CN1125050C

CN1125050C - 金属蛋白酶抑制剂

Info

Publication number: CN1125050C
Application number: CN97182445A
Authority: CN
Inventors: R·P·贝克特; M·惠特克; A·米勒; F·M·马丁
Original assignee: British Biotech Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Vernalis R&D Ltd
Priority date: 1997-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2003-10-22
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: CN1275978A

Abstract

化合物N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺是一种基质金属蛋白酶抑制剂。

Description

金属蛋白酶抑制剂

本发明涉及N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺和它的药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物。

发明背景

国际专利申请WO95/19956(英国生物技术药物有限公司)揭示和要求了作为基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂和细胞里释放出肿瘤坏死因子(TNF-α)的抑制剂的一类化合物。特别是，该申请要求了通式(I)化合物，或它的盐、水合物或溶剂合物：

其中

X是-CO₂H或-CONHOH基团；

R₁是氢；(C₁-C₆)烷基；(C₂-C₆)链烯基；苯基；取代苯基；苯基(C₁-C₆烷基)；取代苯基(C₁-C₆)；杂环基；取代杂环基；杂环基(C₁-C₆)烷基；取代杂环基(C₁-C₆)烷基；基团BSO_nA-，其中n是0，1或2，B是氢或(C₁-C₆)烷基、苯基、取代苯基、杂环基、(C₁-C₆)酰基、苯甲酰甲基或取代苯甲酰甲基，A代表(C₁-C₆)烷基；氨基；被保护的氨基；酰基氨基；OH；SH；(C₁-C₆)烷氧基；(C₁-C₆)烷基氨基；二(C₁-C₆)烷基氨基；(C₁-C₆)烷硫基；芳基(C₁-C₆)烷基；氨基(C₁-C₆)烷基；羟基(C₁-C₆)烷基、巯基(C₁-C₆)烷基或羧基(C₁-C₆)烷基，其中氨基、羟基、巯基或羧基可任意被保护，或羧基可被酰胺化；被氨基甲酰基、单(低级烷基)氨基甲酰基、二(低级烷基)氨基甲酰基、二(低级烷基)氨基或羧基低级链烷酰基氨基取代的低级烷基；

R₂是(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₆)链烯基、(C₂-C₆)链炔基、苯基(C₁-C₆)烷基、杂芳基(C₁-C₆)烷基、环烷基(C₁-C₆)烷基或环烯基(C₁-C₆)烷基，其中的任何基团可被(C₁-C₆)烷基、-O(C₁-C₆)烷基、-S(C₁-C₆)烷基、卤素和氰基(-CN)任意取代；

R₃是天然或非天然α-氨基酸的特征基团，其中任何官能团可被保护；

R₄苯基或5-或6-元杂芳环，其中任何环中氮原子可被氧化为N-氧化物，它可任选地与苯环或5-、6-或7-元杂环稠合，其中环可任选地被下列基团取代：

(a)一个或多个独立地选自羟基、卤素、-CN、-CO₂H、-CO₂(C₁-C₆)烷基、-(C₁-C₆)烷基-CO₂(C₁-C₆)烷基、-CONH₂、-CONH(C₁-C₆)烷基、-CON((C₁-C₆)烷基)₂、-CHO、-CH₂OH、-(C₁-C₄)全氟烷基、-O(C₁-C₆)烷基、-S(C₁-C₆)烷基、-SO(C₁-C₆)烷基、-SO₂(C₁-C₆)烷基、-NO₂、-NH₂、-NH(C₁-C₆)烷基、-N((C₁-C₆)烷基)₂和-NHCO(C₁-C₆)烷基的取代基，或

(b)选自(C₁-C₆)烷基、(C₂-C₆)链烯基、(C₂-C₆)炔基、(C₃-C₆)环烷基、(C₄-C₈)环烯基、苯基、苄基、杂芳基或杂芳基甲基的基团，这些基团可任选地被一个或多个选自卤素、羟基、氨基、羧基、(C₁-C₄)全氟烷基、(C₁-C₆)烷基、-O(C₁-C₆)烷基或-S(C₁-C₆)烷基的取代基所取代；

R₅是氢或(C₁-C₆)烷基。

发明简述

N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨氨甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺是在WO95/19956里作一般揭示和要求的一类化合物中的一种，但对该化合物没有作特定的揭示，也没有特定揭示它的性质。

WO95/19956述及：在所揭示的一类化合物中，芳族或杂芳基R₄取代基相对于结构相似，但存在在已知化合物上的R₄取代基不同(通常为甲基)的已知化合物，其对溶基质素的活性出人意料地增加，同时保留了对抗胶原酶和明胶酶的活性。作为这类化合物的一个物质，新选定的化合物N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺具有这些性质。

但是，已知一些MMP抑制剂的副作用在高剂量和/或长期剂量给予一些动物和人体后会诱发关节部位的肌-骨骼疼痛(有时也称为“腱炎”)，如肩部。虽然人们相信该副作用在停止给药后基本可逆转，但它是不需要的。引起疼痛的机理尚不了解，目前还不能将化合物诱发疼痛的倾向与特定的结构特性或分子的酶抑制曲线相关起来。因此，任何给定的MMP抑制剂都会引起该副作用，且副作用的严重程度不可预见，必须按照进行试验。

业已发现，选定的N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺能明显降低诱发肌-骨骼疼痛副作用的倾向。它不同于接近结构的类似物，如更易于诱发该副作用的N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-羟基-琥珀酰胺。

WO95/19956也述及：所揭示的芳基酰胺MMP抑制剂包括口服生物可利用的化合物。如根据用药物口服剂量给药后动物血液中药物一段时间里产生的MMP抑制活性的峰水平或活性(“曲线下面积”)可知，不是所有被WO95/19956涵盖的化合物都是口服生物可利用的。业已发现，N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺在人体和其它哺乳动物中是口服生物可利用的。

口服生物利用性和对腱炎副作用易患性减少的组合意味着本发明化合物给治疗需要中等时间或较长时间里全身给予MMP抑制剂提供了相对宽广的治疗窗口。因此该化合物可用来治疗，如类风湿性关节炎、癌症、多发性硬化症(MS)、急性热病性多神经炎(GBS)和牛皮癣。

发明详述

本发明提供了下式(II)的N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺，及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂合物

本发明化合物具有三个手性碳原子，它们的立体化学构型在化合物命名中被特定化并如式(II)的结构所示。但是，应当明白，若特定化的对映异构体占主导，则本发明包括化合物(II)的对映异构体的混合物。

本发明也包括包含N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明优选的组合物是适合口服给药的这些。

本发明进一步包括N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备治疗包括人体的哺乳动物的类风湿性关节炎、癌症、多发性硬化症(MS)、急性热病性多神经炎或牛皮癣的药物组合物中的应用。

本发明也包括治疗哺乳动物的类风湿性关节炎、癌症、多发性硬化症(MS)、急性热病性多神经炎或牛皮癣的方法，包括对哺乳动物给予能减少这些疾病的症状和/或病症的有效量的N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。

本发明化合物的盐包括生理学上可接受的酸加成盐，例如，盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、富马酸盐和马来酸盐。也可与碱类形成盐如钠盐、钾盐、镁盐和钙盐。

本发明选定的化合物可通过本文实施例所所述的途径制备，可通过与其药物动力学性质相适应的任何途径给药。口服组合物可为片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、锭剂、液体剂或凝胶剂的形式，如口服、局部外用或灭菌的非肠道给药的溶液或悬浮液。口服的片剂和胶囊剂可为单位剂量形式，可含有常规的赋形剂，诸如粘合剂；填充剂；压片润滑剂；崩解剂；或药学上可接受的湿润剂。片剂可根据一般药学领域公知的方法包衣。口服液体制剂可以是如水性或油性的悬浮剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式，或以干燥产品形式提供，而在临用前用水或其它合适的赋形剂稀释。这些液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂；乳化剂；非水赋形剂(包括食用油)；防腐剂；需要时还加常规的调味剂或着色剂。

活性组份也可用灭菌介质经非肠道给药。根据所用的赋形剂和浓度，药物可悬浮于赋形剂，或者溶于赋形剂。诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的佐剂可溶于赋形剂。

对于给定的临床指征本发明化合物通过给定的途径给药的剂量可根据相关权威机构许可的标准方法进行临床试验来测定。一般来说，本化合物现在预计的人体给药剂量单位为5-100毫克，每天二或三次。

下列实施例阐述了本发明化合物的制备。

WO95/19961揭示了起始物2R-(2，2-二甲基-5-氧基-[1，3]二氧戊环-4S-基)-4-甲基-戊酸和L-叔-亮氨酸-N-(2-吡啶基)酰胺的制备。

实施例里使用了下列缩写：

DMF N，N-二甲基甲酰胺

EDC N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物

HOBt 1-羟基苯并三唑

NMM N-甲基吗啉

THF 四氢呋喃

实施例

N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基琥珀酰胺

步骤A

2S-羟基-3R-异丁基-琥珀酸二甲酯

将2R-(2，2-二甲基-5-氧基-[1，3]二氧戊环-4S-基)-4-甲基-戊酸(75.0克，0.326毫摩尔)溶于甲醇(500毫升)并冷却到0℃，所得的溶液用氯化氢气体饱和。让反应混合物温热到室温，搅拌过夜。减压除去溶剂，将残留物溶于二氯甲烷，依次用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸发至干，得到黄色油状物的标题化合物(53克，75％)。¹H-NMR：δ(CDCl₃)，4.10(1H，d，J＝4.0Hz)，3.60(3H，s)，3.50(3H，s)，3.18(br，s)，2.78(1H，m)，1.61-1.40(2H，m)，1.28(1H，m)和0.76-0.73(6H，m)。

步骤B：

2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸二甲酯

将2S-羟基-3R-异丁基琥珀酸二甲酯(23.9克，110毫摩尔)溶于DMF(200毫升)，加入蒸馏的碘代甲烷(8.2毫升，132毫摩尔)，然后加入氧化银(I)(27.95克，121毫摩尔)。使反应物在室温、排除光下搅拌7天，减压除去溶剂，残留物经柱层析纯化(硅胶，二氯甲烷作为洗脱液)，得到粘稠的黄色油(9，16克，75％)。

¹H-NMR：δ(CDCl₃)，3.38(1H，d，J＝7.5Hz)，3.71(3H，s)，3.62(3H，s)，3.30(3H，s)，2.85(1H，m)，1.65-1.39(2H，m)，1.10(1H，m)和0.83-0.81(6H，m)。

步骤C：

2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸二锂盐

将氢氧化锂(1.76克，42.0毫摩尔)加到2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸二甲酯(4.70克，20.0毫摩尔)在甲醇(30毫升)和水(30毫升)里的溶液。使反应混合物在室温下搅拌2小时，然后减压除去溶剂，得到黄色固体的标题化合物(4.40克，定量)。¹H-NMR：δ(CD₃OD)，3.52(1H，d，J＝5.1Hz)，3.27(3H，s)，2.65(1H，m)，1.56-1.53(2H，m)，1.31(1H，m)和0.82-0.78(6H，m)。

步骤D：

2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸4-甲酯

将2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸二锂盐(25.14克，116毫摩尔)溶于无水的THF(150毫升)，让溶液冷却到0℃。加入三氟乙酸酐(30毫升)，使混合物在室温下再搅拌4小时。减压除去溶剂，在0℃下将残留物溶于无水甲醇(200毫升)，使溶液在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂得到标题化合物的黄色油状物(54.3克，包括2当量三氟乙酸锂)，它无需进一步纯化而用于步骤E。¹H-NMR；δ(CD₃CD)，7.71(1H，d，J＝7.5Hz)，3.65(3H，s)，3.24(3H，s)，2.72(1H，m)，1.56-1.42(2H，m)，1.06(1H，m)和0.81-0.79(6H，m)。

步骤E：

3R-[2，2-二甲基-1S-(吡啶基氨基甲酰基)-丙基氨基甲酰基]-2S-甲氧基-5-甲基-己酸甲酯

在加入HOBt(8.70g，53.7毫摩尔)，然后加入EDC(12.35g，64.4毫摩尔)期间，将步骤D的产物(25.06克，等当量于53.7毫摩尔2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酸4-甲酯)冷却到0℃。在2小时里搅拌混合物并温热到室温。这样形成的活性酯溶液冷却到0℃，加入L-叔-亮氨酸-N-(2-吡啶基)酰胺(11.11g，53.7毫摩尔)，让混合物室温下搅拌过夜。减压除去溶剂，将残留物溶于乙酸乙酯。溶液依次用1M碳酸钠溶液和盐酸洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并蒸干。残留物经柱层析纯化(硅胶，0-5％在二氯甲烷里的甲醇)，得到白色固体的标题化合物(13.41克，61％)。¹H-NMR：δ(CDCl₃)，9.61(1H，s)，8.47(1H，m)，8.24(1H，d，J＝8.4Hz)，7.74(1H，m)，7.07(1H，m)，6.97(1H，d，J＝8.9Hz)，4.64(1H，d，J＝8.9Hz)，4.01(1H，d，J＝7.6Hz)，3.76(3H，s)，3.41(3H，s)，2.75(1H，m)，1.79(1H，m)，1.51(1H，m)，1.11(1H，m)，1.02(9H，s)，0.84(3H，d，J＝6.3Hz)和0.82(3H，d，J＝6.3Hz)。

步骤F：

3R-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)丙基氨基甲酰基]-2S-甲氧基-5-甲基-己酸锂盐

将3R-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)丙基氨基甲酰基]-2S-甲氧基-5-甲基-己酸甲酯(13.4克，32.9毫摩尔)溶于THF(265毫升)和水(65毫升)混合物里，加入氢氧化锂单水合物(1.396克，33.3毫摩尔)。让溶液在室温下搅拌2小时，然后减压蒸发得到黄色油，它进一步与甲苯共沸干燥。马上使用产物(13.4克，含残留的溶剂)，不需要进一步的纯化。¹H-NMR；δ(CD₃OD，3.5∶1非对映异构体的混合物)，8.31(1H，m)，7.99(1H，d，J＝8.3Hz)，7.66(1H，m)，7.00(1H，m)，4.49(0.23H，s；少量非对映异构体)，3.52(0.77H，d，J＝7.6Hz；主要的非对映异构体)，3.21(0.69H，s；少量非对映异构体)，3.20(2.31H，s，主要的非对映异构体)，2.64(1H，m)，1.53(2H，brm)，1.18(1H，m)，1.01(9H，s)，0.85(3H，d，J＝6.4Hz)和0.81(3H，d，J＝6.3Hz)。

步骤G：

N⁴-苄氧基-N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺

将步骤F的产物(13.4g，约33毫摩尔)溶于无水DMF(250毫升)，放置在氩气下，搅拌下冷却到-10℃。滴加入氯甲酸乙酯，然后加入NMM(1.8ml，16.5毫摩尔)。使混合物搅拌30分钟后滴加O-苄基羟基胺(6克，49毫摩尔)在DMF(10毫升)里的溶液。让反应混合物温热到室温，搅拌过夜。减压除去溶剂，残留物在乙酸乙酯和盐水之间分配。有机层用1M碳酸钠溶液洗涤，经快速色谱层析纯化(硅胶，5％在二氯甲烷里的甲醇)。收集含所需产物的组分并蒸发。产物用乙醚研磨以除去轻微的颜色杂质。得率：9.44克(58％＞10∶1非对映异构体混合物)。¹H-NMR；δ(CDCl₃，主要的非对映异构体)，10.26(1H，s)，9.93(1H，s)，8.32(1H，m)，8.23(1H，d，J＝8.2Hz)，7.63(1H，m)，7.25(5H，m)，7.12(1H，d，J＝9.2Hz)，7.02(1H，m)，4.94(1H，d，J＝10.8Hz)，4.76(2H，d，J＝3.8Hz)，3.88(1H，d，J＝5.5Hz)，3.32(3H，s)，2.91(1H，m)，1.72(1H，m)，1.55(1H，m)，1.35(1H，m)，1.02(9H，s)，0.89(3H，d，J＝6.5Hz)和0.85(3H，d，J＝6.5Hz)。

步骤H：

N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺

将N⁴-苄氧基-N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺溶于甲醇(75毫升)和乙醇(75毫升)混合物，放置在氩气氛里。加入10％钯/碳，将氢气通入溶液中达2小时，此时TLC分析显示所有的起始物都被消耗完。该系统用氩气洗涤，通过过滤除去催化剂。减压除去溶剂得到白色固体的标题化合物(8.8克，定量的；12∶1非对映异构体混合物)。熔点163-164℃。¹H-NMR；δ((CD₃)₂SO)，10.67(1H，s)，10.13(1H，s)，8.90(1H，s)，8.15(1H，m)，7.89(1H，d，J＝8.4Hz)，7.81(1H，d，J＝8.8Hz)，7.60(1H，m)，6.93(1H，m)，4.53(0.12H，d，J＝9，4Hz)，4.43(0.88H，d，J＝8.8Hz)，3.74(0.12H，d，J＝10.0Hz)，3.32(0.88H，d，J＝9.8Hz)，2.98(0.3H，s)，2.96(2.64H，s)，2.78(1H，m)，1.23(2H，m)，0.84(10H，s和m)，0.65(3H，d，J＝6.4Hz)和0.56(3H，d，J＝6.3Hz)。¹³C-NMR：δ(CD₃OD)，172.6，170.0，166.0，151.5，147.9，136.0，119.5，113.6，61.2，60.6，56.7，46.2，37.0，34.0，26.5，23.7和21.7。IR；ν_最大(KBr)，3255，2957，1700，1645，1524，1467，1435，1370，1301，1213和1152cm^-1。测定值：C，58.40，H，7.92，N，13.61％；C₂₀H₃₂N₄O₅·0.2H₂O理论值：C58.29，H，7.92，N，13.60％。

生物实施例A

通过Cawston和Barrett的方法(Anal.BIochem.，99，340-345，1979)测定本发明化合物作为间质的胶原酶抑制剂的效力，将1mM被试验的化合物的溶液或其稀释液与胶原质和胶原酶在37℃下培养16小时(用25mM Hepes缓冲，含5mM CaCl₂，0.05％Brij 35和0.02％ NaN₃，pH7.5)。胶原是乙酸酯化的C¹⁴胶原质，用Cawston和Murphy方法制备(酶学方法(Methods in Enzymolgy)，80，711，1981)，在此并入本文供参考。离心样品以沉积下未消化的胶原，在闪烁计数器上检测上清液部分的放射活性，以测定水解。在1mM试验化合物或其稀释液存在下的胶原酶活性与没有抑制剂的对照活性进行比较，所得的结果是如下使胶原酶活性抑制达50％的抑制剂浓度(IC₅₀)。

通过Cawston等的方法(生物化学杂志(Biochem.J.)195，159-165，1981)测定本发明化合物作为基质溶素-1抑制剂的效力，将1mM被试验的化合物的溶液或其稀释液与基质溶素和C¹⁴乙酸酯酪蛋白在37℃下培养16小时(用25mMHepes缓冲，含5mM CaCl₂，0.05％Brij 35和0.02％NaN₃，pH7.5)。酪蛋白是乙酸酯化的C¹⁴酪蛋白，用Cawston和Murphy方法制备(同上)。在1mM试验化合物或其稀释液存在下的基质溶素活性与没有抑制剂的对照活性进行比较，所得的结果是如下使基质溶素活性抑制达50％的抑制剂浓度(IC₅₀)。

本发明化合物作为72kDa明胶酶的抑制剂的效力根据Sellers等，生物化学，171，493-496(1979)方法测定。从RPMI-7951细胞派生出来的72kDa明胶酶通过明胶-琼脂糖色谱层析纯化。通过与氨基苯基乙酸汞培养来活化酶，约0.05单位酶与50微克[¹⁴C]-放射标记的明胶在合适的缓冲剂里、在37℃下培养16小时。在培养结束时，加入50微克牛血清白蛋白和三氯乙酸(最终浓度16％)以终止反应并沉淀下任何未分等级的基质。将反应管在冰上放15分钟，然后在10,000g下离心15分钟以沉积下沉淀的基质。取出200微升反应上清液的等分液，通过闪烁计数器测定放射活性。参照剂量反应曲线测定抑制剂的作用。通过将曲线拟合到数值上并计算出达到对酶50％抑制所需的抑制剂浓度来得到IC₅₀(使酶活性减少50％所需的抑制剂浓度)。对于每次IC₅₀测定，检测至少8个浓度的抑制剂对明胶酶活性的影响。用DMSO溶解抑制剂和稀释。

上述对本发明化合物的试验结果如下：

酶 IC₅₀(nM)

胶原酶	10
胶原酶	10	72kDa明胶酶	70
基质溶素	30	72kDa明胶酶	70

生物实施例B

测量试验化合物给药后一段时间里实验动物的血药浓度。

通过灌胃法对每个处理组6个雄性大鼠(300克)给予化合物。在给药后的0.5小时、1.0小时、2.0小时、6.0小时和24小时通过尾部静脉穿刺取得血样。将0.4毫升血样放入含0.1毫升酸性柠檬酸右旋糖(ACD)作为抗凝剂的4.5毫升试管中。为了萃取，加入3毫升甲醇，通过离心(3000转/分钟达30分钟)使沉淀的血样成小球。取出2毫升上清液的等分物，通过冻干浓缩。萃取物再溶于200微升DMSO，用10微升等分物供胶原酶抑制活性试验。用上述生物实施例A所述的胶原酶试验测定萃取物里抑制活性，通过与标准曲线比较得到抑制剂的浓度(即药物加上任何代谢物)。结果表达为峰浓度(单位ng/ml)，在0.5-24小时里的曲线下面积(AUC)单位为ng/ml×小时，AUC单位为IC₅₀×小时。结果

峰浓度 AUC(0.5-24小时) AUC(0.5-24小时)

ng/ml ng/ml×小时 nIC₅₀×小时

212 2966 674

也对长尾猴和健康人体口服给予本发明化合物，在给药后检测这些对象血液里的抑制活性水平。

生物实施例C

在两种癌症动物模型里试验本发明化合物，被发现是有活性的：

B16小鼠黑素瘤模型

在该模型中，用10⁵B16小鼠黑素瘤细胞对C57/BL6J小鼠进行皮下接种。使肿瘤生长18天，通过卡钳测量和下式计算肿瘤重量：重量(毫克)-长度(毫米)×宽度(毫米)÷4。一组小鼠(n＝19)通过在与B16肿瘤相对的侧面上皮下植入的微渗透泵接受化合物。在肿瘤接种前那天植入泵，以300微克/天的剂量给予化合物。对照组(n＝17)从相同的植入泵里接受合适体积的赋形剂。

对照肿瘤在第18天的平均重量为1145±97毫克(图15)。化合物处理的肿瘤重量为774±50毫克。其减少(试验化合物为32％)是显著的(p＜0.005)。在研究结束时对样品评估表明，试验化合物的血浆水平为26.8±3.2ng/ml。

MDA-435乳腺癌模型

在该模型里，动物用MDA-435细胞(10⁵细胞/小鼠)接种，让肿瘤生长四天，然后通过肿瘤重量随机分成三个处理组(每组n＝15)。微泵在第5天手术植入，每个含15毫克/毫升或60毫克/毫升赋形剂或试验化合物(各自释放180或720微克/小鼠/天)。在第19天把泵放回原处，在第32天结束时进行研究。有剂量相关的肿瘤生长抑制，在180微克/小鼠/天时抑制19％，在720微克/小鼠/天时抑制33％。较高剂量的抑制有统计学意义(p＜0.005)。在研究末对样品的评估表明，低剂量和高剂量组的血浆水平分别为99±6ng/ml和136±42ng/ml。

生物实施例D

试验本发明化合物降低大鼠腱鞘炎的症状的倾向。本发明化合物(化合物A)对大鼠腱鞘炎的作用与结构相近的异构体，即N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-3-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-羟基-琥珀酰胺(化合物B)进行比较。

使用雄性Lewis大鼠。在每个研究中对直止30个大鼠进行称重，按体重随机分组，n＝6/组。在每个研究中，一个相应的赋形剂组与每个处理组进行比较。

化合物A配制成它的甲磺酸盐，而化合物B则配制成游离碱。对于化合物A@15毫克/毫升赋形剂是50％DMSO，37％0.1M甲磺酸，13％无菌水；@30毫克/毫升赋形剂是50％DMSO，37％0.2M甲磺酸，13％无菌水。对于化合物B@15mg/ml赋形剂是50％DMSO/水。

称重空的和满的Alzet(商标)渗透微泵(2ML2，14天，5微升/小时，AlzaCorp.美国加利福尼亚94303出售)，以保证正确地填满。在植入前，填满的泵放置在37℃下。所有大鼠用氟烷麻醉。一旦麻醉，颈背去毛并消毒。在预备的位置切开约2厘米长的纵向切口，用止血钳作皮下口袋。插入微泵，泵的出口背离伤口。割开的伤口缝合，伤口周围再消毒。手术后即刻让所有的大鼠接受麻醉，(Temgesic-商品名-Reckitt and Colman)0.1mg/kg皮下注射到肋腹。从麻醉中苏醒时，动物回到了含无水草垫的笼子里以保证伤口痊愈前无灰尘。手术后那天，所有大鼠放回标准草垫上，组3里饲养以更精确地观察腱鞘炎症状。

植入微泵后，称重大鼠，检测腱鞘炎可能的发作。通过基于评分系统(如下)的观察测量腱鞘炎的发作和严重程度。每天观察大鼠持续16天。平均分数＞2被认为是明显的。使用的评分系统如下：

放置：刺激时显示的动物移动

正常 0 正常移动 0

一个脚休息 1 勉强移动 1

没有脚休息 2 中等勉强移动 2

非常勉强移动 3

步法：

正常 0

避免使用1个后足 1

避免使用两个后足 2

结果显示给予化合物A(15毫克/毫升和30毫克/毫升)的大鼠和只给予赋形剂的大鼠没有腱鞘炎症状，而给予化合物B的大鼠在第8天起显示出明显的症状(在第8天平均分数＞2，在第15和16天上升到约6)。

现证实，上述试验给予化合物A和B的大鼠接受了来自微泵暴露与化合物的血浆。在微泵植入后第3天和第10天从通过尾部静脉用氟烷稍微麻醉的大鼠里得到血样。将血样放在含3.0毫升甲烷的试管里萃取出游离的化合物和结合的化合物。通过荧光分析，用香豆素肽基底Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂(Mca＝(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基，Dpa＝N-3-(2，4-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙基)测定化合物A或化合物B的血浓度(参见Knight等，FEBS Lett.1992，296，263-266)。在植入后的第16或第17天，终止研究，用最终氟烷麻醉大鼠，通过心脏针刺取出血样(0.5ml)，测定化合物A或化合物B的血浓度。

生物实施例E

在GBS的动物模型里试验本发明化合物的作用。

实验性自体免疫神经炎(EAN)是T细胞介导的外周神经系统的自体免疫疾病。该模型显示出许多GBS的病原性特征，共济失调、虚弱和麻痹症状。当动物用在佐剂里的来自外周神经的髓磷脂或用诸如蛋白质O的髓磷脂的蛋白组分对动物注射时，会导致EAN。EAN在脊髓根和外周神经里发生，其特征是血管周单核细胞浸润、轴突脱髓鞘和神经传导缺损。GBS和EAN病原学与TNFα有关；TNFα水平在GBS病人血液升高，抗-TNFα抗体能降低EAN的疾病严重程度(Hartung HP.神经学年报(Annals of Neurology)1993；33：563-567)。

在大鼠EAN模型里试验本发明化合物，其中通过注射佐剂里的外周神经髓磷脂来诱发疾病症状。

从手术植入微泵里以5微升/小时的速率给予化合物15或30毫克/毫升(参见生物实施例D)，分别释放7和14毫克/kg/天。从第1-15天实验过程里度用化合物处理能以剂量-依赖的方式明显减少临床症状的发生。该化合物在第8-15天以15或30毫克/毫升，10微升/小时的速率给予治疗，分别释放14和28mg/kg/天时，也能以剂量依赖的方式减少EAN模型里的临床症状。

生物实施例F

在MS实验模型里本发明化合物的活性：

方法

使用Matyszak和Perry所述的MS的延缓型超敏性模型(Matyszak MK &Perry VH.1995.在延缓型超敏后，中枢神经系统里的脱髓鞘作用对Calmette-Guerin菌的反应(Demyelination in the central nervous system followinga delayed type hypersensitivity response to bacillus Calmette-Guerin)神经科学(Neuroscience)64：967-977)。麻醉Lewis雄性大鼠并将1微升含10⁵加热灭活的Calmette-Guerin菌(BCG)有机体的磷酸盐缓冲盐水溶液注入左半球纹状体。BCG通过27G、10微升容积注射器定向性地注射。供注射的坐标是：前囟+1.2mm，侧面+3.0mm，深4.5mm。4周后，将200微克含10⁷加热灭活的BCG有机体在完全Frenuds佐剂里的溶液皮下注射到后肢。再过15天对大鼠静脉注射2750U II型山葵过氧化酶(HRP)。30分钟后，用戊巴比妥钠使大鼠深度麻醉，用100毫升含5000U/升肝素的0.9％(w/v)NaCl，然后用200毫升含2％低聚甲醛和0.05％戊二醛的低聚甲醛-赖氨酸-高碘酸盐固定剂(PLP)经心脏灌注。取出大脑，在PLP里再固定4小时，在埋入Tissue-Tek O.C.T.(milesinc Elkhart美国)里和在液氮里冷冻前，通过在4℃、30％蔗糖里浸渍过夜来保护细胞。通过Hanker-Yates方法(Perry VH等1992)切割没有漂浮物的50微米片段供HRP定位。

该方法概括了在定向注射BCG位点处的的延缓型超敏反应，其特征在于：血管外存在HRP的染色表明血-脑屏障局部崩溃；对高分子量的白细胞普通抗原特异的抗体OX-22染色表明淋巴细胞浸润；对II类多数组织相容的抗原特异的OX-6抗体染色表明白细胞的活化；用对髓磷脂碱性蛋白的抗体染色表明的髓磷脂崩解。这些特征都是患有MS的病人的中枢神经系统里可见的活性损害的标志。通过数出染色强度最大的区域里的OX-22阳性细胞数来数出淋巴细胞数。报告在单个视野里细胞数，表达为细胞/mm²。用辅以图象分析、输出数据表达为mm²的计算机算出MHC类II表达、血脑屏障泄漏和脱髓鞘作用的面积。

通过在第二次注射BOG后5天开始每天口服两次30毫克/kg本发明化合物，直到第15天，来评估本发明化合物的作用。本发明化合物在含0.01％Tween80的磷酸盐缓冲的盐赋形剂里配制。对照动物只接受赋形剂。

用本发明化合物处理的动物中的血脑屏障泄漏、MHC类II的表达、脱髓鞘作用的面积和T细胞数与赋形剂处理的对照比较，用Students T试验。

结果

在赋形剂处理的动物里DTH反应的特征在于血脑屏障的崩毁、淋巴细胞的浸润、MHC类II的表达和脱髓鞘作用。用本发明化合物处理的动物中的血脑屏障泄漏面积明显减少(p＜0.05)，浸润的T细胞数明显减少(p＜0.0001)

脱髓鞘作用和MHC类II表达的面积减少，但没有统计学意义。

本发明化合物在MS的DTH模型里的作用：

赋形剂化合物血脑屏障泄漏 6.325±1.953 2.042±0.487T细胞浸润 851.1±66.5 341.2±21.9MHC类II表达 1.763±0.370 1.318±0.300脱髓鞘作用 0.960±0.329 0.758±0.227数值以平均值±标准误表示。

Claims

1.下式(II)的N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺，或其药学上可接受的盐

2.一种药物组合物，包括N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺，或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的组合物，它是口服给药形式。

4.N¹-[2，2-二甲基-1S-(吡啶-2-基氨基甲酰基)-丙基]-N⁴-羟基-2R-异丁基-3S-甲氧基-琥珀酰胺，或其药学上可接受的盐在制备治疗哺乳动物，包括人体的类风湿性关节炎、癌症、多发性硬化症、急性热病性多神经炎或牛皮癣的药物组合物中的应用。