CN112494621A - 草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了草果挥发油在治疗鼻咽癌的药物中的应用，草果挥发油体外对鼻咽癌细胞有明显增殖抑制作用，可通过线粒体凋亡途径诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，进而发挥抗肿瘤生物学效应，具有治疗鼻咽癌等抗肿瘤新药研发的前景。

Description

草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。

背景技术

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是常见的恶性肿瘤之一，国际癌症研究机构(International Agency For Research on Cancer,IARC)估计，2020年全球将有910,677例新增的NPC病例，且763,570,000例患者或将死于这种癌症。据WHO统计，约80％NPC发生在中国，严重危害人民健康和生命安全，是中国重点防治的恶性肿瘤之一。目前，放射和化学药物治疗是其主要的治疗手段，而局部复发及远处转移又是治疗失败的主要原因；治疗鼻咽癌的药物主要有紫杉醇类、顺铂、5-氟尿嘧啶、西妥昔单抗等，但这些抗肿瘤药物多为非特异性药物，伴有减少淋巴细胞、黏膜炎、咽喉/口腔疼痛、贫血、皮疹等毒副作用因此，为了更有效的治疗鼻咽癌，学者们致力于靶向性强、毒副作用小的抗鼻咽癌的新型天然药物研发。

草果(Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)为姜科豆蔻属植物草果的干燥成熟果实，主产于广西、云南、贵州等地，是我国重要的药食两用植物；中医认为其具有燥湿温中、截疟除痰的功效，主治寒湿内阻，痞满呕吐，疟疾寒热，瘟疫发热等症状，广泛用于治疗痔疮、咽喉感染、消化系统疾病、恶心和腹痛等病症。现代研究表明，草果具有降脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、防霉和抗炎镇痛等生物活性。草果挥发油作为草果重要的活性部位，其成分包括1,8-桉叶素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香叶酯、芳樟醇、反-橙花叔醇、β-月桂烯等，具有抗氧化、调节胃肠功能、抗菌、抗肿瘤及改变药物通透性等生物活性。

现有研究报道了草果挥发油对人肝癌细胞系HePG2、Bel7402、宫颈癌细胞系HeLa、胃癌细胞系SGC-7901、肺癌细胞系A549、前列腺癌细胞系PC-3等均有较强细胞毒性，而对人体正常细胞系HL-7702、HUVEC毒性较低(Yang Y,Yue Y,Runwei Y,et al.Cytotoxic,apoptotic and antioxidant activity of the essential oil of Amomum tsao-ko[J].Bioresour Technol,2010,101(11):4205-4211)。然而，目前尚无草果挥发油或草果挥发油的活性成分具有抑制鼻咽癌的作用的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。

进一步地，上述草果挥发油是对草果进行蒸馏提取所得。

更进一步地，上述草果挥发油是对草果进行水蒸气蒸馏提取所得。

进一步地，上述治疗鼻咽癌的药物是以草果挥发油为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

更进一步地，上述制剂是液体制剂、固体制剂或凝胶制剂。

更进一步地，上述制剂是液体制剂，优选为草果挥发油的水溶液。

进一步地，上述治疗鼻咽癌的药物是抑制鼻咽癌细胞增殖的药物。

进一步地，上述治疗鼻咽癌的药物是诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物。

更进一步地，上述诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物是通过线粒体途径诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物。

实验结果表明，草果挥发油对鼻咽癌细胞有明显增殖抑制作用，可通过线粒体凋亡途径诱导鼻咽癌细胞发生凋亡，进而发挥抗肿瘤生物学效应，具有应用于治疗鼻咽癌等抗肿瘤新药研发的前景。

本发明所述草果挥发油是指参照《中国药典》通则2204挥发油测定法中的方法对草果进行水蒸气蒸馏提取所得的产物，同时也包含通过如二氧化碳超临界流体提取法等挥发油提取方法所得的产物。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的生长抑制曲线。

图2为图2：草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞形态学变化(A:空白对照组；B：0.23mg/mL草果挥发油；C：0.46mg/mL草果挥发油)。

图3为草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的凋亡诱导作用(A图为不同浓度草果挥发油作用6-10B细胞24h后的凋亡检测图；B图为凋亡率的统计学分析(*P<0.05))。

图4为草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡相关蛋白差异表达(A图为草果挥发油作用6-10B细胞24h后凋亡标志性蛋白表达；B图为蛋白表达的数据统计学分析(*P<0.05))。

图5为草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞的线粒体膜电位改变(A图为草果挥发油作用6-10B细胞24h后的线粒体膜电位变化趋势；B图为线粒体膜电位改变的统计学分析(*P<0.05))。

图6为草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞线粒体途径相关蛋白差异表达(图A为草果挥发油处理24h后6-10B细胞的线粒体途径相关蛋白表达变化；图B为蛋白表达数据统计分析(*P<0.05))。

具体实施方式

实验材料

1.药物

草果，购自北京同仁堂，产于云南，成都医学院生药学专家李弈教授鉴定。

2.肿瘤细胞

鼻咽癌6-10B细胞，四川大学生物治疗国家重点实验室馈赠，已在原实验室完成细胞STR鉴定，保存于成都医学院科研实验中心。

3.主要试剂

胎牛血清(Cat.No.10100147)、DMEM基础培养基(Cat.No.11965-092)购自Gibco公司；CCK-8检测试剂盒(Cat.No.CK04)购自日本同仁化学研究所；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(Cat.No.KGA108-2)购自凯基生物公司；线粒体膜电位检测试剂盒(Cat.No.MAK160)和蛋白酶抑制剂Cocktail(Cat.No.11206893001)购自Roche公司；通用蛋白裂解液购自百泰克生物公司；BCA蛋白定量试剂盒(Cat.No.7780)、抗GAPDH(Cat.No.5174)、促凋亡及抗凋亡BCL-2家族抗体试剂盒(Cat.No.5023、Cat.No.2933、Cat.No.4223、Cat.No.2764)、抗Caspase-3(Cat.No.14220)、抗PARP(Cat.No.9542)、抗Caspase-7/9(Cat.No.12827、Cat.No.9502)、抗cleaved Caspase-7/9抗体(Cat.No.8438、Cat.No.52873)和羊抗兔IgG抗体(Cat.No.7074)购自Cell Signaling Technology公司。

4.主要仪器

CO2培养箱和生物安全柜(Thermo公司)，低温离心机和高速离心机(Eppendorf公司)，水平离心机(浙江湘仪公司)，超纯水机Direct Q5(Millipore公司)，酶标仪(Bioteke公司)，流式细胞仪NovoCyte(ACEA公司)。

实施例1、草果挥发油的提取及其制备

草果挥发油采用水蒸气蒸馏法(参照《中国药典》通则2204挥发油测定法的方法)提取。

之后采用吐温-80对提取得到的草果挥发油进行乳化，乳化后用无菌蒸馏水进行稀释至所需浓度。

以下通过实验例证明草果挥发油的有益效果。

实验例1、草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的增殖抑制试验

1、实验方法

采用5个浓度(0.058mg/mL、0.12mg/mL、0.23mg/mL、0.46mg/mL和0.93mg/mL)的草果挥发油处理鼻咽癌6-10B细胞24h，CCK-8法检测草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞的抑制情况，并用GraphPad Prism 7绘制鼻咽癌6-10B细胞的生长抑制曲线。

2、实验结果

结果如图1所示，草果挥发油对鼻咽癌6-10B细胞具有增殖抑制作用，且呈剂量依赖性，24h的IC₅₀为0.14mg/mL。

以上结果说明草果挥发油可以抑制鼻咽癌细胞增殖。

实验例2、草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡检测

1、实验方法

采用5个不同浓度(0.058mg/mL、0.12mg/mL、0.23mg/mL、0.46mg/mL和0.93mg/mL)的草果挥发油处理鼻咽癌6-10B细胞24h，倒置显微镜下(20×物镜)观察鼻咽癌6-10B细胞形态变化。综合分析细胞增殖抑制活性、细胞毒性和形态学结果，选择明显引起细胞凋亡的3个不同浓度草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理，探讨其作用机制。采用Annexin V-FITC/PI双染法，通过流式细胞仪检测经3个不同浓度草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24h后，对鼻咽癌6-10B肿瘤细胞的凋亡诱导效应，以未处理组为空白对照。

2、实验结果

在3个不同浓度草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理后，鼻咽癌6-10B细胞可见典型的细胞凋亡现象，即细胞皱缩、变圆，核染色质致密深染，形成致密质块，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体(图2B)。而草果挥发油在较高浓度(0.93mg/mL和0.46mg/mL)呈细胞毒性作用，鼻咽癌细胞呈现死亡现象，贴壁细胞出现完全脱落、变形和膜破裂(图2C)。以上结果说明草果挥发油具有抑制鼻咽癌细胞增殖的作用。

形态学结果显示，高浓度(0.93mg/mL和0.46mg/mL)草果挥发油使6-10B细胞破碎裂解，发挥明显的细胞毒作用；而在较低浓度(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)草果挥发油作用下，鼻咽癌6-10B细胞呈现凋亡诱导现象。进一步用Annexin V-FITC/PI双染法、流式细胞术验证药物的凋亡诱导效应，结果显示：不同浓度草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)对鼻咽癌6-10B细胞具有明显诱导肿瘤细胞凋的作用，其中凋亡细胞所占比例分别为47.51％、33.91％、23.22％和2.76％，呈典型剂量依赖性(图3)。

以上结果说明，草果挥发油可以诱导鼻咽癌细胞凋亡。

实验例3、草果挥发油诱导鼻咽癌6-10B细胞凋亡的蛋白检测

1、实验方法

3个不同浓度的草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24h后，采用Western Blot法，分析凋亡通路相关蛋白PARP、Caspase-3/7/9及其cleaved片段，以未处理组为对照。

2、实验结果

用对6-10B细胞具有凋亡诱导效应的草果挥发油作用浓度(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24h，Western Blot法分析凋亡通路相关蛋白PARP和Caspase-3/7/9及其cleaved片段的表达情况。发现鼻咽癌6-10B细胞PARP和Caspase-7/9的cleaved片段表达明显增加，较空白对照组具有统计学意义(P﹤0.05)(图4)。

以上结果说明，草果挥发油诱导了鼻咽癌细胞凋亡相关蛋白的表达，从而诱导鼻咽癌细胞凋亡。

实验例4、草果挥发油作用鼻咽癌6-10B细胞后线粒体膜电位检测

1、实验方法

JC-1是一种用于检测线粒体膜电位的阳离子亲脂性荧光探针，可通过流式细胞仪检测胞内荧光强度来监测线粒体膜电位的改变。3个不同浓度草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)处理鼻咽癌6-10B细胞24h，JC-1染色，流式细胞仪检测鼻咽癌6-10B细胞线粒体膜电位的变化情况，以未处理组为空白对照。采用Western Blot法，分析线粒体途径凋亡相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xl的表达情况。

2、实验结果

JC-1染色和流式检测细胞线粒体膜电位(MMP)，发现草果挥发油(0.23mg/mL、0.12mg/mL和0.058mg/mL)作用6-10B细胞24h后，药物组较对空白照组(的线粒体膜电位明显改变，其比例分别为：32.68％、43.24％和8.22％，具有统计学意义(*P<0.05)(图5)。提示线粒体凋亡途径极有可能参与了草果挥发油诱导的鼻咽癌6-10B肿瘤细胞凋亡过程。

Western Blot进一步分析线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、Bim、Bcl-2、Bcl-xl表达情况，结果显示鼻咽癌6-10B细胞经草果挥发油处理后，凋亡蛋白Bax和Bim表达升高，Bcl-2和Bcl-xl表达降低，差异具有统计学意义(*P<0.05)(图6)。

以上结果说明线粒体凋亡途径参与了草果挥发油诱导的鼻咽癌细胞凋亡。

综上，本发明提供了草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的新用途，草果挥发油体外对鼻咽癌细胞有明显增殖抑制作用，可通过线粒体凋亡途径诱导6-10B细胞发生凋亡，进而发挥抗肿瘤生物学效应，具有治疗鼻咽癌等抗肿瘤新药研发的前景。

Claims (10)

1.草果挥发油在制备治疗鼻咽癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述草果挥发油是对草果进行蒸馏提取所得。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述草果挥发油是对草果进行水蒸气蒸馏提取所得。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗鼻咽癌的药物是以草果挥发油为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制剂是液体制剂、固体制剂或凝胶制剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制剂是液体制剂。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述液体制剂是草果挥发油的水溶液。

8.如权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗鼻咽癌的药物是抑制鼻咽癌细胞增殖的药物。

9.如权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述治疗鼻咽癌的药物是诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物是通过线粒体途径诱导鼻咽癌细胞凋亡的药物。

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