CN112516388B - 一种畴区可控的骨软骨修复复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多畴区可控的骨软骨修复的复合支架及其制备方法，该复合支架的骨畴区采用光交联聚乙二醇改性聚合物凝胶；软骨畴区为两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶；过渡畴区是杂化凝胶。制备时，向模具中缓慢加入两亲性氨基酸衍生物小分子，待其成胶后，沿壁缓慢加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物的溶液，静置后经过紫外光照射制备而成。本发明制备的具有梯度变化的结构、成分和机械强度的复合支架，利用共价‑非共价交联作用形成一体化结构，具有光滑的过渡层，可以解决复杂骨软骨多区域缺损，实现骨软骨一体化修复，防止分层的发生。

Description

一种畴区可控的骨软骨修复复合支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学材料技术领域，具体涉及一种畴区可控的骨软骨修复复合支架及其制备方法。
背景技术
骨软骨缺损通常是由于骨关节炎、创伤、骨肿瘤、组织切除、代谢性疾病所引起的。这些疾病造成的组织损伤包括两种不同的组织类型：无血管、无神经、无法自行修复的关节软骨和起力学支撑作用的下骨组织。目前应用于临床修复骨软骨损伤的治疗方案包括微骨折，钻孔术以及人工关节置换术。这些治疗技术对软骨再生效果不明显，可能形成纤维软骨，并且新生成的组织与原本骨组织缺乏整合作用而导致修复失败。组织工程对重建修复骨软骨组织提供了新的策略方法，骨软骨多畴区一体化修复得到广泛研究。骨软骨过渡层结构将骨软骨复合组织分成空间结构和力学性能完全不同的两部分结构：骨组织区域要求血液供给大量氧和营养元素，具有致密且大孔隙的结构，同时需要有强的机械模量承担力学支撑；而软骨组织生长环境需要较高含水量，并且在应力传导过程中起衬垫的作用，需要可以吸收应力的可逆的交联结构；所以，中间过渡区域骨软骨组织需要起到桥接的特殊连接结构，有效过渡软骨组织到骨组织的结构变化、力学变化，同时保证营养代谢交换和力学信号传递。因此，骨、软骨和骨软骨过渡区是骨软骨缺损修复中必须同时考虑的因素。目前出现了两种主要的研究方案。一种是分别制备软骨、骨修复及过渡层支架，在体外与相应的软骨细胞和成骨细胞共培养后，通过简单的缝合、粘附或叠加的方式将各部分组装成多层支架，再植入缺损部分。结果显示骨层和软骨层之间存在一个明显的分界面，细胞无法穿透分界面形成钙化软骨层，导致骨与软骨界面不稳定，并且可能导致骨组织长入缺损区域的软骨区或远期出现分层现象。另外一种方法是制备一体化骨软骨多层支架，如采用3D打印技术一步法合成双网络高分子水凝胶，测试结果表明其与软骨和骨部分结合良好，无界面分层。但这种一体化支架虽然极大的增强了软骨与骨组织的联系，可以有效的克服界面分层的问题。但是一体化制备方法往往存在工艺复杂，且难以实现同一支架不同区域独立可控化调控的问题，难以满足诱导软骨和骨同时再生的要求。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种畴区可控的骨软骨修复复合支架及其制备方法，以解决现有技术存在的一体化制备方法制得的骨软骨下骨修复支架难以实现不同区域同时修复，大范围力学、空间结构及化学组成独立、精准、可控化的问题，以及修复过程中出现分层的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，包括：骨畴区凝胶，中间过渡畴区凝胶，软骨畴区凝胶；
其中，骨畴区凝胶为单一组分的紫外光交联聚乙二醇改性聚合物凝胶；
软骨畴区凝胶为单一组分的自组装两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶；
中间过渡畴区是小分子-高分子复合凝胶即杂化凝胶，是两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶液和聚乙二醇改性聚合物凝胶溶液混合后的光交联产物。
上述技术方案产生的有益效果为：小分子凝胶是利用小分子凝胶因子通过分子间相互作用在溶剂中组装形成三维网络结构从而使溶剂失去流动性而得到的凝胶。本发明中的两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶是通过调控小分子凝胶因子的氢键、π-π键、范德华力、静电作用、配位键等非共价键相互作用力而自发的聚集组装，使得两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶具有溶液-凝胶转变。同时，两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶可以根据适当的外界刺激实现转变，常见的有浓度和温度两种方式。而且，不同两亲性氨基酸衍生物小分子结构中含有的基团即结构单元可对最终凝胶的空间结构有影响。因此，可通过调控温度、凝胶因子含量、溶剂种类以及分子结构实现两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶的力学强度、微观形貌的可控调控，因其力学强度较聚乙二醇改性聚合物的高分子凝胶和杂化凝胶低，可作为软骨修复层，促进骨髓间充质干细胞向软骨方向分化，促进软骨细胞的生成和软骨相关蛋白的分泌，从而利于软骨的修复。
聚乙二醇及其衍生物凝胶体系由于其具有良好的生物相容性、免疫原性低和可大范围调控的化学、机械性能而在组织工程中得到广泛应用。聚乙二醇改性聚合物作为骨区，其具有较高的力学强度，能够促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化，促进骨细胞的生成和成骨相关蛋白的合成，从而利于骨组织的修复。
中间过渡畴区即软骨下骨区，是杂化凝胶，将含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物的溶液加入到已经成胶的两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶里，其聚合物凝胶前驱液渗透进部分小分子凝胶中而形成的凝胶，其为双网络结构，兼具共价交联和非共价交联的特性，可以将骨区和软骨区材料做到有效连接，过渡软骨组织到骨组织的结构变化、力学变化，同时保证营养代谢交换和力学信号传递。
综上，本发明的技术构思是：将不同成分的前驱液依次加入模具成胶，形成骨、软骨下骨和软骨三个区域的功能性凝胶，这三个功能区不管是从成分的浓度、结构等方面都形成了梯度变化，进而使得力学强度也形成了梯度，对应骨髓间充质干细胞向骨、软骨细胞分化的力学微环境。只要通过调节不同凝胶的浓度和成分就可以调节其的力学强度以便形成畴区可控的复合支架，解决了同一支架不同区域独立可控化调控的问题，并且中间过渡区设计共价-非共价交联的双网络结构，可以有效防止修复过程中出现分层的情况，最终形成一体化骨软骨修复复合支架。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
两亲性氨基酸衍生物是氨基酸的R基上的氢原子被其他杂原子或含有杂原子的基团取代得到的物质，其只要是能够形成小分子凝胶均属于本发明的技术构思，本发明中保护的是将该两亲性氨基酸衍生物形成凝胶用于形成软骨畴区，再与聚乙二醇改性聚合物形成的凝胶在光催化剂和长波紫外光照射下进行交联反应得到一体化不易分层的中间过渡畴区即可，因此只要是将两亲性氨基酸或其衍生物形成凝胶即可，而本发明中优选以下两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶但并不局限于这些：赖氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物、色氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物、异亮氨酸衍生物凝胶。氨基酸衍生物小分子凝胶具有良好的生物相容性，可以在温度或浓度的调控下实现溶液-凝胶的转变。
同样地，本发明优选以下聚乙二醇改性聚合物但并不局限于这些：聚乙二醇丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDM)。
进一步地，中间过渡畴区中两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶液和聚乙二醇改性聚合物凝胶溶液的体积比为10:1-1:10。
上述畴区可控的骨软骨修复复合支架的制备方法，包括以下步骤：
两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液室温冷却形成软骨畴区凝胶，随后加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶的前驱液，静置5-30min，然后置于长波紫外光下反应，形成中间过渡畴区和骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架，具体过程如下：
(1)将两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶解在溶剂中，浓度为5-50mg/mL，获得两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液；
(2)将聚乙二醇改性聚合物溶解至浓度为0.5％-30％(W/V)，然后加入光引发剂，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液；
(3)两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液室温冷却形成软骨畴区，随后加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置5-30min，然后放置于长波紫外光下反应，形成中间过渡层畴区和骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
进一步，步骤(1)中溶剂为PEG和水按体积比为0-4:1的混合溶液。采用该溶剂时步骤(1)的具体过程为：将两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶解在PEG和水按体积比为0-4:1的混合溶液中使得其浓度为5-50mg/mL，然后加热5-20min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
进一步，步骤(2)中光引发剂为引发剂I2959，I184，I1173，I500或I819。
进一步，步骤(3)中所加入的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液与两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液的体积比为10:1-1:10。
进一步，步骤(3)中长波紫外光下反应时间为8-15min。
上述形成的复合支架，包括：单一组分自组装的两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶(小分子凝胶)模拟软骨组织；中间小分子和高分子混合成胶部分模拟软骨下骨即过渡区；聚乙二醇改性聚合物(高分子凝胶)模拟骨组织。
本发明的复合支架是由两亲性氨基酸类小分子凝胶和聚乙二醇改性聚合物凝胶通过紫外交联技术得到的杂化凝胶，即骨畴区是紫外光交联的聚乙二醇改性聚合物凝胶，中间过渡畴区是小分子和高分子混合的双网络凝胶，软骨畴区是自组装的两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶。本发明可以通过调控不同凝胶因子的浓度、比例和紫外辐照强度、时间来实现复合支架各畴区凝胶的力学强度和空间结构的可控分布，以实现诱导骨髓间充质干细胞向成骨或成软骨定向分化，并且有效实现整合，满足骨软骨修复的临床要求。
本发明制备的具有梯度变化的结构、成分和机械强度的复合支架利用共价-非共价交联作用形成一体化结构，具有光滑的过渡层，可以解决复杂的骨软骨缺损多区域缺损修复，防止分层的发生。
此外，本发明中的复合支架可以在单层或多层凝胶中包裹生长因子，如转化生长因子(TGF-β)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)及血小板衍生生长因子(PDGF)的一种，或它们的任意组合。
附图说明
图1为亮氨酸衍生小分子凝胶因子合成表征图。
图2为PEGDA材料合成表征图。
图3为亮氨酸衍生物小分子凝胶、PEGDA凝胶和两者形成的复合凝胶(也称杂化凝胶)各畴区的力学强度结果。
图4为亮氨酸衍生物小分子凝胶、PEGDA凝胶和两者形成的复合凝胶各畴区的表面形貌图。
图5为MSCs在亮氨酸衍生物小分子凝胶(软骨层)、PEGDA凝胶(骨层)及复合凝胶(过渡层)表面成骨相关蛋白表达量的检测结果。
图6为MSCs在亮氨酸衍生物小分子凝胶(软骨层)、PEGDA凝胶(骨层)及复合凝胶(过渡层)表面软骨相关蛋白表达量的检测结果。
图7为骨软骨下骨修复的micro-CT 3维重建图。
图8为骨软骨下骨修复的HE染色结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备亮氨酸衍生物小分子凝胶因子N-苄氧羰基-N'-十六烷酰肼-L-亮氨酸
将L-丙氨酸乙酯盐酸盐按照0.50mol/L的浓度溶解在饱和碳酸氢钠溶液，在搅拌下将氯甲酸苄酯按摩尔比1：1加入到上述溶液中，持续搅拌16个小时后用乙醚萃取产物，收集合并有机层并用盐酸(1.0mol/L)清洗，然后用无水硫酸镁干燥2h，过滤后旋转蒸发，得到N-苄氧羰基-L-丙氨酸乙酯。
按摩尔比为3：1将80％水合肼加入到N-苄氧羰基-L-丙氨酸乙酯的乙醇溶液(浓度为0.40mol/L)中，室温下搅拌16h，旋转蒸发除去乙醇溶剂，析出的固体溶于氯仿中，然后用饱和食盐水洗至饱和食盐水层显中性，静置分层，将有机层用无水硫酸镁干燥小时后旋转蒸发，得到干燥的N-苄氧羰基-L-丙氨酸酰肼。
在搅拌下按摩尔比1：1将十六烷酰氯加入到N-苄氧羰基-L-丙氨酸酰肼的氯仿溶液(浓度为0.10mol/L)中，开始出现胶凝现象，慢慢加快磁子的搅拌速度，室温下持续搅拌反应6h。真空干燥除去溶剂后，得到产物N-苄氧羰基-N'-十六烷酰肼-L-亮氨酸，再以甲醇-乙酸乙酯混合溶液(体积比1：1)多次重结晶，纯化后的样品置于真空干燥器中备用。
合成后的亮氨酸衍生小分子凝胶因子以DMSO作为溶剂溶解成5mg/mL、15mg/mL和30mg/mL的浓度，在400MHz下进行1H光谱学分析，结果见图1。
由图1可知，当凝胶因子浓度从5mg/mL(溶胶)增加到30mg/mL(凝胶)时，苯的质子沿前场位移从7.44ppm到7.46ppm、7.46ppm到7.48ppm、7.69ppm到7.71ppm、7.71ppm到7.73ppm、7.85ppm到7.87ppm。该结果表明，凝胶分子越多，聚合加剧引起π-π键的堆积越多。亚胺(-CH＝N-)中质子的化学位移也影响了凝胶化过程，使其前场位移由8.22ppm增大到8.24ppm，说明凝胶的自组装是由凝胶过程中的范德华力和π-π键相互作用驱动的。
(2)PEGDA的合成
在氩气氛围下，将真空干燥的PEG(Mn＝6000)和三乙胺(TEA)溶解在无水二氯甲烷DCM中，然后将丙烯酰氯逐滴添加到二氯甲烷溶液中。PEG，三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比是1：2：4。升温至60℃，待搅拌均匀后，再依次加入改性酸丙烯酸(为PEG摩尔质量的2.5倍)和催化剂对甲苯磺酸(占总反应体系体积的1％)，搅拌，继续升温至100℃，反应一定时间后反应6h后，升温至140℃且不再有水生成，反应结束。待体系温度降到90℃，进行减压蒸馏，粗产品用5％的NaCO3溶液调节至中性，用饱和NaCl溶液洗涤，再用乙醚萃取，过滤后低温减压真空干燥，冷冻干燥得到最终的纯化产物。
利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)验证PEGDA的合成。将PEG和PEGDA粉末的ATR-FTIR光谱对比发现，PEGDA在1726cm-1处出现了一个特征峰，这是C＝O的伸缩振动。该特征峰的出现证实了PEG的丙烯酸化成功，即PEGDA的合成，具体见图2。
(3)梯度复合凝胶的合成
将亮氨酸衍生物小分子凝胶因子溶解在PEG和水按体积比为1:1的混合溶液中使得其浓度为15mg/mL，然后加热20min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
将聚乙二醇改性聚合物PEGDA溶解在去离子水中，使其浓度为20％(W/V)，完全溶解后加入光引发剂I2959，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液。
小分子凝胶室温冷却形成软骨畴区，随后按照小分子凝胶因子先驱液和聚乙二醇改性聚合物凝胶先驱液体积比为1：1加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置20min，然后放置于长波紫外光360nm下反应10min，形成中间过渡层畴区和骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
在室温多频的条件下，利用动态力学分析仪，振幅20μm，预加载力0.01N，以质量分数为20％的PEGDA为骨畴区，弹性模量达到269.27±41.13kPa，凝胶网络有明显的纤维结构；同时，PEGDA和亮氨酸衍生物小分子凝胶按照1：1的比例混合形成的中间过渡畴区，弹性模量达到120.63±15.75kPa，复合凝胶形貌是较小纤维嵌入在大纤维结构中；而15mg/mL浓度溶解生成的小分子凝胶为软骨层，材料弹性模量36.70±11.21kPa，具有小而密集的纤维结构，结果见图3和图4。
实施例2
一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸
将1,4-苯二甲酰氯(13mmol)溶解在二氯甲烷中，滴加到100mL D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(26.1mmol)的二氯甲烷和三乙胺(58.3mmol)的溶液中，室温下搅拌24h，旋蒸除去多余溶剂后将残留物溶解到100mL的乙醇中，过滤收集不溶性物质干燥。
在一定体积的不溶物的甲醇悬浮液中滴加其一半体积的NaOH(2.0M)，缓慢冷却至室温后，持续搅拌24h后得到澄清溶液。用3.0M HCl酸化并将溶液pH值调节到3.0，得到凝胶状沉淀。将凝胶抽滤，用去离子水清洗3次，真空干燥得到产物。
将得到的上述产物按照2.5％的质量比溶解在一缩二乙二醇中，滴加0.5mL的浓盐酸，在130℃搅拌3h后加入三倍体积的冰水。抽滤凝胶状沉淀，真空干燥得到1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸。
(2)PEGDM的合成
在三颈瓶中加入对苯二酚0.01g，a-甲基丙烯酸(0.11mol)以及N,N`-二甲基酰胺(0.02mL)，最后滴加氯化亚砜(0.12mol)，加热至35℃搅拌2h。使用滴液漏斗按照每两秒一滴的速度将一缩二乙二醇(0.05mol)滴入，35℃回流反应4h，直至最后出口处无酸性气体放出。将生成物用水、NaHCO3清洗至中性，乙醚萃取产物。加入MgCO3干燥过滤，减压蒸馏冻干得到PEGDM。
(3)梯度复合凝胶的合成
将合成的1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸小分子凝胶因子溶解在PEG和水按照体积比为2：1的混合溶液中，使得其浓度为5mg/mL，然后加热10min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
将PEGDM溶解在去离子水中，使其浓度为30％(W/V)，完全溶解后加入光引发剂I184，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液。
小分子凝胶室温冷却形成弹性模量为20kPa的软骨畴区，随后按照小分子凝胶因子先驱液和聚乙二醇改性聚合物凝胶先驱液体积比为1：2的体积比加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置15min，然后放置于长波紫外光360nm下反应20min，形成弹性模量为160kPa的中间过渡层畴区和弹性模量为420kPa的骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
实施例3
一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸
将1,4-苯二甲酰氯(13mmol)溶解在二氯甲烷中，滴加到100mL D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(26.1mmol)的二氯甲烷和三乙胺(58.3mmol)的溶液中，室温下搅拌24h，旋蒸除去多余溶剂后将残留物溶解到100mL的乙醇中，过滤收集不溶性物质干燥。
按照摩尔比为2：1的比例在不溶物的甲醇悬浮液(6.14mmol)中滴加NaOH(2.0M)，缓慢冷却至室温后，持续搅拌24小时后得到澄清溶液。用3.0M HCl酸化并将溶液pH值调节到3.0，得到凝胶状沉淀。将凝胶抽滤，用去离子水清洗3次，真空干燥得到产物。
将得到的上述产物按照2.5％的质量比溶解在一缩二乙二醇中，滴加0.5mL的浓盐酸，在130℃搅拌3h后加入三倍体积的冰水。抽滤凝胶状沉淀，真空干燥得到1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸。
(2)PEGMA的合成
在三颈瓶中加入对苯二酚0.15g，对甲苯磺酸0.3g以及甲氧基聚乙二醇(0.1mol，35.46mL)，搅拌加热至100℃，开始滴加甲基丙烯酸甲酯(0.11mol，11.76mL)，保持120℃反应4h。边反应边蒸出反应产物，滴加完毕后继续加热，直至反应蒸出甲醇至无回流液，停止反应。蒸馏出的物质用饱和食盐水清洗，干燥得到PEGMA。
(3)梯度复合凝胶的合成
将合成的1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸小分子凝胶因子溶解在PEG和水按照体积比为1：2的混合溶液中，使得其浓度为5mg/mL，然后加热10min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
将PEGMA溶解在去离子水中，使其浓度为15％(W/V)，完全溶解后加入光引发剂I1173，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液。
小分子凝胶室温冷却形成弹性模量为20kPa软骨畴区，随后按照小分子凝胶因子先驱液和聚乙二醇改性聚合物凝胶先驱液体积比为1：3的体积比加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置12min，然后放置于长波紫外光下反应15min，形成弹性模量为100kPa的中间过渡层畴区和弹性模量为210kPa的骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
实施例4
一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-OSu-L-赖氨酸环二肽
将3.0mmol的环二肽溶于50mL的水中，加入8mmol的NaHCO3，冰浴条件下搅拌溶解，再将1.0mmol芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)溶于50mL的1,4-二氧六环后滴加进上述溶液，室温反应24h。将体系旋蒸浓缩后洗涤离心，下层沉淀物用1M的HCl溶解离心弃去不溶物，再用1M的NaOH沉淀后离心，冻干得到白色粉末。
(2)PEGMA的合成
在三颈瓶中加入对苯二酚0.15g，对甲苯磺酸0.3g以及甲氧基聚乙二醇(0.1mol，35.46mL)，搅拌加热至100℃，开始滴加甲基丙烯酸甲酯(0.11mol，11.76mL)，保持120-130℃反应4h。边反应边蒸出反应产物，滴加完毕后继续加热，直至反应蒸出甲醇至无回流液，停止反应。蒸馏出的物质用饱和食盐水清洗，干燥得到PEGMA。
(3)梯度复合凝胶的合成
将合成的Fmoc-OSu-L-赖氨酸环二肽小分子凝胶因子溶解在PEG和水按照体积比为4：1的混合溶液中，使得其浓度为10mg/mL，然后加热10min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
将PEGMA溶解在去离子水中，使其浓度为15％(W/V)，完全溶解后加入光引发剂I500，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液。
小分子凝胶室温冷却形成弹性模量为25kPa软骨畴区，随后按照小分子凝胶因子先驱液和聚乙二醇改性聚合物凝胶先驱液体积比为2：1的体积比加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置20min，然后放置于长波紫外光下反应8min，形成弹性模量为100kPa的中间过渡层畴区和弹性模量为180kPa的骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
实施例5
一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备Fmoc-OSu-L-赖氨酸环二肽
将3.0mmol的环二肽溶于50mL的水中，加入8mmol的NaHCO3，冰浴条件下搅拌溶解，再将1.0mmol芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc-OSu)溶于50mL的1,4-二氧六环后滴加进上述溶液，室温反应24h。将体系旋蒸浓缩后洗涤离心，下层沉淀物用1M的HCl溶解离心弃去不溶物，再用1M的NaOH沉淀后离心，冻干得到白色粉末。
(2)PEGDA的合成
在氩气氛围下，将真空干燥的PEG(Mn＝6000)和三乙胺(TEA)溶解在无水二氯甲烷DCM中，然后将丙烯酰氯逐滴添加到二氯甲烷溶液中。PEG，三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比是1：2：4。升温至60℃，待搅拌均匀后，再依次加入改性酸丙烯酸(为PEG摩尔质量的2.5倍)和催化剂对甲苯磺酸(占总反应体系体积的1％)，搅拌，继续升温至100℃，反应6h后，升温至140℃且不再有水生成，反应结束。待体系温度降到90℃，进行减压蒸馏，粗产品用5％的NaCO3溶液调节至中性，用饱和NaCl溶液洗涤，再用乙醚萃取，过滤后低温减压真空干燥，冷冻干燥得到最终的纯化产物PEGDA。
(3)梯度复合凝胶的合成
将合成的1,4-苯二甲酸酰胺-苯丙氨酸小分子凝胶因子溶解在水中使得其浓度为25mg/mL，然后加热10min至完全溶解，获得小分子凝胶前驱液。
将PEGDA溶解在去离子水中，使其浓度为25％(W/V)，完全溶解后加入光引发剂I819，光引发剂的用量为整个溶液体积的0.05％(W/V)，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液。
小分子凝胶室温冷却形成弹性模量为40kPa软骨畴区，随后按照小分子凝胶因子先驱液和聚乙二醇改性聚合物凝胶先驱液体积比为5：3的体积比加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置10min，然后放置于长波紫外光下反应12min，形成弹性模量为120kPa的中间过渡层畴区和弹性模量为360kPa的骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
实验例1蛋白分泌量和表达量的检测
将亮氨酸衍生物小分子凝胶(简称小分子凝胶)、杂化凝胶(也称复合凝胶)和PEGDA凝胶(简称高分子凝胶)置于24孔板中，接种1万/ml的P2代MSCs细胞，培养到3天、7天、14天和21天，收集蛋白，用Elisa试剂盒检测不同材料上细胞的蛋白分泌情况。体外实验中，PEGDA凝胶表面生长的MSCs具有较高的成骨蛋白ALP和OCN表达，过渡层杂化凝胶表面成骨蛋白量相较于PEGDA凝胶少，但高于小分子凝胶，且随着培养时间的增加而增加，而小分子凝胶表面成骨蛋白分泌量最少，且随着培养时间增长没有明显变化；同时，MSCs在小分子水凝胶表面生长时分泌大量的软骨相关蛋白AGG和Col II，过渡层杂化凝胶表面MSCs分泌的软骨相关蛋白比小分子凝胶少，PEGDA凝胶表面软骨相关蛋白分泌量最少，具体见图5和图6。
实验例2动物试验
选用2-3kg的雄性新西兰大白兔12只，按照1kg/mL耳缘静脉注射3％的戊巴比妥麻醉，后肢剃毛后用碘伏消毒。从髌骨外侧纵切口，然后使髌骨脱位，暴露股骨板槽，在股骨髌骨沟处形成圆柱形缺损(直径4mm，深度4mm)，以不使用任何材料的空白组作为对照，填充亮氨酸衍生物小分子凝胶、多畴区梯度复合凝胶、高分子凝胶(PEGDA凝胶)为实验组，之后使髌骨归位，缝合肌肉和皮肤。术后肌肉给药青霉素钠防止感染。在预定时间点4周和8周时，不同组别的动物处死后将股端解剖膝关节，在10％福尔马林溶液中固定5天，脱钙脱水后石蜡包埋，先进行micro-CT 3维重建，之后切片后染色做组织学分析(图7-8)。结果表明，空白对照组和PEGDA组中，软骨难以自行修复，骨组织可以进行一定程度的修复，PEGDA凝胶有骨组织长入；小分子凝胶组和多畴区梯度复合凝胶有软骨生成，但是小分子凝胶组中生成的骨组织较少。所有实验组中多畴区梯度复合凝胶既有软骨组织生成，同时又有大量的骨组织生成，且与原组织有明显的整合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，包括：骨畴区凝胶，中间过渡畴区凝胶，软骨畴区凝胶；
其中，骨畴区为单一组分的聚乙二醇改性聚合物凝胶；
软骨畴区凝胶为单一组分的自组装的两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶；
中间过渡畴区为杂化凝胶，是两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶液和聚乙二醇改性聚合物凝胶溶液混合后的光交联产物；
畴区可控的骨软骨修复复合支架通过以下方法制得：
（1）将两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶解在溶剂中的浓度为5-50 mg/mL，获得两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液；
（2）将聚乙二醇改性聚合物溶解至质量体积浓度为0.5%-30%，然后加入光引发剂使其质量体积浓度为0.05%，获得聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液；
（3）两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液室温冷却形成软骨畴区，随后加入含有光引发剂的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液，静置5-30 min，然后放置于长波紫外光下反应，形成中间过渡层畴区和骨畴区凝胶，从而获得多畴区梯度复合支架。
2.根据权利要求1所述的畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶为赖氨酸衍生物、亮氨酸衍生物、丙氨酸衍生物、谷氨酸衍生物、天冬氨酸衍生物、色氨酸衍生物、苯丙氨酸衍生物或异亮氨酸衍生物凝胶。
3.根据权利要求1所述的畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，聚乙二醇改性聚合物为聚乙二醇丙烯酸酯、聚乙二醇双丙烯酸酯或聚乙二醇二甲基丙烯酸酯。
4.根据权利要求1所述的畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，中间过渡畴区中两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶溶液和聚乙二醇改性聚合物凝胶溶液的体积比为10:1-1:10。
5.根据权利要求1中所述畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，步骤（1）中溶剂为PEG和水按体积比为0-4:1的混合溶液。
6.根据权利要求1所述的畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，步骤（2）中光引发剂为引发剂I2959，I184，I1173，I500或I819。
7.根据权利要求1中所述畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，步骤（3）中所加入的聚乙二醇改性聚合物凝胶前驱液与两亲性氨基酸衍生物小分子凝胶前驱液的体积比为10:1-1:10。
8.根据权利要求1所述的畴区可控的骨软骨修复复合支架，其特征在于，步骤（3）中长波紫外光下反应时间为8-15min。
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