSLLTDLVNLNLSETTDKIIAEYIWVGGSGMDMRSKARTLPGPVSDPSELPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDAYTPAGEPIPTNKRHAAAKVFSHPDVVAEVPWYGIEQEYTLLQKDVNWPLGWPIGGFPGPQGPYYCSVGADKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPAVGISAGDEIWVARFILERITEIAGVVVSFDPKPIPGDWNGAGAHCNYSTKSMREDGGYEIIKKAIDKLGLRHKEHIAAYGEGNERRLTGHHETADINTFLWGVANRGASIRVGRDTEKEGKGYFEDRRPASNMDPYIVTSMIAETTILWKP。
部分植物来源的野生型谷氨酰胺合成酶相互间的相似性(Similarity)和同一性(Identity)如下表所示，其序列比对的部分结果见图13，箭头所示为第68位氨基酸。
Figure BDA0002877513680000031
Figure BDA0002877513680000041
上述相似性(Similarity)和同一性(Identity)的比对方法为：将一个物种的氨基酸序列输入到Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行ProteinBlast比对，从比对结果中查找此物种和其他需要比对的物种的相似性(Similarity)和同一性(Identity)。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码如上任一项所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。
在本发明提供了上述氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。例如，可以在编码野生型谷氨酰胺合成酶的核酸序列上作对应的核苷酸突变得到编码上述谷氨酰胺合成酶突变体的核酸序列。这对本领域技术人员来说是容易实现的。
例如，水稻野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.6：
atggcttctctcaccgatctcgtcaacctcaacctctccgacaccacggagaagatcatcgccgagtacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaggctaggactctctccggccctgtgactgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgatggctccagcaccggccaggcccccggcgaggacagtgaggtcatcctgtacccacaggctatcttcaaggacccattcaggaagggaaacaacatccttgtcatgtgcgattgctacacgccagccggagaaccgatccccaccaacaagaggcacaatgctgccaagatcttcagctcccctgaggttgcttctgaggagccctggtacggtattgagcaagagtacaccctcctccagaaggacatcaactggccccttggctggcctgttggtggcttccctggtcctcagggtccttactactgtggtatcggtgctgacaagtcttttgggcgtgatattgttgactcccactacaaggcttgcctctatgccggcatcaacatcagtggaatcaacggcgaggtcatgccaggacagtgggagttccaagttggcccgtctgtcggcatttctgccggtgatcaggtgtgggttgctcgctacattcttgagaggatcaccgagatcgccggagtcgtcgtctcatttgaccccaagcccatcccgggagactggaacggtgctggtgctcacaccaactacagcaccaagtcgatgaggaacgatggtggctacgagatcatcaagtccgccattgagaagctcaagctcaggcacaaggagcacatctccgcctacggcgagggcaacgagcgccggctcaccggcaggcacgagaccgccgacatcaacaccttcagctggggagttgccaaccgcggcgcctcggtccgcgtcggccgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggatcgccggccggcgtccaacatggacccttacatcgtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctga。
据此，在序列基础上，在对应于其编码氨基酸序列第68位的密码子进行对应的核苷酸突变，即可得到编码如上所述的水稻谷氨酰胺合成酶突变体。
玉米野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.7：
atggcctgcctcaccgacctcgtcaacctcaacctctcggacaacaccgagaagatcatcgcggaatacatatggatcggtggatctggcatggatctcaggagcaaagcaaggaccctctccggcccggtgaccgatcccagcaagctgcccaagtggaactacgacggctccagcacgggccaggcccccggcgaggacagcgaggtcatcctgtacccgcaggccatcttcaaggacccattcaggaggggcaacaacatccttgtgatgtgcgattgctacaccccagccggcgagccaatccccaccaacaagaggtacaacgccgccaagatcttcagcagccctgaggtcgccgccgaggagccgtggtatggtattgagcaggagtacaccctcctccagaaggacaccaactggccccttgggtggcccatcggtggcttccccggccctcagggtccttactactgtggaatcggcgccgaaaagtcgttcggccgcgacatcgtggacgcccactacaaggcctgcttgtatgcgggcatcaacatcagtggcatcaacggggaggtgatgccagggcagtgggagttccaagtcgggccttccgtgggtatatcttcaggcgaccaggtctgggtcgctcgctacattcttgagaggatcacggagatcgccggtgtggtggtgacgttcgacccgaagccgatcccgggcgactggaacggcgccggcgcgcacaccaactacagcacggagtcgatgaggaaggagggcgggtacgaggtgatcaaggcggccatcgagaagctgaagctgcggcacagggagcacatcgcggcatacggcgagggcaacgagcgccggctcaccggcaggcacgagaccgccgacatcaacacgttcagctggggcgtggccaaccgcggcgcgtcggtgcgcgtgggccgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggaccgccgcccggcgtccaacatggacccctacgtggtcacctccatgatcgccgagaccaccatcatctggaagccctga。
大豆野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.8：
atgtcgctgctctcagatctcatcaaccttaacctctcagacactactgagaaggtgatcgcagagtacatatggatcggtggatcaggaatggacctgaggagcaaagcaaggactctcccaggaccagttagcgacccttcaaagcttcccaagtggaactatgatggttccagcacaggccaagctcctggagaagacagtgaagtgattatatacccacaagccattttcagggatccattcagaaggggcaacaatatcttggttatctgtgatacttacactccagctggagaacccattcccactaacaagaggcacgatgctgccaaggttttcagccatcctgatgttgttgctgaagagacatggtatggtattgagcaggaatacaccttgttgcagaaagatatccaatggcctcttgggtggcctgttggtggtttccctggaccacagggtccatactactgtggtgttggcgctgacaaggcttttggccgtgacattgttgacgcacattacaaagcctgtctttatgctggcatcaacatcagtggaattaatggagaagtgatgcccggtcagtgggaattccaagttggaccttcagttggaatctcagctggtgacgaggtgtgggcagctcgttacatcttggagaggatcactgagattgctggtgtggtggtttcctttgatcccaagccaattcagggtgattggaatggtgctggtgctcacacaaactacagcactaagtccatgagaaatgatggtggctatgaagtgatcaaaaccgccattgagaagttggggaagagacacaaggagcacattgctgcttatggagaaggcaacgagcgtcgtttaacagggcgccacgaaaccgctgacatcaacaccttcttatggggagttgcaaaccgtggagcttcagttagggttgggagggacacagagaaagcagggaagggatattttgaggacagaaggccagcttctaacatggacccatatgtggttacttccatgattgcagacacaaccattctgtggaagccatga。
小麦野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.9：
atggcgctcctcaccgatctcctcaacctcgacctcaccgactccacggagaagatcatcgccgagtacatatggatcggcggatctggcatggatctcaggagcaaagccaggaccctccccggcccggtcaccgaccccagcaagctgcccaagtggaactacgacggctccagcaccggccaggcccccggcgaggacagcgaggtcatcctgtacccacaggccatcttcaaggacccgttcaggaagggcaacaacatccttgtcatgtgcgattgctacaccccagctggagtgccaatccccaccaacaagagatacaacgctgccaagatctttagcaaccctgatgttgccaaggaggagccatggtacggtatcgagcaggagtacaccctcctacagaaggacatcaactggcctctcggctggcctgttggtggattccctggtcctcagggtccttactactgtagtattggtgctgacaagtcgtttgggcgtgacatagttgactcccactacaaggcctgcctctttgccggcgtcaacatcagtggcatcaacggcgaggtcatgcccggacagtgggagttccaagttggcccgactgtcggcatctctgctggtgaccaagtgtgggttgctcgctaccttcttgagaggatcactgagatcgccggagttgtcgtcacatttgaccccaagcccatcccaggcgactggaacggtgctggtgctcacacaaactacagtaccgagtcgatgaggaaggacggcgggttcaaggtcatcgtggacgctgtcgagaagctcaagctgaagcacaaggagcacatcgccgcctacggcgagggcaacgagcgccgtctcaccggcaagcacgaaaccgccgacatcaacaccttcagctggggtgtcgcgaaccgtggcgcgtcggtgcgcgtgggacgggagacggagcagaacggcaagggctacttcgaggaccgccggccggcgtccaacatggacccctacgtggtcacctccatgatcgccgagaccaccatcctgtggaagccctga。
油菜野生型谷氨酰胺合成酶的编码核酸序列为SEQ ID NO.10：
atgagtcttcttacagatctcgttaaccttaacctctcagagaccactgacaaaatcattgcggaatacatatgggttggaggttcaggaatggatatgagaagcaaagccaggactcttcctggaccagtgagtgacccttcggagctaccaaagtggaactatgatggctcaagcacaggccaagctcctggtgaagacagtgaagtcatcttataccctcaagccatattcaaagatcctttccgtagaggcaacaacattcttgtcatgtgcgatgcttacactccagcgggcgaaccgatcccaacaaacaaaagacacgctgcggctaaggtctttagccaccccgatgttgtagctgaagtgccatggtatggtattgagcaagagtatactttacttcagaaagatgtgaactggcctcttggttggcctattggcggcttccccggtcctcagggaccatactattgtagtgttggagcagataaatcttttggtagagacatcgttgatgctcactacaaggcctgcttatacgctggcatcaatattagtggcatcaacggagaagtcatgcctggtcagtgggagttccaagttggtccagctgttggtatctcggccggtgatgaaatttgggtcgcacgtttcattttggagaggatcacagagattgctggtgtggtggtatcttttgacccaaaaccgattcccggtgactggaatggtgctggtgctcactgcaactatagtaccaagtcaatgagggaagatggtggttacgagattattaagaaggcaatcgataaactgggactgagacacaaagaacacattgcagcttacggtgaaggcaatgagcgccgtctcacgggtcaccacgagactgctgacatcaacactttcctctggggtgttgcgaaccgtggagcatcaatccgtgtaggacgtgacacagagaaagaagggaaaggatactttgaggataggaggccagcttcgaacatggatccttacattgtgacttccatgattgcagagaccacaatcctctggaaaccttga。
另一方面，本发明提供一种载体，其含有如上所述的核酸分子。
另一方面，本发明提供一种重组菌或重组细胞，其含有如上所述的核酸分子或如上所述的载体。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、如上所述的核酸分子、如上所述的载体或如上所述的重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。
可选的，在本发明的一些实施方案中，其包括：将载体转化目的植物，所述载体含有编码所述谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因。
可选的，在本发明的一些实施方案中，其包括：修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码所述谷氨酰胺合成酶突变体。
可选的，在本发明的一些实施方案中，其包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码所述谷氨酰胺合成酶突变体。
在本发明提供了谷氨酰胺合成酶突变体的基础上，本领域技术人员容易想到通过本领域常规的转基因技术、基因编辑技术(如通过锌指核酸内切酶(ZFN，zinc-fingernucleases)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN，transcription activator-likeeffector nucleases)技术或CRISPR/Cas9)、诱变育种技术(如化学、辐射诱变等)等对目标植物进行改造，使其具有编码如上所述谷氨酰胺合成酶突变体的基因，进而获得草铵膦抗性并能够正常生长和发育，进行得到具有草铵膦抗性的植物新品种。因此，无论采用何种技术，只要其利用了本发明提供的谷氨酰胺合成酶突变体赋予植物草铵膦抗性，则属于本发明的保护范围。
可选的，在本发明的一些实施方案中，所述目的植物包括但不限于小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯中的任意一种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX和野生型水稻GS1 OsGS1_WT的氨基酸序列部分比对结果。
图2为本发明实施例2提供的大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX和野生型大豆GS1 GmGS1_WT的氨基酸序列部分比对结果。
图3为本发明实施例2提供的玉米GS1突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX和野生型玉米GS1 ZmGS1_WT的氨基酸序列部分比对结果。
图4为本发明实施例2提供的小麦GS1突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX和野生型小麦GS1 TaGS1_WT的氨基酸序列部分比对结果。
图5为本发明实施例2提供的油菜GS1突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX和野生型油菜GS1 BnGS1_WT的氨基酸序列部分比对结果。
图6为本发明实验例1提供的pADV7载体的结构示意图。
图7为本发明实验例1提供的转化实施例1提供的水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX和野生型水稻GS1 OsGS1_WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。
图8为本发明实验例2提供的转化实施例2提供的大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX和野生型大豆GS1 GmGS1_WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。
图9为本发明实验例3提供的转化实施例3提供的玉米GS1突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX和野生型玉米GS1 ZmGS1_WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。
图10为本发明实验例4提供的转化实施例4提供的小麦GS1突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX和野生型小麦GS1 TaGS1_WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。
图11为本发明实验例5提供的转化实施例5提供的油菜GS1突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX和野生型油菜GS1 BnGS1_WT的大肠杆菌在含不同浓度草铵膦的培养基上的生长结果。
图12为本发明实验例6提供的水稻GS1突变体OsP、大豆GS1突变体GmQ、玉米GS1突变体ZmV、小麦GS1突变体TaG、油菜GS1突变体BnE、野生型水稻GS1 OsGS1_WT、野生型大豆GS1 GmGS1_WT、野生型玉米GS1 ZmGS1_WT、野生型小麦GS1 TaGS1_WT和野生型油菜GS1BnGS1_WT的酶动力学参数和草铵膦抗性参数IC50。
图13为不同植物野生型谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列比对结果；图中：TaGS1_WT：小麦野生型谷氨酰胺合成酶体；OsGS1_WT：水稻野生型谷氨酰胺合成酶体；ZmGS1_WT：玉米野生型谷氨酰胺合成酶体；GmGS1_WT：大豆野生型谷氨酰胺合成酶体；BnGS1_WT：油菜野生型谷氨酰胺合成酶体。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的水稻(Oryza sativa)谷氨酰胺合成酶(GS1)突变体，其由野生型水稻谷氨酰胺合成酶自身(命名为OsGS1_WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列为SEQ IDNO.6)的第68位氨基酸残基S突变为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y或删除得到，得到的水稻GS1突变体分别命名为OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX。
水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY、OsX和野生型水稻GS1的氨基酸序列比对如图1所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各水稻GS1突变体的编码序列在编码第68位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
氨基酸 A C D E F
密码子 GCC TGC GAT GAG TTC
氨基酸 G H I K L
密码子 GGT CAC ATC AAG CTC
氨基酸 M N P Q R
密码子 ATG AAC CCC CAG CGC
氨基酸 T V W Y 删除
密码子 ACC GTC TGG TAC 无
本实施例提供的水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例2
本实施例提供的大豆(Glycine max)GS1突变体，其由野生型大豆GS1自身((命名为GmGS1_WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.8)的第68位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第68位)由氨基酸残基S突变为D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、V、Y或删除得到。得到的水稻大豆GS1突变体分别命名为GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX。
大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY、GmX和野生型大豆GS1的氨基酸序列比对如图2所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例提供的大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX的编码序列对应于SEQ ID NO.3。
本实施例中，各大豆GS1突变体的编码序列在编码第68位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
Figure BDA0002877513680000071
本实施例提供的大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例3
本实施例提供的玉米(Zea mays)GS1突变体，其由野生型玉米GS1自身(命名为ZmGS1_WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.7)的第68位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第68位)由氨基酸残基S突变为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y或删除得到。得到的玉米GS1突变体分别命名为ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX。
玉米GS1突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY、ZmX和野生型玉米GS1的氨基酸序列比对如图3所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各玉米GS1突变体的编码序列在编码第68位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
Figure BDA0002877513680000072
Figure BDA0002877513680000081
本实施例提供的玉米GS1突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例4
本实施例提供的小麦(Triticum aestivum)GS1突变体，其由野生型小麦GS1自身(命名为TaGS1_WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.9)的第68位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第68位)由氨基酸残基S突变为D、E、G、H、N、P、Q、V或删除得到。得到的小麦GS1突变体分别命名为TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX。
小麦GS1突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV、TaX和野生型小麦GS1的氨基酸序列比对如图4所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各小麦GS1突变体的编码序列在编码第68位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
Figure BDA0002877513680000082
本实施例提供的小麦GS1突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实施例5
本实施例提供的油菜(Brassica napus)GS1突变体，其由野生型油菜GS1自身(命名为BnGS1_WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.10)的第68位(对应于参考序列(SEQ ID NO.1)的第68位)由氨基酸残基S突变为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、T、V、W、Y或删除得到。得到的油菜GS1突变体分别命名为BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX。
油菜GS1突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY、BnX和野生型油菜GS1的氨基酸序列比对如图5所示，图中：箭头所指示的位置为突变位点。
本实施例中，各油菜GS1突变体的编码序列在编码第68位氨基酸的位置上，对应氨基酸所用的密码子如下表所示，其余位置的核苷酸同相应的野生型编码序列。
Figure BDA0002877513680000083
本实施例提供的油菜GS1突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX和编码它们的核酸分子均可以通过化学合成的方法获得。
实验例1
检测实施例1提供的水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的草铵膦抗性，方法如下：
根据实施例1提供的核酸分子的序列，采用化学合成的方法合成编码水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的编码基因，两端引入酶切位点(Pac1和Sbf1)，酶切后，在连接酶的作用下连接至经相同酶切处理后的表达载体(例如pADV7载体，其结构如图6所示)上，然后分别转化谷氨酰胺合成酶缺陷型大肠杆菌，经验证后，挑取阳性克隆，接种至含不同浓度草铵膦的M9培养基上生长，观察缺陷型大肠杆菌生长情况。以野生型水稻GS1突变体作为负对照，检测含有GS1突变体OsA(S68A，水稻GS1的第68位的氨基酸S突变为A)、OsC(S68C)、OsD(S68D)、OsE(S68E)、OsF(S68F)、OsG(S68G)、OsH(S68H)、OsI(S68I)、OsK(S68K)、OsL(S68L)、OsM(S68M)、OsN(S68N)、OsP(S68P)、OsQ(S68Q)、OsR(S68R)、OsT(S68T)、OsV(S68V)、OsW(S68W)、OsY(S68Y)和OsX(S68Δ)的草铵膦抗性。结果如图7所示。
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型水稻GS1(OsGS1_WT)及水稻GS1突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含10mM草铵膦(KP10)的培养基上，转化野生型水稻GS1的大肠杆菌不能生长，但转化了水稻突变体OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更好草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化水稻GS1突变体OsA、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsV、OsW、OsY和OsX的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明OsA、OsC、OsD、OsE、OsF、OsG、OsH、OsI、OsK、OsL、OsM、OsN、OsP、OsQ、OsR、OsT、OsV、OsW、OsY和OsX的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
实验例2
参考实验例1的检测方法，验证实施例2提供的大豆GS1突变体GmD(S68D，大豆GS1的第68位的氨基酸S突变为D)、GmE(S68E)、GmG(S68G)、GmH(S68H)、GmI(S68I)、GmK(S68K)、GmK(S68M)、GmN(S68N)、GmP(S68P)、GmQ(S68Q)、GmV(S68V)、GmK(S68Y)和GmX(S68Δ)的草铵膦抗性。结果如图8所示。
根据图8的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型大豆GS1(GmGS1_WT)及大豆GS1突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmN、GmP、GmQ、GmV和GmX的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmN、GmP、GmQ、GmV和GmX编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型大豆GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了大豆突变体GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmM、GmN、GmP、GmQ、GmV、GmY和GmX的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化大豆GS1突变体GmG和GmQ的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明GmD、GmE、GmG、GmH、GmI、GmK、GmN、GmP、GmQ、GmV和GmX的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且大豆GS1突变体GmG和GmQ的抗草铵膦能力更强。
实验例3
参考实验例1的检测方法，验证实施例3提供的玉米GS1突变体ZmA(S68A，玉米GS1的第68位的氨基酸S突变为A)、ZmC(S68C)、ZmD(S68D)、ZmE(S68E)、ZmE(S68F)、ZmG(S68G)、ZmH(S68H)、ZmI(S68I)、ZmK(S68K)、ZmL(S68L)、ZmM(S68M)、ZmN(S68N)、ZmP(S68P)、ZmQ(S68Q)、ZmR(S68R)、ZmT(S68T)、ZmV(S68V)、ZmW(S68W)、ZmY(S68Y)和ZmX(S68Δ)的草铵膦抗性。结果如图9所示。
根据图9的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型玉米GS1(ZmGS1_WT)及玉米GS1突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型玉米GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了玉米突变体ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含ZmA、ZmC、ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmR、ZmT、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化玉米GS1突变体ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明ZmD、ZmE、ZmF、ZmG、ZmH、ZmI、ZmK、ZmL、ZmM、ZmN、ZmP、ZmQ、ZmV、ZmW、ZmY和ZmX的单突变体都具有抗草铵膦的能力。
实验例4
参考实验例1的检测方法，验证实施例4提供的小麦GS1突变体TaD(S68D，玉米GS1的第68位的氨基酸S突变为D)、TaE(S68E)、TaG(S68G)、TaH(S68H)、TaN(S68N)、TaP(S68P)、TaQ(S68Q)、TaV(S68V)和TaX(S68Δ)的草铵膦抗性。结果如图10所示。
根据图10的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型小麦GS1(TaGS1_WT)及小麦GS1突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含1mM草铵膦(KP1)的培养基上，转化野生型小麦GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了小麦突变体TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(10mM，KP10)的培养基上，转化小麦GS1突变体TaN的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明TaD、TaE、TaG、TaH、TaN、TaP、TaQ、TaV和TaX的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且小麦GS1突变体TaN的抗草铵膦能力更强。
实验例5
参考实验例1的检测方法，验证实施例5提供的油菜GS1突变体BnA(S68A，玉米GS1的第68位的氨基酸S突变为A)、BnC(S68C)、BnD(S68D)、BnE(S68E)、BnF(S68F)、BnG(S68G)、BnH(S68H)、BnI(S68I)、BnK(S68K)、BnL(S68L)、BnM(S68M)、BnN(S68N)、BnP(S68P)、BnQ(S68Q)、BnT(S68T)、BnV(S68V)、BnW(S68W)、BnY(S68E)和BnX(S68Δ)的草铵膦抗性。结果如图11所示。
根据图11的结果可看出：
在含0mM草铵膦(KP0)的培养基上，转化编码野生型油菜GS1(BnGS1_WT)及油菜GS1突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX的编码基因的缺陷型菌株均能正常生长，表明由BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX编码的GS1都具有正常GS1酶活力；
在含2mM草铵膦(KP2)的培养基上，转化野生型油菜GS1的大肠杆菌基本上不能生长，但转化了油菜突变体BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX的大肠杆菌生长明显优于负对照，说明含BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX的单突变体抗草铵膦的能力明显优于野生型；在更高草铵膦浓度(20mM，KP20)的培养基上，转化油菜GS1突变体BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnV、BnW和BnY的大肠杆菌都还有明显生长。
这些结果说明BnA、BnC、BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnT、BnV、BnW、BnY和BnX的单突变体都具有抗草铵膦的能力，且油菜GS1突变体BnD、BnE、BnF、BnG、BnH、BnI、BnK、BnL、BnM、BnN、BnP、BnQ、BnV、BnW和BnY的抗草铵膦能力更强。
实验例6
检测实施例1提供的OsP、实施例2提供的GmQ、实施例3提供的ZmV、实施例4提供的TaG和实施例5提供的BnE突变体的酶动力学参数和在有草铵膦时的酶动力学参数，以野生型水稻GS1 OsGS1_WT、野生型大豆GS1 GmGS1_WT、野生型玉米GS1 ZmGS1_WT、野生型小麦GS1 TaGS1_WT和野生型油菜GS1 BnGS1_WT为对照，方法如下：
载体构建：
将编码上述突变体的核酸序列克隆到原核表达载体pET32a中，测序验证克隆。
6His蛋白纯化：
通过6His和用标准方法纯化突变体酶蛋白，用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒测定浓度，蛋白保存在蛋白贮存液中。
酶活测定：
1.仪器和试剂：酶标仪(德铁：HBS-1096A)，草铵膦，底物L-谷氨酸钠(CAS：6106-04-3)。
2.操作步骤：
谷氨酰胺合成酶酶活测定反应液组分为：100mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM ATP，10mML-谷氨酸钠，30mM hydroxylamine，20mM MgCl2。100μl反应液混匀后35℃预热5min后，加入1μl突变体蛋白液(蛋白浓度为200ug/ml)开始反应，35℃反应60min后，加入110μl反应终止液(55g/L FeCl3·6H2O，20g/L三氯乙酸，2.1％浓盐酸)终止反应，静置10min。5000Xg离心10min，取200μl在500nm处测定光吸收值。
结果如图12所示。
根据图12的结果可以看出：
相对于野生型对照OsGS_WT、GmGS1_WT、ZmGS1_WT、TaGS1_WT和BnGS1_WT，GS1突变体的Km值都较之略偏高，说明GS突变体在降低对草铵膦抑制剂的敏感度的同时，略为降低了对正常底物的敏感度。GS1突变体的Vmax均高于野生型对照，说明这些突变体的酶催化能力有所提高。野生型对照对草铵膦很敏感，IC50分别为7.93μM、13.55μM、8.92μM、7.22μM和1.5μM，突变体的IC50均明显高于野生型对照，OsP、GmQ、ZmV和TaG的IC50远远高于野生型对照，表明突变体对草铵膦更不敏感。从突变体IC50和野生型IC50的倍数关系上也可以看出，OsP、GmQ、ZmV、TaG和BnE的IC50分别是对应野生型GS1 IC50的63.05倍、32.34倍、36.69倍、23.83倍和15.83倍，这些数值也说明突变体的酶活性远远高于野生型对照。这些数据从酶动力学上说明了突变体的抗草铵膦机制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川天豫兴禾生物科技有限公司
<120> 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Ser Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr
1 5 10 15
Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp
20 25 30
Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Lys Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr
85 90 95
Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg His Asn Ala Ala Lys
100 105 110
Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ser Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Ile Asn Trp Pro Leu Gly
130 135 140
Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly
145 150 155 160
Ile Gly Ala Asp Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ser His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ala Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Lys Ser
245 250 255
Met Arg Asn Asp Gly Gly Tyr Glu Ile Ile Lys Ser Ala Ile Glu Lys
260 265 270
Leu Lys Leu Arg His Lys Glu His Ile Ser Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Glu
305 310 315 320
Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Ile Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile
340 345 350
Ile Trp Lys Pro
355
<210> 2
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Cys Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Asp Asn Thr
1 5 10 15
Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp
20 25 30
Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Ser Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr
85 90 95
Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Tyr Asn Ala Ala Lys
100 105 110
Ile Phe Ser Ser Pro Glu Val Ala Ala Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Thr Asn Trp Pro Leu Gly
130 135 140
Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly
145 150 155 160
Ile Gly Ala Glu Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ser Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Glu Ser
245 250 255
Met Arg Lys Glu Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ala Ala Ile Glu Lys
260 265 270
Leu Lys Leu Arg His Arg Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Glu
305 310 315 320
Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile
340 345 350
Ile Trp Lys Pro
355
<210> 3
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Leu Leu Ser Asp Leu Ile Asn Leu Asn Leu Ser Asp Thr Thr
1 5 10 15
Glu Lys Val Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp
20 25 30
Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Ser Asp Pro Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Ile Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Arg Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Ile Cys Asp Thr Tyr Thr
85 90 95
Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg His Asp Ala Ala Lys
100 105 110
Val Phe Ser His Pro Asp Val Val Ala Glu Glu Thr Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Ile Gln Trp Pro Leu Gly
130 135 140
Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Gly
145 150 155 160
Val Gly Ala Asp Lys Ala Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ser Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ala Gly Asp Glu Val Trp Ala Ala Arg Tyr Ile Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Gln
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Lys Ser
245 250 255
Met Arg Asn Asp Gly Gly Tyr Glu Val Ile Lys Thr Ala Ile Glu Lys
260 265 270
Leu Gly Lys Arg His Lys Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly Arg His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Leu Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Asp
305 310 315 320
Thr Glu Lys Ala Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Asp Thr Thr Ile
340 345 350
Leu Trp Lys Pro
355
<210> 4
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ala Leu Leu Thr Asp Leu Leu Asn Leu Asp Leu Thr Asp Ser Thr
1 5 10 15
Glu Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Ile Gly Gly Ser Gly Met Asp
20 25 30
Leu Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Thr Asp Pro Ser
35 40 45
Lys Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Lys Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Cys Tyr Thr
85 90 95
Pro Ala Gly Val Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg Tyr Asn Ala Ala Lys
100 105 110
Ile Phe Ser Asn Pro Asp Val Ala Lys Glu Glu Pro Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Ile Asn Trp Pro Leu Gly
130 135 140
Trp Pro Val Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Ser
145 150 155 160
Ile Gly Ala Asp Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ser His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Phe Ala Gly Val Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Thr Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ala Gly Asp Gln Val Trp Val Ala Arg Tyr Leu Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Thr Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Thr Asn Tyr Ser Thr Glu Ser
245 250 255
Met Arg Lys Asp Gly Gly Phe Lys Val Ile Val Asp Ala Val Glu Lys
260 265 270
Leu Lys Leu Lys His Lys Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly Lys His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Ser Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Val Arg Val Gly Arg Glu
305 310 315 320
Thr Glu Gln Asn Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Val Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile
340 345 350
Leu Trp Lys Pro
355
<210> 5
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Ser Leu Leu Thr Asp Leu Val Asn Leu Asn Leu Ser Glu Thr Thr
1 5 10 15
Asp Lys Ile Ile Ala Glu Tyr Ile Trp Val Gly Gly Ser Gly Met Asp
20 25 30
Met Arg Ser Lys Ala Arg Thr Leu Pro Gly Pro Val Ser Asp Pro Ser
35 40 45
Glu Leu Pro Lys Trp Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Gly Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Glu Asp Ser Glu Val Ile Leu Tyr Pro Gln Ala Ile Phe Lys Asp
65 70 75 80
Pro Phe Arg Arg Gly Asn Asn Ile Leu Val Met Cys Asp Ala Tyr Thr
85 90 95
Pro Ala Gly Glu Pro Ile Pro Thr Asn Lys Arg His Ala Ala Ala Lys
100 105 110
Val Phe Ser His Pro Asp Val Val Ala Glu Val Pro Trp Tyr Gly Ile
115 120 125
Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Leu Gln Lys Asp Val Asn Trp Pro Leu Gly
130 135 140
Trp Pro Ile Gly Gly Phe Pro Gly Pro Gln Gly Pro Tyr Tyr Cys Ser
145 150 155 160
Val Gly Ala Asp Lys Ser Phe Gly Arg Asp Ile Val Asp Ala His Tyr
165 170 175
Lys Ala Cys Leu Tyr Ala Gly Ile Asn Ile Ser Gly Ile Asn Gly Glu
180 185 190
Val Met Pro Gly Gln Trp Glu Phe Gln Val Gly Pro Ala Val Gly Ile
195 200 205
Ser Ala Gly Asp Glu Ile Trp Val Ala Arg Phe Ile Leu Glu Arg Ile
210 215 220
Thr Glu Ile Ala Gly Val Val Val Ser Phe Asp Pro Lys Pro Ile Pro
225 230 235 240
Gly Asp Trp Asn Gly Ala Gly Ala His Cys Asn Tyr Ser Thr Lys Ser
245 250 255
Met Arg Glu Asp Gly Gly Tyr Glu Ile Ile Lys Lys Ala Ile Asp Lys
260 265 270
Leu Gly Leu Arg His Lys Glu His Ile Ala Ala Tyr Gly Glu Gly Asn
275 280 285
Glu Arg Arg Leu Thr Gly His His Glu Thr Ala Asp Ile Asn Thr Phe
290 295 300
Leu Trp Gly Val Ala Asn Arg Gly Ala Ser Ile Arg Val Gly Arg Asp
305 310 315 320
Thr Glu Lys Glu Gly Lys Gly Tyr Phe Glu Asp Arg Arg Pro Ala Ser
325 330 335
Asn Met Asp Pro Tyr Ile Val Thr Ser Met Ile Ala Glu Thr Thr Ile
340 345 350
Leu Trp Lys Pro
355
<210> 6
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggcttctc tcaccgatct cgtcaacctc aacctctccg acaccacgga gaagatcatc 60
gccgagtaca tatggatcgg tggatctggc atggatctca ggagcaaggc taggactctc 120
tccggccctg tgactgatcc cagcaagctg cccaagtgga actacgatgg ctccagcacc 180
ggccaggccc ccggcgagga cagtgaggtc atcctgtacc cacaggctat cttcaaggac 240
ccattcagga agggaaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacgcc agccggagaa 300
ccgatcccca ccaacaagag gcacaatgct gccaagatct tcagctcccc tgaggttgct 360
tctgaggagc cctggtacgg tattgagcaa gagtacaccc tcctccagaa ggacatcaac 420
tggccccttg gctggcctgt tggtggcttc cctggtcctc agggtcctta ctactgtggt 480
atcggtgctg acaagtcttt tgggcgtgat attgttgact cccactacaa ggcttgcctc 540
tatgccggca tcaacatcag tggaatcaac ggcgaggtca tgccaggaca gtgggagttc 600
caagttggcc cgtctgtcgg catttctgcc ggtgatcagg tgtgggttgc tcgctacatt 660
cttgagagga tcaccgagat cgccggagtc gtcgtctcat ttgaccccaa gcccatcccg 720
ggagactgga acggtgctgg tgctcacacc aactacagca ccaagtcgat gaggaacgat 780
ggtggctacg agatcatcaa gtccgccatt gagaagctca agctcaggca caaggagcac 840
atctccgcct acggcgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaggcacga gaccgccgac 900
atcaacacct tcagctgggg agttgccaac cgcggcgcct cggtccgcgt cggccgggag 960
acggagcaga acggcaaggg ctacttcgag gatcgccggc cggcgtccaa catggaccct 1020
tacatcgtca cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccctg a 1071
<210> 7
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggcctgcc tcaccgacct cgtcaacctc aacctctcgg acaacaccga gaagatcatc 60
gcggaataca tatggatcgg tggatctggc atggatctca ggagcaaagc aaggaccctc 120
tccggcccgg tgaccgatcc cagcaagctg cccaagtgga actacgacgg ctccagcacg 180
ggccaggccc ccggcgagga cagcgaggtc atcctgtacc cgcaggccat cttcaaggac 240
ccattcagga ggggcaacaa catccttgtg atgtgcgatt gctacacccc agccggcgag 300
ccaatcccca ccaacaagag gtacaacgcc gccaagatct tcagcagccc tgaggtcgcc 360
gccgaggagc cgtggtatgg tattgagcag gagtacaccc tcctccagaa ggacaccaac 420
tggccccttg ggtggcccat cggtggcttc cccggccctc agggtcctta ctactgtgga 480
atcggcgccg aaaagtcgtt cggccgcgac atcgtggacg cccactacaa ggcctgcttg 540
tatgcgggca tcaacatcag tggcatcaac ggggaggtga tgccagggca gtgggagttc 600
caagtcgggc cttccgtggg tatatcttca ggcgaccagg tctgggtcgc tcgctacatt 660
cttgagagga tcacggagat cgccggtgtg gtggtgacgt tcgacccgaa gccgatcccg 720
ggcgactgga acggcgccgg cgcgcacacc aactacagca cggagtcgat gaggaaggag 780
ggcgggtacg aggtgatcaa ggcggccatc gagaagctga agctgcggca cagggagcac 840
atcgcggcat acggcgaggg caacgagcgc cggctcaccg gcaggcacga gaccgccgac 900
atcaacacgt tcagctgggg cgtggccaac cgcggcgcgt cggtgcgcgt gggccgggag 960
acggagcaga acggcaaggg ctacttcgag gaccgccgcc cggcgtccaa catggacccc 1020
tacgtggtca cctccatgat cgccgagacc accatcatct ggaagccctg a 1071
<210> 8
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgtcgctgc tctcagatct catcaacctt aacctctcag acactactga gaaggtgatc 60
gcagagtaca tatggatcgg tggatcagga atggacctga ggagcaaagc aaggactctc 120
ccaggaccag ttagcgaccc ttcaaagctt cccaagtgga actatgatgg ttccagcaca 180
ggccaagctc ctggagaaga cagtgaagtg attatatacc cacaagccat tttcagggat 240
ccattcagaa ggggcaacaa tatcttggtt atctgtgata cttacactcc agctggagaa 300
cccattccca ctaacaagag gcacgatgct gccaaggttt tcagccatcc tgatgttgtt 360
gctgaagaga catggtatgg tattgagcag gaatacacct tgttgcagaa agatatccaa 420
tggcctcttg ggtggcctgt tggtggtttc cctggaccac agggtccata ctactgtggt 480
gttggcgctg acaaggcttt tggccgtgac attgttgacg cacattacaa agcctgtctt 540
tatgctggca tcaacatcag tggaattaat ggagaagtga tgcccggtca gtgggaattc 600
caagttggac cttcagttgg aatctcagct ggtgacgagg tgtgggcagc tcgttacatc 660
ttggagagga tcactgagat tgctggtgtg gtggtttcct ttgatcccaa gccaattcag 720
ggtgattgga atggtgctgg tgctcacaca aactacagca ctaagtccat gagaaatgat 780
ggtggctatg aagtgatcaa aaccgccatt gagaagttgg ggaagagaca caaggagcac 840
attgctgctt atggagaagg caacgagcgt cgtttaacag ggcgccacga aaccgctgac 900
atcaacacct tcttatgggg agttgcaaac cgtggagctt cagttagggt tgggagggac 960
acagagaaag cagggaaggg atattttgag gacagaaggc cagcttctaa catggaccca 1020
tatgtggtta cttccatgat tgcagacaca accattctgt ggaagccatg a 1071
<210> 9
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggcgctcc tcaccgatct cctcaacctc gacctcaccg actccacgga gaagatcatc 60
gccgagtaca tatggatcgg cggatctggc atggatctca ggagcaaagc caggaccctc 120
cccggcccgg tcaccgaccc cagcaagctg cccaagtgga actacgacgg ctccagcacc 180
ggccaggccc ccggcgagga cagcgaggtc atcctgtacc cacaggccat cttcaaggac 240
ccgttcagga agggcaacaa catccttgtc atgtgcgatt gctacacccc agctggagtg 300
ccaatcccca ccaacaagag atacaacgct gccaagatct ttagcaaccc tgatgttgcc 360
aaggaggagc catggtacgg tatcgagcag gagtacaccc tcctacagaa ggacatcaac 420
tggcctctcg gctggcctgt tggtggattc cctggtcctc agggtcctta ctactgtagt 480
attggtgctg acaagtcgtt tgggcgtgac atagttgact cccactacaa ggcctgcctc 540
tttgccggcg tcaacatcag tggcatcaac ggcgaggtca tgcccggaca gtgggagttc 600
caagttggcc cgactgtcgg catctctgct ggtgaccaag tgtgggttgc tcgctacctt 660
cttgagagga tcactgagat cgccggagtt gtcgtcacat ttgaccccaa gcccatccca 720
ggcgactgga acggtgctgg tgctcacaca aactacagta ccgagtcgat gaggaaggac 780
ggcgggttca aggtcatcgt ggacgctgtc gagaagctca agctgaagca caaggagcac 840
atcgccgcct acggcgaggg caacgagcgc cgtctcaccg gcaagcacga aaccgccgac 900
atcaacacct tcagctgggg tgtcgcgaac cgtggcgcgt cggtgcgcgt gggacgggag 960
acggagcaga acggcaaggg ctacttcgag gaccgccggc cggcgtccaa catggacccc 1020
tacgtggtca cctccatgat cgccgagacc accatcctgt ggaagccctg a 1071
<210> 10
<211> 1071
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgagtcttc ttacagatct cgttaacctt aacctctcag agaccactga caaaatcatt 60
gcggaataca tatgggttgg aggttcagga atggatatga gaagcaaagc caggactctt 120
cctggaccag tgagtgaccc ttcggagcta ccaaagtgga actatgatgg ctcaagcaca 180
ggccaagctc ctggtgaaga cagtgaagtc atcttatacc ctcaagccat attcaaagat 240
cctttccgta gaggcaacaa cattcttgtc atgtgcgatg cttacactcc agcgggcgaa 300
ccgatcccaa caaacaaaag acacgctgcg gctaaggtct ttagccaccc cgatgttgta 360
gctgaagtgc catggtatgg tattgagcaa gagtatactt tacttcagaa agatgtgaac 420
tggcctcttg gttggcctat tggcggcttc cccggtcctc agggaccata ctattgtagt 480
gttggagcag ataaatcttt tggtagagac atcgttgatg ctcactacaa ggcctgctta 540
tacgctggca tcaatattag tggcatcaac ggagaagtca tgcctggtca gtgggagttc 600
caagttggtc cagctgttgg tatctcggcc ggtgatgaaa tttgggtcgc acgtttcatt 660
ttggagagga tcacagagat tgctggtgtg gtggtatctt ttgacccaaa accgattccc 720
ggtgactgga atggtgctgg tgctcactgc aactatagta ccaagtcaat gagggaagat 780
ggtggttacg agattattaa gaaggcaatc gataaactgg gactgagaca caaagaacac 840
attgcagctt acggtgaagg caatgagcgc cgtctcacgg gtcaccacga gactgctgac 900
atcaacactt tcctctgggg tgttgcgaac cgtggagcat caatccgtgt aggacgtgac 960
acagagaaag aagggaaagg atactttgag gataggaggc cagcttcgaa catggatcct 1020
tacattgtga cttccatgat tgcagagacc acaatcctct ggaaaccttg a 1071

Claims (10)

1.一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，其如下(1)或(2)所示：
(1)：其由来源于植物的野生型谷氨酰胺合成酶的第n位发生突变得到；所述第n位的位置通过如下方式确定：所述野生型谷氨酰胺合成酶与参考序列比对，所述野生型谷氨酰胺合成酶的所述第n位对应于所述参考序列的第68位，其中，所述参考序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述谷氨酰胺合成酶突变体的所述第n位的氨基酸为X，X＝D、E、G、H、N、P、Q、V或删除；
(2)：其与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体至少具有85％以上的同一性、且与(1)所示的谷氨酰胺合成酶突变体在第n位的氨基酸相同、以及具有草铵膦抗性。
2.根据权利要求1所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，所述植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体，其特征在于，当所述植物为水稻或玉米时，X＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y或删除；
当所述植物为大豆时，X＝D、E、G、H、I、K、M、N、P、Q、V、Y或删除；
当所述植物为小麦时，X＝D、E、G、H、N、P、Q、V或删除；
当所述植物为油菜时，X＝A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、T、V、W、Y或删除。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1-3任一项所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体。
5.一种载体，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子。
6.一种重组菌或重组细胞，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的载体。
7.权利要求1-3任一项所述的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体或权利要求6所述的重组菌或重组细胞在培育具有草铵膦抗性的植物品种中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其包括：将载体转化目的植物，所述载体含有编码所述谷氨酰胺合成酶突变体的编码基因。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其包括：修饰目的植物的内源谷氨酰胺合成酶基因，使其编码所述谷氨酰胺合成酶突变体。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，其包括：对植物细胞、组织、个体或群体进行诱变和筛选，使其编码所述谷氨酰胺合成酶突变体；
优选的，所述目的植物选自小麦、水稻、大麦、燕麦、玉米、高粱、谷子、荞麦、黍稷、绿豆、蚕豆、豌豆、扁豆、甘薯、马铃薯、棉花、大豆、油菜、芝麻、花生、向日葵、萝卜、胡萝卜、芜菁、甜菜、白菜、芥菜、甘蓝、花椰菜、芥蓝、黄瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜、菜瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子、辣椒、菜豆、豇豆、毛豆、韭菜、大葱、洋葱、韭葱、菠菜、芹菜、苋菜、莴苣、茼蒿、黄花菜、葡萄、草莓、甜菜、甘蔗、烟草、苜蓿、牧草、草坪草、茶和木薯中的任意一种。
CN202011626161.3A 2020-12-31 2020-12-31 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用 Active CN112574967B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011626161.3A CN112574967B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用
PCT/CN2021/133918 WO2022142936A1 (zh) 2020-12-31 2021-11-29 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011626161.3A CN112574967B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112574967A true CN112574967A (zh) 2021-03-30
CN112574967B CN112574967B (zh) 2023-08-01

Family

ID=75144437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011626161.3A Active CN112574967B (zh) 2020-12-31 2020-12-31 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN112574967B (zh)
WO (1) WO2022142936A1 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113073088A (zh) * 2021-03-31 2021-07-06 四川天豫兴禾生物科技有限公司 具有三酮类除草剂抗性的hir突变体及其在植物育种中的应用
CN113604443A (zh) * 2021-09-15 2021-11-05 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及培育抗草铵膦的植物品种中的应用
CN113736757A (zh) * 2021-09-15 2021-12-03 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
CN113957060A (zh) * 2021-10-26 2022-01-21 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及应用
CN114058600A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
WO2022142936A1 (zh) * 2020-12-31 2022-07-07 四川天豫兴禾生物科技有限公司 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用
CN114774375A (zh) * 2022-04-25 2022-07-22 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体
CN114807064A (zh) * 2022-06-06 2022-07-29 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及其突变体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116970577B (zh) * 2023-09-20 2023-12-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 谷氨酰胺合成酶突变体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986002097A1 (en) * 1984-10-01 1986-04-10 The General Hospital Corporation Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
US4975374A (en) * 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US20090018016A1 (en) * 2006-06-08 2009-01-15 Athenix Corporation Bacterial glutamine synthetases and methods of use
CN110229794A (zh) * 2019-07-01 2019-09-13 四川天豫兴禾生物科技有限公司 具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103757033B (zh) * 2013-12-25 2015-08-19 上海市农业科学院 一种提高植物草铵膦抗性的水稻谷氨酰胺合成酶突变基因及其制备方法和应用
CN111635892B (zh) * 2020-06-29 2021-10-08 合肥戬谷生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
CN112574967B (zh) * 2020-12-31 2023-08-01 四川天豫兴禾生物科技有限公司 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1986002097A1 (en) * 1984-10-01 1986-04-10 The General Hospital Corporation Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
US4975374A (en) * 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US20090018016A1 (en) * 2006-06-08 2009-01-15 Athenix Corporation Bacterial glutamine synthetases and methods of use
CN110229794A (zh) * 2019-07-01 2019-09-13 四川天豫兴禾生物科技有限公司 具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AVILA‐GARCIA W V等: "Target‐site mutation associated with glufosinate resistance in Italian ryegrass (Lolium perenne L. ssp. multiflorum)", 《PEST MANAGEMENT SCIENCE》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022142936A1 (zh) * 2020-12-31 2022-07-07 四川天豫兴禾生物科技有限公司 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用
CN113073088A (zh) * 2021-03-31 2021-07-06 四川天豫兴禾生物科技有限公司 具有三酮类除草剂抗性的hir突变体及其在植物育种中的应用
CN113736757B (zh) * 2021-09-15 2023-12-15 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
CN113604443A (zh) * 2021-09-15 2021-11-05 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及培育抗草铵膦的植物品种中的应用
CN113736757A (zh) * 2021-09-15 2021-12-03 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
CN113604443B (zh) * 2021-09-15 2024-04-26 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及培育抗草铵膦的植物品种中的应用
WO2023040564A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及培育抗草铵膦的植物品种中的应用
WO2023040565A1 (zh) * 2021-09-15 2023-03-23 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
CN113957060A (zh) * 2021-10-26 2022-01-21 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及应用
CN113957060B (zh) * 2021-10-26 2024-04-23 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及应用
WO2023071438A1 (zh) * 2021-10-26 2023-05-04 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种谷氨酰胺合成酶突变体及应用
CN114058600A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
CN114058600B (zh) * 2021-11-16 2023-12-08 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
WO2023087812A1 (zh) * 2021-11-16 2023-05-25 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
CN114774375B (zh) * 2022-04-25 2024-04-19 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体
CN114774375A (zh) * 2022-04-25 2022-07-22 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体
CN114807064B (zh) * 2022-06-06 2024-04-19 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及其突变体
CN114807064A (zh) * 2022-06-06 2022-07-29 四川天豫兴禾生物科技有限公司 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及其突变体

Also Published As

Publication number Publication date
CN112574967B (zh) 2023-08-01
WO2022142936A1 (zh) 2022-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112574967A (zh) 植物来源的具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子以及应用
CN110229794B (zh) 具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用和培育方法
CN113604443B (zh) 一种谷氨酰胺合成酶突变体及培育抗草铵膦的植物品种中的应用
EP2465340B1 (en) EPSPS mutants
HUT60766A (en) Process for producing glyphosate-tolerant 5-enol-pyruvyl-3-phosphoshikimate synthase enzymes, plant genes encoding them and transformed plants comprising same
JP3538998B2 (ja) 長鎖プレニル二燐酸合成酵素
CN113736757B (zh) 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、核酸分子及应用
CN114107234B (zh) 具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体、重组基因、重组载体及其应用
CN114774375B (zh) 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及谷氨酰胺合成酶突变体
CN109182291B (zh) 一种含k85突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用
CN114058600B (zh) 一种具有草铵膦抗性的谷氨酰胺合成酶突变体及其应用
CN113957060B (zh) 一种谷氨酰胺合成酶突变体及应用
Saroha et al. Glyphosate-tolerant crops: genes and enzymes
REN et al. Overexpression of a modified AM79 aroA gene in transgenic maize confers high tolerance to glyphosate
CN114807064B (zh) 一种获得具有草铵膦抗性的蛋白的方法及其突变体
AU673849B2 (en) Derivatives of (bauhinia purpurea) lectin and their use as larvicides
CN117363633A (zh) 一种核酸分子、载体、重组菌、gs突变体及其应用
CN116769739A (zh) 一种含g294突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用
CN116875568A (zh) 一种含g61突变的植物谷氨酰胺合成酶突变体及其编码基因和应用
US20230127011A1 (en) Methods and compositions for herbicide tolerance in plants
Overduin et al. The Asc locus for resistance to Alternaria stem canker in tomato does not encode the enzyme aspartate carbamoyltransferase
CN109554357A (zh) 一种含a138x1和l195x2突变的植物epsps突变体及其编码基因和应用
Shah et al. Genetic engineering of herbicide resistance genes
Duggleby et al. Expression in Escherichia coliof a Putative Human Acetohydroxyacid Synthase
WO2015013444A1 (en) Materials and methods for enhanced heat stability and kinetic parameters of adp-glucose pyrophosphorylase

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Deng Longqun

Inventor after: Chen Rong

Inventor after: Zhang Zhen

Inventor after: Hou Qingjiang

Inventor after: Xu Nanfei

Inventor before: Deng Longqun

Inventor before: Chen Rong

Inventor before: Zhang Zhen

Inventor before: Hou Qingjiang

Inventor before: Xu Nanfei

CB03 Change of inventor or designer information
CP02 Change in the address of a patent holder

Address after: 611500 No. 889 Xinqiong Road, Linqiong Street, Qionglai City, Chengdu, Sichuan Province

Patentee after: GEVOTO LLC

Address before: 3 / F, block B, building 6, No. 51, Tengfei Avenue, Qingyang District, Chengdu, Sichuan 610000

Patentee before: GEVOTO LLC

CP02 Change in the address of a patent holder