CN112568233A - 萝卜硫素及其衍生物在作为细菌效应蛋白转录抑制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了萝卜硫素及其衍生物在作为细菌效应蛋白转录抑制剂中的应用。本发明提供了萝卜硫素及其衍生物在如下1)‑7)中任一种中的应用：1)防治病原细菌；2)提高植物对病原细菌的抗性；3)抑制病原细菌的致病力；4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达；7)作为病原细菌效应蛋白转录抑制剂。通过实验证明：萝卜硫素及其衍生物可通过特异抑制病原细菌III型分泌系统的转录来抑制病原细菌III型分泌系统的功能，既可抵御病原细菌的入侵又不破坏植物与有益微生物的互作，在防治植物病原细菌中具有广泛的应用前景。

Description

萝卜硫素及其衍生物在作为细菌效应蛋白转录抑制剂中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及萝卜硫素及其衍生物在作为细菌效应蛋白转录抑制剂中的应用。
背景技术
植物与病原微生物长期协同进化过程中，逐渐形成了一系列复杂高效的保护机制来抵御病原微生物的侵染，其中植物的次级代谢产物发挥了重要的作用。植物免疫系统被激活后，会诱导其体内具有抗菌活性的次级代谢产物的合成和释放，帮助植物抵御病原微生物的入侵。参与植物天然免疫的次级代谢产物数量巨大且结构各异，根据合成机制及作用方式，将其分成两大类：植物体内组成型储存的抗菌次级代谢产物被称为phytoanticipins；而响应免疫信号重新合成的抗菌次级代谢产物被成为phytoalexins。
Phytoanticipins类抗菌次级代谢产物以活性或非活性前体形式储存在健康植物中，一旦植物受到病原微生物的入侵，就会将其释放出来并发挥作用。皂苷(saponins)、硫代葡萄糖苷(glucosinolates)和青苷(cyanogenic glycosides)是植物体内主要的phytoanticipin。皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，广泛存在于开花植物中。来源于燕麦的燕麦根皂苷(Avenacins)和来源于番茄的α-番茄苷(α-tomatine)在体外具有抑制真菌和卵菌生长的活性。硫代葡萄糖苷是十字花科植物的一类重要次级代谢产物，由不同氨基酸衍生而来，根据其侧链不同被分为脂肪族、芳香族和吲哚族三大类。异硫氢酸酯(isothiocyanate)是由甲硫氨酸衍生来的脂肪族硫代葡萄糖苷，在体外具有抑制真菌、细菌和昆虫等病原微生物生长的活性。同时，异硫氢酸酯在抵御拟南芥非寄主菌的侵染中也发挥重要作用。PEN2和单加氧酶CYP81F2是催化吲哚族硫代葡萄糖苷合成的关键蛋白，其双突变体表现出对大麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)和大豆疫酶(Phytophthora brassicae)等病原微生物抗性缺失的表型。
Phytoalexins是植物受到病原微生物胁迫后重新合成的一类次级代谢产物。目前，十字花科植物中发现的phytoalexins约有44种，包括camalexin、spirobrassinin、rutalexin和brassinin等，其中对camalexin的合成通路及作用机制研究得比较深入。Camalexin是一种重要的植保素，多种病原微生物(如细菌、卵菌、真菌和病毒)都能诱导其产生，与吲哚族硫代葡萄糖苷类似，Camalexin也衍生于色氨酸且在抑制真菌等病原微生物在植物细胞内的生长及向周围细胞的扩展中发挥重要作用，其产生依赖于单加氧酶CYP71B15和CYP71A13。
尽管目前发现的植保素种类繁多，结构、合成途径及作用对象各异，但其基本作用机制类似，即通过抑制病原微生物的基本生命活动来杀灭病原菌，靶标单一。如：Camalexin是一类膜干扰素，能够破坏细菌和真核生物细胞膜的完整性，而brassinin是一种线粒体抑制剂和抗氧化剂，能抑制线粒体的功能。传统植保素的缺点在于对作用对象没有选择性，在杀灭病原微生物的同时也破坏了环境中的有益微生物，而且容易导致抗药性。
革兰氏阴性细菌(如沙门氏菌和丁香假单胞菌)的III型分泌系统(type IIIsecretion system，TTSS)是其导致病害的主要武器。丁香假单胞菌的III型分泌系统是由“过敏反应与致病性”(hypersensitive response and pathogenicity，hrp)基因簇编码的，一旦细菌感受到外源信号，就会启动hrp基因的转录及III型分泌系统的组装，使细菌获得致病力。细菌的III型分泌系统是一个由镶嵌在细菌内膜中的基底环和凸出于细菌表面的针状细丝组成的注射器样结构，它可以将细菌的毒性蛋白转运到植物细胞内。这些毒性蛋白干扰植物的免疫受体识别和信号转导系统、破环植物囊泡运输系统、操纵植物激素改变植物生理活动、从而帮助病原菌侵入。
发明内容
本发明的一个目的是提供萝卜硫素或萝卜硫素衍生物的新用途。
本发明提供了萝卜硫素或萝卜硫素衍生物在下述1)-7)中至少一种中的应用；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达；
7)作为病原细菌效应蛋白转录抑制剂。
本发明还提供了萝卜硫素或萝卜硫素衍生物在制备具有下述1)-6)中至少一种功能的产品中的应用；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达。
本发明的另一个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品的活性成分为萝卜硫素或萝卜硫素衍生物；
所述产品具有下述1)-6)中至少一种功能；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达。
上述应用或产品中，所述提高植物对病原细菌的抗性为降低植物叶片中的细菌数目。
上述应用或产品中，所述萝卜硫素或萝卜硫素衍生物通过靶向HrpS第209位半胱氨酸抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达。
上述应用或产品中，所述抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达为降低病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的相对转录水平。
上述应用或产品中，所述III型分泌系统效应蛋白相关基因为如下至少一种：avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1。
本发明最后还提供了一种提高植物对病原细菌的抗性的方法。
本发明提供的提高植物对病原细菌的抗性的方法包括用萝卜硫素或萝卜硫素衍生物处理植物的步骤。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述病原细菌为具有III型分泌系统的病原细菌，如丁香假单胞菌。在本发明的一个具体实施例中，所述病原细菌为丁香假单胞菌ΔsaxAB/F/D/G。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为拟南芥。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述萝卜硫素衍生物为如下任一种：萝卜硫素衍生物AS1、萝卜硫素衍生物AS2、萝卜硫素衍生物AS3、萝卜硫素衍生物AS4、萝卜硫素衍生物AS5、萝卜硫素衍生物AS6、萝卜硫素衍生物AS7和萝卜硫素衍生物AS8。
所述萝卜硫素的结构式如下：
Figure BDA0002217820830000031
所述萝卜硫素的衍生物AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6、AS7、AS8的结构式分别如下：
Figure BDA0002217820830000041
本发明的萝卜硫素或萝卜硫素衍生物可人工合成也可通过购买获得。
上述萝卜硫素衍生物AS7或萝卜硫素衍生物AS8也属于本发明的保护范围。所述萝卜硫素衍生物AS7的制备方法具体如实施例1中所述。所述萝卜硫素衍生物AS8的制备方法具体如实施例2中所述。
本发明研究发现萝卜硫素及其衍生物能够特异地抑制细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的转录；萝卜硫素合成缺陷突变体myb28/29对细菌的抗性减弱。进一步研究发现，萝卜硫素特异地靶向HrpS第209位的半胱氨酸抑制细菌III型分泌系统的转录。通过实验证明：萝卜硫素及其衍生物可通过特异抑制病原细菌III型分泌系统的转录来抑制病原细菌III型分泌系统的功能，既可抵御病原细菌的入侵又不破坏植物与有益微生物的互作，在防治植物病原细菌中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为萝卜硫素和其衍生物的结构式。图1a为萝卜硫素的结构式。图1b为萝卜硫素衍生物的结构式。
图2为萝卜硫素衍生物AS7和AS8的合成路线。
图3为萝卜硫素抑制III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达。a为在体外萝卜硫素抑制Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因的表达。b为与野生型相比，接种myb28/29突变体的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G中效应蛋白相关基因的表达水平升高，而向myb28/29突变体回补20μM萝卜硫素可以恢复myb28/29突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因表达水平升高的表型。
图4为myb28/29突变体对Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的抗性减弱。
图5为萝卜硫素特异靶向HrpS第209位半胱氨酸。a为萝卜硫素特异抑制hrpL的转录。b和c为萝卜硫素与HrpS第209位半胱氨酸共价接合。d和e为HrpS第209位半胱氨酸介导萝卜硫素对丁香假单胞菌效应蛋白相关基因表达的抑制。f为HrpS第209位半胱氨酸介导萝卜硫素对丁香假单胞菌的抗性，Δsax代表Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G、Δsax C209A代表Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A、Δsax C278A代表Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A。
图6为萝卜硫素及其衍生物抑制丁香假单胞菌效应蛋白相关基因的表达。a为萝卜硫素和萝卜硫素衍生物AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6抑制效应蛋白相关基因avrPto、hrpL的相对转录水平；b为萝卜硫素衍生物AS7、AS8抑制效应蛋白相关基因avrPto、hrpL的相对转录水平。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的萝卜硫素是西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司的产品，结构式如图1a所示。萝卜硫素衍生物AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6记载于文献“Khiar,N.etal.Enantiopure sulforaphane analogues with various substituents at thesulfinyl sulfur:Asymmetric synthesis and biological activities.J.Org.Chem.74,6002-6009(2009)”和“Chen,X.et al.New method for the synthesis of sulforaphaneand related isothiocyanates.Synthesis 2011,3991-3996(2011).”中。萝卜硫素衍生物AS1-AS6结构式如图1b所示，表征数据具体如下：
AS1：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.55(t,J＝6.4Hz,2H),2.53(t,J＝6.9Hz,2H),2.10(s,3H),1.86-1.77(m,2H),1.76-1.68(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ44.7,33.3,28.8,25.8,15.4。
AS2：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.61(t,J＝6.3Hz,2H),3.06(t,J＝7.5Hz,2H),2.94(s,3H),2.06-1.96(m,2H),1.95-1.85(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ53.6,44.5,40.8,28.6,19.8.ESI+-MS:[M+H]+计算值C6H12NO2S2 +:194.0304；实测值:194.0302。
AS3：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67-7.58(m,2H),7.58-7.45(m,3H),3.60-3.45(m,2H),2.90-2.73(m,2H),1.93-1.69(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ157.1,143.4,131.1,129.3,123.9,115.1,55.9,44.6,28.9,19.5.ESI+-MS:[M+H]+计算值C11H14NOS2 +:192.0511；实测值:192.0508。
AS4：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.58(t,J＝6.1Hz,2H),2.77-2.60(m,4H),1.98-1.83(m,4H),1.32(t,J＝7.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ50.5,45.8,44.6,29.0,20.1,6.7.ESI+-MS:[M+H]+计算值C7H14NOS2 +:192.0511；实测值:192.0508.
AS5：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.82-3.67(m,2H),2.86-2.73(m,2H),2.63(s,3H),2.26-2.17(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ51.0,44.1,38.9,23.6.ESI+-MS:[M+H]+计算值C5H10NOS2 +:164.0198；实测值:164.0194。
AS6：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.53(t,J＝6.4Hz,2H),2.77-2.60(m,2H),2.56(s,3H),1.86-1.77(m,2H),1.77-1.68(m,2H),1.67-1.51(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ54.1,44.7,38.6,29.5,25.8,21.9.ESI+-MS:[M+H]+计算值C7H14NOS2 +:192.0511；实测值:192.0511。
下述实施例中的丁香假单胞菌Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G记载于文献“Fan,J.etal.Pseudomonas sax genes overcome aliphatic isothiocyanate-mediated non-hostresistance in Arabidopsis.Science 331,1185-1188(2011).”中。丁香假单胞菌PstDC3000ΔsaxAB/F/D/G是将丁香假单胞菌(P.syringae pv tomato DC3000，Pst DC3000)中的saxAB/F/D/G基因敲除后得到的菌。saxAB/F/D/G能降解萝卜硫素或其衍生物，解除其作用，因此丁香假单胞菌Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G不能降解萝卜硫素或其衍生物。
下述实施例中的萝卜硫素合成缺陷突变体myb28/29记载于文献“
Figure BDA0002217820830000061
I.E.et al.A systems biology approach identifies a R2R3 MYB gene subfamilywith distinct and overlapping functions in regulation of aliphaticglucosinolates.PLoS ONE 2,e1322(2007).”和“Beekwilder,J.,et al.The impact ofthe absence of aliphatic glucosinolates on insect herbivory inArabidopsis.PLoS ONE 3,e2068(2008).”中，萝卜硫素合成缺陷突变体myb28/29是野生型拟南芥(Col-0，哥伦比亚生态型)背景下Myb28和Myb29基因功能缺失的突变体。萝卜硫素是脂肪族葡萄糖苷的代谢产物，Myb28和Myb29是控制脂肪族葡萄糖苷通路合成酶的关键转录因子，myb28/29突变体中萝卜硫素的含量极低。
下述实施例中的puc19载体记载于文献“Li,L.et al.The FLS2-associatedkinase BIK1 directly phosphorylates the NADPH oxidase RbohD to control plantimmunity.Cell Host Microbe 15,329–338(2014).”中。
下述实施例中的pK18mobsacB记载于文献“Feng,F.,Yang,F.,Rong,W.,Wu,X.G.,Zhang,J.,Chen,S.,He,C.Z.,and Zhou,J.-M.(2012).AXanthomonas uridine5’-monophosphate transferase inhibits plant immune kinases.Nature 485,114-118.”中。
下述实施例中的pet28a载体记载于文献“Li,L.et al.The FLS2-associatedkinase BIK1 directly phosphorylates the NADPH oxidase RbohD to control plantimmunity.Cell Host Microbe 15,329–338(2014).”中。
下述实施例中的KB液体培养基(1L)配方如下：蛋白胨29g、甘油8mL、磷酸氢二钾1.96g、七水和硫酸镁1.52g。KB固体培养基(1L)是将15g琼脂与KB液体培养基(1L)混匀得到的。KB-蔗糖固体培养基(1L)KB固体培养基(1L)是将15g琼脂和100g蔗糖与KB液体培养基(1L)混匀得到的。
下述实施例中的基本培养基(1L)配方如下：磷酸二氢钾6.8g、硫酸铵1g、六水合氯化镁3.45mg、氯化钠100mg、果糖1.8g，pH5.7。
下述实施例中的LB培养基(1L)配方如下：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g。LB固体培养基(1L)是将15g琼脂与LB液体培养基(1L)混匀得到的。
下述实施例中所涉及的基因及其Genbank号如表1所示。
表1、基因及其Genbank号
基因名 Genbank号
saxA PSPTO_1858
saxB PSPTO_1859
saxF PSPTO_3100
saxD PSPTO_4304
saxG PSPTO_2592
avrPto PSPTO_4001
hopAM1 PSPTO_1022
hopH1 PSPTO_0588
hrpW1 PSPTO_1373
hrpT1 PSPTO_1390
hopC1 PSPTO_0589
hrpL PSPTO_1404
hrpR PSPTO_1379
hrpS PSPTO_1380
trp PSPTO_0159
实施例1、萝卜硫素衍生物AS7及其合成方法
按照以下步骤合成AS7：
(1)化合物8的合成：
Figure BDA0002217820830000071
将巯基乙胺(化合物7)(300mg，3.88mmol，1eq)(购买自梯希爱，产品目录号：60-23-1)和氢氧化钠(233mg，5.82mmol，1.5eq)溶解于乙醇(7.5mL)中，在0℃下加入碘甲烷(290μL，4.66mmol，1.2eq)。将混合物在室温下搅拌3小时，然后旋干并氯仿重新溶解过滤得到化合物8的粗品(图2A)。
(2)化合物9的合成：
Figure BDA0002217820830000081
将化合物8的粗品溶解于乙酸乙酯(30mL)和饱和碳酸氢钠中(20mL)，在0℃下加入邻硝基苯磺酰氯(1.29g，5.82mmol，1.5eq)。将混合物在室温下搅拌3小时，有机相水洗，旋蒸浓缩得到粗产物，通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝6:1)纯化，得到化合物9(900mg，84％)无色油(图2B)。
(3)化合物10的合成：
Figure BDA0002217820830000082
将化合物9(900mg，3.26mmol，1eq)的粗品溶解于四氢呋喃(10mL)和水(10mL)中，在0℃下加入高碘酸钠(976mg，4.56mmol，1.4eq)。将混合物在室温下搅拌8小时，旋干，加入水和乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥。通过柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝6:1)纯化，得到化合物10(877mg，92％)白色固体(图2C)。
(4)化合物12的合成：
Figure BDA0002217820830000083
将化合物10(188mg，0.64mmol，1eq)溶于4mL二甲基甲酰胺，在0℃下加入碳酸钾，然后在常温下搅拌15分钟，冷却到0℃，加入溶于2mL二甲基甲酰胺的化合物11(333.7mg，1.38mmol，1.5eq)，在常温搅拌15小时。乙酸乙酯(10mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得到化合物12(242mg，92％)白色固体(图2D)。
(5)化合物13的合成：
Figure BDA0002217820830000091
将化合物12(242mg，0.59mmol)溶于6mL乙腈中，在0℃加入碳酸铯和苯硫酚，然后在常温中搅拌2小时。硅藻土过滤，减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝10:1)纯化，得到化合物13(89mg，86％)无色液体(图2E)。
(6)化合物14的合成：
Figure BDA0002217820830000092
将化合物13(40mg，0.22mmol)溶于2mL乙醇中，在0℃加入4-戊炔甲醛、氰基硼氢化钠、乙酸，然后在常温下搅拌36小时。40％氢氧化钠加入到碱性，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得到化合物14(20mg，37％)无色液体(图2F)。
(7)化合物AS7的合成：
Figure BDA0002217820830000093
将化合物14(10.2mg，0.042mmol)溶于2mL乙醚中，加入三苯基磷，然后在40℃搅拌4小时。冷却到室温，加入2mL二硫化碳，回流5小时。减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得到化合物AS7(5.5mg，51％)无色液体(图2G)。
化合物AS7表征数据具体如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.70-3.52(m,2H),3.10-3.00(m,1H),2.93-2.84(m,2H),2.83-2.64(m,5H),2.63(s,3H),2.42-2.24(m,2H),1.95(t,J＝2.5Hz,1H),1.78-1.56(m,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ84.1,77.2,69.0,54.3,53.7,52.2,47.4,43.8,39.0,25.8,15.6.ESI+-MS:[M+H]+计算值C11H19N2OS2 +:259.0933；实测值:259.0932。
实施例2、萝卜硫素衍生物AS8及其合成
按照以下步骤合成AS8：
(1)化合物15的合成：
Figure BDA0002217820830000101
将化合物13(40mg，0.22mmol)溶于2mL乙醚中，在0℃下加入3-溴丙炔、碳酸铯，然后在室温下搅拌15小时。5mL水淬灭，二氯甲烷(10mL×3)萃取，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得到化合物15(20mg，43％)无色液体(图2H)。
(2)化合物AS8的合成：
Figure BDA0002217820830000102
将化合物15(10.7mg，0.05mmol)溶于2mL乙醚中，加入三苯基磷，然后在40℃搅拌4小时。冷却到室温，加入2mL二硫化碳，回流5小时。减压蒸除溶剂。通过柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝50:1)纯化，得到化合物AS8(6.2mg，54％)无色液体(图2I)。
化合物AS8表征数据具体如下：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.68-3.58(m,2H),3.51(t,J＝2.4Hz,2H),3.12-3.05(m,2H),2.94-2.79(m,4H),2.66(s,3H),2.27(t,J＝2.3Hz,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ77.4,74.0,53.4,53.1 46.8,43.6,42.3,39.0.ESI+-MS:[M+H]+计算值C9H15N2OS2 +:231.0620；实测值:231.0619。
实施例3、萝卜硫素在抑制丁香假单胞菌效应蛋白相关基因的表达中的应用
一、萝卜硫素抑制丁香假单胞菌效应蛋白的表达
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于在KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。
2、完成步骤1后，将获得的菌体用水洗两次，然后将菌体在基本培养基中重悬至OD＝0.4，得到重悬后的菌体。
3、完成步骤2后，向重悬后的菌体中加入萝卜硫素，使其在重悬后的菌体中的终浓度为20μM，6小时后利用实时荧光定量PCR的方法检测Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌体中效应蛋白(III型分泌系统分泌的效应蛋白)相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达情况。检测引物序列如表2所示。
表2、引物序列
引物名称 引物序列
16S-RT-F CATTGAGACAGGTGCTGCAT
16S-RT-R CACCGGCAGTCTCCTTAGAG
hopH1-RT-F GCAGAGGAAGCACTTGACCA
hopH1-RT-R TGCTTGCTTTGTCTGGTGAC
hopC1-RT-F ATGGCATCAGTCAGCGTG
hopC1-RT-R TAAACTTTCTGTGCCAGCCATCG
hopAM1-RT-F GGCGTAAAGAACATTGTCTC
hopAM1-RT-R GAAATCAGAACCCAGCCA
hopT1-RT-F ATGATGATTCGTAGCCTAACG
hopT1-RT-R CTAATCCTTTAACTGCACGACA
hrpW1-RT-F CACTGCCGACAAATCTATG
hrpW1-RT-R AGATTAGTGACCGCTGCG
avrPto-RT-F GCCTGAGAAATCGCTACAACA
avrPto-RT-R CGTTCGGGTTCATAGTCGCA
结果显示：20μM萝卜硫素使Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达水平下降到原来的30％左右(图3a)。
二、萝卜硫素抑制拟南芥中丁香假单胞菌效应蛋白相关基因的表达
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。将获得的菌体用水洗两次，然后用无菌水将菌体稀释至OD＝0.1。
2、完成步骤1后，将OD＝0.1的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液分别接种四周大的野生型拟南芥Col-0和myb28/29突变体的成熟叶片(菌液注射满整个叶片)，并在接种24小时后，分别检测Col-0和myb28/29突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达情况。
结果显示：接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的myb28/29突变体中的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因的表达水平明显高于接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的野生型(图3b)。
三、外源施加萝卜硫素可抑制myb28/29突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因的表达
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。将获得的菌体用水洗两次，然后用无菌水将菌体稀释至OD＝0.1。
2、完成步骤1后，分别进行如下各组实验：
Col-0：将OD＝0.1的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液接种野生型拟南芥Col-0，并在接种24小时后检测Col-0中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达情况。
myb28/29：将OD＝0.1的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液接种myb28/29突变体，并在接种24小时后，检测myb28/29突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达情况。
myb28/29+20μM萝卜硫素：向OD＝0.1的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液中加入萝卜硫素，使其终浓度达到20μM，得到含有萝卜硫素的细菌悬浮液。然后将含有萝卜硫素的细菌悬浮液接种myb28/29突变体，接种24小时后，检测myb28/29突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1的表达情况。
结果显示：向接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液的myb28/29突变体外源施加20μM萝卜硫素可抑制该突变体中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因的表达(图3c)。
实施例4、myb28/29突变体对丁香假单胞菌的抗性减弱
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。将获得的菌体用水洗两次，然后用无菌水将菌体稀释至OD＝0.001。
2、完成步骤1后，将OD＝0.001的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌液分别接种野生型拟南芥Col-0和myb28/29突变体。接种方法同实施例3中的方法。
3、完成步骤2后，分别检测接种第0天和第3天的Col-0和myb28/29突变体叶片中细菌的数目。具体步骤如下：用打孔器获取面积为0.5652cm2的叶片，并将其置于含有100μL无菌水的离心管中，轻柔研磨为匀浆，利用稀释法滴定细菌数目。
结果显示：接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的Col-0中的细菌数目的平均值为14541313/cm2；接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的突变体中的细菌数目平均值为40273355/cm2；接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的myb28/29突变体中的细菌数目明显多于接种PstDC3000ΔsaxAB/F/D/G的野生型(图4)。说明萝卜硫素合成缺失突变体(myb28/29突变体)对Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的抗性减弱，萝卜硫素可提高植物对病原细菌的抗性。
实施例5、萝卜硫素特异靶向HrpS第209位半胱氨酸
一、萝卜硫素抑制转录因子hrpL的表达
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。
2、完成步骤1后，将获得的菌体用水洗两次，然后将菌体在基本培养基中重悬至OD＝0.4，得到重悬后的菌体。
3、完成步骤2后，向重悬后的菌体中加入萝卜硫素，使其在重悬后的菌体中的终浓度为20μM，6小时后利用实时荧光定量PCR的方法检测调控Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白转录相关基因hrpR、hrpS、lon-1、rpoN、RphR、RphS、hrpL的表达情况。引物序列如表3所示。
表3、引物序列
引物名称 引物序列
16S-RT-F CATTGAGACAGGTGCTGCAT
16S-RT-R CACCGGCAGTCTCCTTAGAG
lon1-RT-F GCAACTGGGCAAGAAAGTC
lon1-RT-R GCCTTCATCTGCTCGTTCA
rpoN-RT-F AAACCCTATGCTGGAACGGC
rpoN-RT-R CCACTCGTCATCATCGTTGCT
hrpR-RT-F ACTGCTGCGTGTGTTGGAGA
hrpR-RT-R AAGGCTGGCAAGTGAAGCGT
hrpS-RT-F ATTGCTGAGGGTGCTGGAAA
hrpS-RT-R AACATCGGGAACGGGAACA
rphR-RT-F TCACCGATGAAACCTTCG
rphR-RT-R AAGACTCTGTGCGGTCGTTC
rphS-RT-F TGACACAGGACCTCAACGAC
rphS-RT-R CGCTGTCTTCAATCACGATG
hrpL-RT-F CTGCGTAACGAGCACAAGTT
hrpL-RT-R GCGACACTTCCAGCACTTT
结果显示：萝卜硫素使效应蛋白转录相关因子hrpL的表达水平下降到原来的30％左右(图5a)，而不影响其他基因的表达。由于hrpR和hrpS形成异源六聚体激活hrpL的转录，所以萝卜硫素可能调控HrpR和HrpS的功能。
二、萝卜硫素与HrpS第209位半胱氨酸共价接合
1、将体外纯化的10μg his-hrpS蛋白与0.25μM萝卜硫素(SFN)室温反应2小时。体外纯化的his-hrpS蛋白的制备方法如下：
1)提取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，采用hrpS-HIS-BamHI-F和hrpS-HIS-XhoI-R引物(引物序列见表4)进行扩增，得到hrpS基因片段，将hrpS基因片段构建到pet28a载体中的BamHI和XhoI位点间，得到HrpS表达载体pet28a-hrpS。
表4、引物序列
引物名称 引物序列
hrpS-HIS-BamHI-F AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAGTCTTGATGAAAGGTTT
hrpS-HIS-XhoI-R CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAGATCTGCAATTCTTTGATG
2)将1)中得到的HrpS表达载体pet28a-hrpS转化BL21表达菌株(北京全式金生物)，挑取单克隆，于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，得到转化子。
3)挑取2)中得到的单克隆转化子到2mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养，当到达一定的菌浓(OD＝1)后，取出100μL涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜。
4)用10mL LB培养基重悬3)中所得到的平板上的细菌，转移到1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200g振荡培养。
5)当菌浓达到OD 0.4-0.6后，加入IPTG(4mM)。16℃，200g振荡培养16小时，收集菌体。
6)用30mL PBS缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂cocktail，罗氏)重悬5)中收集的菌体。
7)在35％的强度下，超声2分钟破碎菌体，每5秒钟暂停10秒钟。超声在冰上进行。
8)将经超声破碎的菌体匀浆液在45,000g、4℃离心30分钟后取上清。
9)平衡：用至少5mL(5个柱体积)PBS平衡镍柱(NI-NTA、GE)1mL亲和柱。
10)上样：用0.45μm的滤膜过滤8)中所得到的上清，利用AKATA蛋白层析仪(GE)将过滤后的样品与镍柱充分结合。
11)洗脱杂蛋白：用5mL清洗液(1×PBS，25mM咪唑)洗脱吸附在镍柱上的杂蛋白。
12)洗脱目的蛋白：用5mL洗脱液(1×PBS，300mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。
13)再生柱子：依次用5mL洗脱液，5mL平衡液和5mL 20％的乙醇清洗柱子、最后保存在20％乙醇中。
14)将12)中所得到的洗脱液倒入浓缩管中，4℃，4000g离心至蛋白溶液的体积为1-1.5mL，而后加入15mL PBS缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂cocktail(罗氏)，10％甘油)，4℃，4000g离心至蛋白溶液的体积小于0.5mL，测浓度后，用于后续试验的蛋白溶液放在4℃条件下保存，其余蛋白溶液在液氮中速冻之后，保存在-80℃。
2、完成步骤1后，向反应液中加入50μM巯基活性探针IPM(Kerafast)，室温孵育一小时。
3、完成步骤2后，向沉淀中加入胰酶消化液(酶与底物的体积比为1：50)，室温消化2小时。
4、完成步骤3后，利用C18柱子对消化好的肽段进行脱盐并悬干产物。
5、完成步骤4后，用pH 6.0 30％CAN复溶。
6、完成步骤5后，对肽段进行生物素标记，每1mg肽段样品中先后加入20μL ddH2O和10μL乙腈，涡旋充分，检测pH使其在6.0左右，然后在NaHS处理和空白对照的肽段中分别加入1μL 40mM的轻/重-叠氮-UV-生物素试剂，涡旋充分，接着再加入4μL储液浓度为100mM的抗坏血酸钠、1μL储液浓度为50mM的TBTA配体以及4μL储液浓度为100mM的硫酸铜，涡旋充分，室温避光反应2小时，期间每隔20分钟涡旋一次。
7、完成步骤6后，把轻重同位素标记的肽段混合在一起，利用MacroSpin SCX柱子进行强阳离子交换以去除残留的点击化学试剂。具体步骤如下：
1)将SCX柱子置于2mL离心管中，加入500μL HPLC级的甲醇，100g离心1分钟，弃掉洗脱液。
2)加入500μL HPLC级的水，100g离心4分钟，弃掉洗脱液，重复一次。
3)加入500μL SCX平衡缓冲液，100g离心2分钟，使SCX平衡液浸透填料，室温静置1小时。
4)100g离心2分钟，弃掉洗脱液。
5)加入500μL SCX上样缓冲液，100g离心4分钟，弃掉洗脱液，重复一次。
6)加入150μL样品，100g离心20秒，弃去洗脱液。
7)加入150μL SCX上样缓冲液，100g离心20s，弃去洗脱液。
8)将SCX柱子置于新的2mL离心管中，加入150μL SCX洗脱液，100g离心90s，收集洗脱液并将其转移至含10mL链霉亲和素结合缓冲液的15mL离心管中。
8、链霉素亲和素琼脂糖凝珠富集，具体步骤如下：
1)将200μL链霉亲和素磁珠悬浮于10mL链霉亲和素结合缓冲液中，25℃，1700g离心3分钟，弃掉上清，重复一次，最终重悬于200μL链霉亲和素结合缓冲液中，备用。
2)将重悬的链霉亲和素珠子加入到第7-8)步中所得到的产物中，室温，避光反应2小时，1700g离心3分钟，弃掉上清。
3)加入10mL链霉亲和素结合缓冲液重悬，1700g离心3分钟，弃掉上清，重复三次。
4)加入10mL HPLC级的水重悬，1700g离心3分钟，弃掉上清，重复一次。
9、光解，具体步骤如下：用5倍体积的光裂解缓冲液(25mM NH4HCO3)重悬步骤8的4)中的链霉亲和素珠子，将其转移至玻璃瓶中，并加入磁力搅拌转子，置于磁力搅拌器上，在365nm紫外光照下，光解2小时。光解完成后，将玻璃瓶中所有液体转移至新的EP管中，1700g离心3分钟，收集上清。用旋蒸仪浓缩置约200μL。
10、利用HLB SPE脱盐柱对肽段进行脱盐，具体步骤如下：
1)加入1mL乙腈活化脱盐柱，流穿。
2)加入2mL HPLC级水洗脱盐柱，流穿。
3)将步骤9得到的产物加到脱盐柱上，流穿。
4)加入1mL HPLC级水洗脱盐柱，流穿。
5)加入1mL HLB溶剂A洗脱肽段，收集洗脱液。
6)用旋蒸仪将含肽段的洗脱液蒸干，用12μL 0.1％甲酸溶解蒸干的肽段样品，12,000rpm离心10分钟，取5μL上清进行LC-MS/MS分析。
结果显示：萝卜硫素与HrpS第209位半胱氨酸共价接合(图5b和5c)。
三、萝卜硫素通过靶向HrpS第209位半胱氨酸来抑制Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/GIII型分泌系统相关基因的表达
为了进一步验证萝卜硫素是否通过靶向HrpS第209位半胱氨酸来抑制Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G III型分泌系统相关基因的表达。首先通过同源重组的方法突变PstDC3000ΔsaxAB/F/D/G中的HrpS的第209位和第278位半胱氨酸，得到Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变体；再用萝卜硫素处理突变菌株后检测突变菌株中III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达情况。具体步骤如下：
1、Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变体的构建
1)提取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，采用hrpS-KpnI-puc-F和hrpS-HA-puc-SalI-R引物(引物序列见表5)进行扩增，得到HrpS基因片段(序列1)，将hrpS基因片段构建到中间载体puc19的KpnI和SalI位点间，得到重组载体。
2)以重组载体为模板，采用HrpS-209A-F和HrpS-209A-R引物(引物序列见表5)进行扩增，得到HrpSC209A片段(HrpSC209A片段为将HrpS基因片段第625-627位由TGC突变为GCT后得到的片段)；以重组载体为模板，采用HrpS-278A-F和HrpS-278A-R引物(引物序列见表5)进行扩增，得到HrpSC278A片段(HrpSC278A片段为将HrpS基因片段第823-825位由TGT突变为GCC后得到的片段)。
3)将HrpSC209A片段构建到自杀质粒pK18mobsacB上，得到pK18mobsacB-HrpSC209A；将HrpSC278A片段构建到自杀质粒pK18mobsacB上，得到pK18mobsacB-HrpSC278A。
4)利用电击转化的方法分别将pK18mobsacB-HrpSC209A和pK18mobsacB-HrpSC278A转入Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G，分别得到重组菌，然后分别将重组菌28℃孵育4小时后涂布在含有100μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素的KB平板上，28℃培养48小时后筛选阳性克隆。
5)挑取阳性单菌落并将其置于1mL在KB液体培养基中，28℃、220rpm培养过夜。
6)将5)中的培养液涂布在含10％蔗糖的KB平板上，28℃培养48小时。
7)将6)中所得到的克隆，同时在KB(含利福平抗性)和KB(含有利福平和卡那霉素抗性)的平板上划线，能在KB(含利福平抗性)生长而在KB(含有利福平和卡那霉素抗性)上不能生长的克隆为候选阳性克隆。
8)提取候选阳性克隆的DNA，利用HrpS-mosB-F-BamHI和HrpS-mosB-R-HindIII引物(引物序列见表5)扩增hrpS基因，并进行测序，测序后确定最终的阳性克隆。
引物序列如表5所示。
表5、引物序列
引物名称 引物序列
hrpS-KpnI-puc-F ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGAGTCTTGATGAAAGGT
hrpS-HA-puc-SalI-R AACATCGTATGGGTAGTCGACGATCTGCAATTCTTTGATGC
HrpS-209A-F GTTCCCGTTCCCGATGTTGCTCCACTGCTGCACAAAG
HrpS-209A-R CTTTGTGCAGCAGTGGAGCAACATCGGGAACGGGAAC
HrpS-278A-F CTCAAGCGCCACGACAATGCCGTGGATTCGGTAAGCCTGG
HrpS-278A-R CCAGGCTTACCGAATCCACGGCATTGTCGTGGCGCTTGAG
HrpS-mosB-F-BamHI AGCTCGGTACCCGGGGATCCATGAGTCTTGATGAAAGGTT
HrpS-mosB-R-HindIII CGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCAGATCTGC AATTCTTTGA
Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A突变菌株(图中标注为Δsax C209A)为将PstDC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株基因组中HrpS基因片段的第625-627位由TGC突变为GCT后得到的菌。Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A突变菌株中表达的HrpS蛋白为将野生型HrpS蛋白的第209位半胱氨酸C突变为丙氨酸A后得到的蛋白。
Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变菌株(图中标注为Δsax C278A)为将PstDC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株基因组中HrpS基因片段的第823-825位由TGT突变为GCC后得到的的菌。Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变菌株中表达的HrpS蛋白为将野生型HrpS蛋白的第278位半胱氨酸C突变为丙氨酸A后得到的蛋白。
2、突变菌株中效应蛋白的表达情况
按照实施例3中的方法检测步骤2构建的各突变菌株中效应蛋白的表达情况。
结果显示：在基本培养基中，Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A突变菌株中效应蛋白hrpT1和hrpW1的转录水平与Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株中基本一致，说明将HrpS蛋白第209位半胱氨酸突变为丙氨酸并不影响HrpS蛋白的功能。但Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A突变菌株对萝卜硫素不敏感，即20μM萝卜硫素不能抑制Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A突变菌株中效应蛋白hrpT1和hrpW1的表达。而Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变菌株中效应蛋白hrpT1和hrpW1的转录水平比Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌株中弱，说明将HrpS蛋白第278位半胱氨酸突变为丙氨酸影响了HrpS蛋白的功能。但用20μM萝卜硫素处理Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G野生菌株和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变菌株后，其效应蛋白hrpT1和hrpW1的表达水平下降到原来的30％左右(图5d和5e)，说明Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G野生菌株和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A突变菌株都响应萝卜硫素的处理。
综上所述，萝卜硫素通过靶向HrpS第209位半胱氨酸抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达。
四、萝卜硫素通过靶向HrpS第209位半胱氨酸来抑制植物对Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的抗性。
1、分别挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G、Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。将获得的菌体用水洗两次，然后用无菌水将菌体稀释至OD＝0.001。
2、完成步骤1后，将OD＝0.001的Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G、Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A的菌液分别接种野生型拟南芥Col-0和myb28/29突变体。接种方法同实施例3中的方法。
3、完成步骤2后，分别检测接种第0天和第3天的Col-0和myb28/29突变体叶片中Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G、Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A细菌的数目。具体步骤如下：用打孔器获取面积为0.5652cm2的叶片，并将其置于含有100μL无菌水的离心管中，轻柔研磨为匀浆，利用稀释法滴定细菌数目。
结果显示：1)接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的Col-0中的细菌数目的平均值为7939667/cm2；接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的myb28/29突变体中的细菌数目平均值为19185686/cm2。2)接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A的Col-0中的细菌数目的平均值为6767516/cm2；接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的myb28/29突变体中的细菌数目平均值为7088199/cm2。3)接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A的Col-0中的细菌数目的平均值为1179523/cm2；接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的myb28/29突变体中的细菌数目平均值为4385300/cm2。
虽然突变菌株Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A的致病力减弱，但是这两种细菌对于SFN的反应不同。接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G和Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC278A时，myb28/29突变体中的细菌数目明显多于野生型，而接种Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G/HrpSC209A时，myb28/29突变体中的细菌数目与野生型相当(图5f)。说HrpS第209位半胱氨酸介导了萝卜硫素对Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的抗性。
实施例6、萝卜硫素衍生物在抑制丁香假单胞菌效应蛋白表达中的应用
1、挑取Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G的单菌落并将其置于KB培养基中，28℃、220rpm培养过夜，4000rpm离心10分钟，收集菌体。
2、完成步骤1后，将获得的菌体用水洗两次，然后将菌体在基本培养基中重悬至OD＝0.4，得到重悬后的菌体。
3、完成步骤2后，向重悬后的菌体中分别加入萝卜硫素(SFN)、萝卜硫素衍生物(AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6、AS7和AS8)，使其在重悬后的菌体中的终浓度为100μM(AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6)或400μM(AS7和AS8)，6小时后检测Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G菌体中效应蛋白相关基因avrPto、hrpL、trp的表达情况。同时以加入DMSO的样品作为对照(Mock)。
结果显示：萝卜硫素(SFN)、萝卜硫素衍生物(AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6、AS7和AS8)均能抑制Pst DC3000ΔsaxAB/F/D/G效应蛋白相关基因avrPto、hrpL的转录，而不影响trp的相对转录表达(图6a和图6b)。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>萝卜硫素及其衍生物在作为细菌效应蛋白转录抑制剂中的应用
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>909
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgagtcttg atgaaaggtt tgaggatgat ctggacgagg agcgggttcc gaatctgggg 60
atagttgccg aaagtatttc gcaactgggt atcgacgtgc tgctatcggg tgagaccggc 120
acgggcaaag acacgattgc ccgacggatt catgagatgt caggccgcaa agggcgcctg 180
gtggcgatga attgcgcggc cattccggag tccctcgccg agagcgagtt attcggcgtg 240
gtcagcggtg cctacaccgg cgctgatcgc tccagagtcg gttatgtcga agcggcgcag 300
ggcggcacgc tgtacctgga tgagatcgat agcatgccgc tgagcctgca agccaaattg 360
ctgagggtgc tggaaacccg agcgcttgaa cggctgggtt cgacgtcgac gatcaagctg 420
gatatctgcg tgatcgcctc cgcccaatgc tcgctggacg acgccgtcga gcgggggcag 480
tttcgtcgcg atctgtattt tcgcctgaac gtcctgacac tcaagcttcc tccgctacgt 540
aaccagtctg atcgcatagt tcccctgttc acacgtttta cggccgccgc cgcgagggag 600
ctcggtgttc ccgttcccga tgtttgccca ctgctgcaca aagtgctgct gggccacgac 660
tggcccggca atatccgtga gctcaaggct gcagccaaac gccatgtgct gggtttcccc 720
ttgctgggcg ccgagccgca gggcgaagag cacttggcct gtgggctcaa atcgcaattg 780
cgagtgatcg aaaaagccct gattcaggag tcgctcaagc gccacgacaa ttgtgtggat 840
tcggtaagcc tggaactgga cgtgccacgc cgtacgctct atcgacgcat caaagaattg 900
cagatctga 909

Claims (10)

1.萝卜硫素或萝卜硫素衍生物在下述1)-7)中至少一种中的应用；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达；
7)作为病原细菌效应蛋白转录抑制剂。
2.萝卜硫素或萝卜硫素衍生物在制备具有下述1)-6)中至少一种功能的产品中的应用；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达。
3.一种产品，其活性成分为萝卜硫素或萝卜硫素衍生物；
所述产品具有下述1)-6)中至少一种功能；
1)防治病原细菌；
2)提高植物对病原细菌的抗性；
3)抑制病原细菌的致病力；
4)抑制病原细菌III型分泌系统的功能；
5)抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达；
6)抑制病原细菌转录因子hrpL的表达。
4.根据权利要求1或2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述提高植物对病原细菌的抗性为降低植物叶片中的细菌数目。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用或产品，其特征在于：所述萝卜硫素或萝卜硫素衍生物通过靶向HrpS第209位半胱氨酸抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用或产品，其特征在于：所述抑制病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的表达为降低病原细菌III型分泌系统效应蛋白相关基因的相对转录水平；
和/或，所述III型分泌系统效应蛋白相关基因为如下至少一种：avrPto、hopAM1、hopH1、hrpW1、hrpT1、hopC1；
和/或，所述抑制病原细菌转录因子hrpL的表达为降低病原细菌转录因子hrpL的相对转录水平。
7.根据权利要求1-6任一所述的应用或产品，其特征在于：所述病原细菌为丁香假单胞菌。
8.一种提高植物对病原细菌的抗性的方法，包括用萝卜硫素或萝卜硫素衍生物处理植物的步骤。
9.根据权利要求1-7任一所述的应用或产品或根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述萝卜硫素衍生物为如下任一种：萝卜硫素衍生物AS1、萝卜硫素衍生物AS2、萝卜硫素衍生物AS3、萝卜硫素衍生物AS4、萝卜硫素衍生物AS5、萝卜硫素衍生物AS6、萝卜硫素衍生物AS7和萝卜硫素衍生物AS8。
10.权利要求9中所述的萝卜硫素衍生物AS7或萝卜硫素衍生物AS8。
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