CN112403539A - 一种微流控芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微流控芯片，其包括：基板；以及形成在所述基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道，其中，所述第一管道两端分别包括第一连接口和第二连接口；第二管道，其一端包括第三连接口，另一端与第一管道连通；第三管道，其一端包括第四连接口，另一端与第一管道连通；第四管道，其一端包括其上游分支为3个及以上的管道及第五连接口，另一端通过一段共同的管道与第一管道连通，所述一段共同的管道包括连续弯曲管道。第二管道和第一管道的第一连通部位位于第三管道和第一管道的第二连通部位，及第四管道和第一管道的第三连通部位的中间。

Description

一种微流控芯片
技术领域
本发明属于微流控技术领域，涉及微液滴形成及检测技术，是一种简单实用的实现多条件多因素微液滴包裹微生物或单细胞微流控芯片体系。
背景技术
常规微生物菌株筛选及培养条件优化通常在摇瓶中进行，整个过程效率低、成本高、时间长、需要大量设备与空间。微流控技术具有极高的效率，由于结构微小，易在芯片上一次集成上百个微生物培养单元，可节省大量的培养基；采用软件集成操作，可在芯片上模拟整个实验流程操作，应用微流控芯片进行微生物的培养和筛选可有效避免上述问题。
专利文献1于2013年公开了一种基于微流控芯片的加压细胞培养系统和方法，包括微流控芯片、压力驱动装置、连接管道和压力检测装置，所述微流控芯片中含有通道，所述压力驱动装置包括与之相匹配的用于盛放培养基的容器、所述容器通过连接管道与所述微流控芯片连接，所述动力驱动装置推动容器中的培养基进入微流控芯片，所述压力检测装置通过连接管道与所述微流控芯片连接。该系统可方便地进行细胞在剪切力和压力作用下的培养及相关研究，该细胞加压培养系统拆装方便，便于携带，但是不能实现微生物的培养和检测功能。
专利文献2于2013年公开了一种基于液滴微流控芯片的高通量检测系统，主要包括液滴微流控芯片系统(1)、光路系统(2)、数据采集分析系统(3)构成；其中液滴微流控芯片系统(1)将待检测微生物包埋形成独立单液滴微反应小室，通过光路系统(2)进行单液滴微反应小室内微生物样品的激光诱导荧光检测信号传输，并由数据采集分析系统(3)通过计算机软件对采集得到的信号进行检测分析。该发明的适于激光诱导荧光检测分析，只能是实现微液滴单元样品的检测，无法实现培养和分选功能。
专利文献3于2016年公开了一种单细胞分离微流控芯片，包括基体、以及形成于基体上的微通道，该微通道包括细胞进样口、单细胞收集池、以及依次连通于细胞进样口和单细胞收集池之间的细胞分离单元和液滴输出通道，所述细胞分离单元和液滴输出通道的接合处形成有液滴发生包裹单元，该液滴发生包裹单元与一油相输送通道连通，所述细胞分离单元用以将单排排列的细胞输送至液滴发生包裹单元。该发明采用螺旋盘式微通道对细胞溶液进行处理，使得细胞能够单排排列在管道中，通过液滴包裹单元实现了对细胞进行单个包裹，并且还是实现了不同生理状态同种细胞的分选，但是无法实现微生物的在线培养与实时监测。
虽然上述专利文献中均涉及了微流控芯片，但是由于微生物的选育是一个特殊的生物过程，有时需要改变不同的培养因子进行培养，再经过检测评价，最后才筛选出目标微生物。因此如何通过微流控技术实现微生物微体积、多因素多条件培养与检测是微生物育种的关键问题之一。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：中国专利申请公开CN104099247A；
专利文献2：中国专利申请公开CN104007091A；
专利文献3：中国专利申请公开CN105944775A。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，在微流控技术的基础上，提供一种利用微流控技术进行多因素多水平液滴处理的芯片。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现。
一种微流控芯片，其包括：基板；以及形成在所述基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道，其中，所述第一管道两端分别包括第一连接口和第二连接口，第二管道，其一端包括第三连接口，另一端与第一管道连通，第三管道，其一端包括第四连接口，另一端与第一管道连通，第四管道，其一端包括其上游分支为3个及以上的管道及第五连接口，另一端通过一段共同的管道与第一管道连通，所述一段共同的管道包括连续弯曲管道；第二管道和第一管道的第一连通部位位于第三管道和第一管道的第二连通部位，及第四管道和第一管道的第三连通部位的中间。
所述第四管道上游分支的管道相互平行排列，其相互间的间距为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm。
所述第四管道上游分支为3个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c。
所述第四管道上游分支为4个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d。
所述第四管道上游分支为5个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e。
所述第四管道上游分支与第一管道连通的连续弯曲管道，为P型、S型、U型、折线型、波浪型中的一种或多种结构组成。
所述连续弯曲管道容纳液体的总体积为4～100µL，优选4～50µL，优选4～20µL，优选6～12µL，进一步优选8～10µL。
第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm；进一步优选第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离相同。
所述微流控芯片还包括形成在第一管道上的第一检测窗和第二检测窗，以及与第一管道、第二管道、第三管道、第四管道密封连接的毛细管。
所述第一检测窗在第一管道上，位于第三连通部位与第一连接口中间，所述第一检测窗距离第三连通部位1mm-1cm，优选1.5-3 mm。
所述基板和第一管道、第二管道、第三管道和第四管道由自玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)形成，优选由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)形成。
所述第一管道，第二管道，第三管道以及第四管道的横截面积的范围为2.5×10- 3mm2~4mm2，优选为0.01~3 mm2，进一步优选为0.1~2.5 mm2，进一步优选为0.25~1mm2，进一步优选所述第一管道、第二管道，第三管道以及第四管道的横截面积相同。
所述基板上包括2个孔，所述孔与所述第一管道和第二管道的第一连通部位的距离为0.1mm~1cm，优选0.3mm~5mm，进一步优选为0.5 mm~2mm，用于容纳融合电极。
附图说明
图1为本发明一种微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明一种微流控芯片的示意图。
符号说明：
1 第一管道
2 第二管道
3 第三管道
4 第四管道 (4a、4b、4c、4d、4e)
5 基板
7 孔
8 孔
9 检测窗I
10检测窗II
11 第一连接口
12第二连接口
21 第三连接口
31 第四连接口
41、41’、41’’、41’’’、41’’’’第五连接口
13 第一连通部位
14 第二连通部位
15 第三连通部位
16 第四连通部位
17 第五连通部位
18 第六连通部位
19 第七连通部位。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
为便于对本发明具体方案的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个附图并不构成对本发明的限定。
本发明所述的一种微流控芯片的结构示意图，其至少包括基板；以及形成在所述基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道；第四管道一端包括其上游分支为3个及以上的管道及第五连接口，另一端通过一段共同的管道与第一管道连通，所述一段共同的管道中至少包括一段非直线型的管道。
所述基板为微流控芯片基板，其由玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)形成，第一管道、第二管道、第三管道、第四管道形成于基板内部。在本发明的微流控芯片中，第一管道、第二管道、第三管道、第四管道可以在所述的基板内部通过光刻、热压、雕刻、注塑等工艺形成的，也可以是独立成型的管道。
在实施方式中，所述管道材质选自玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)中的任意一种，优选构成材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
在本实施方式中，所述管道横截面形状没有限制，可以是圆形、矩形、椭圆形等任何便于成型及便于液滴流通的形状，所述管道的横截面积的范围为2.5×10-3 mm2~4mm2，优选为0.01~3 mm2，进一步优选为0.1~2.5 mm2，进一步优选为0.25~1mm2。
在一具体实施方式中，所述第一管道、第二管道、第三管道、第四管道的横截面积可以是彼此相同的，也可以是彼此不同的。所述第一管道、第二管道、第三管道、第四管道可以是变径的。在本发明中，只要管道横截面积满足上述限定即可。本领域技术人员可以根据管道中容纳的液滴大小和液滴用途，对管道的形状和横截面积的大小进行设计。在一些具体实施方式中，进一步优选第一管道、第一管道、第二管道、第三管道、第四管道的形状和横截面积相同，在相同的情况下，能保证管道中液体的压力一致，便于液滴的运动操作。
第二管道和第一管道的第一连通部位位于第三管道和第一管道的第二连通部位，及第四管道和第一管道的第三连通部位的中间，其第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离均为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm。具体来说，距离可以是600µm、700µm、800µm、900µm、1000µm、1100µm、1200µm、1300µm、1400µm、1500µm、1600µm、1700µm、1800µm、1900µm。
在一具体实施方式中，第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离可以是不同的，也可以是相同的。在一实施方式中，第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离相同。
在实施方式中，第四管道上游分支管道相互平行排列，其相互间的间距为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm。具体来说，所述第四管道上游分支管道相互平行排列，其相互间的间距跟管道中液滴的大小、管道的横截面积有关。具体可以是600µm、700µm、800µm、900µm、1000µm、1100µm、1200µm、1300µm、1400µm、1500µm、1600µm、1700µm、1800µm、1900µm。第四管道上游分支管道相互间动间距可以是相同的也可以是不同的。
在一具体实施方式中，第四管道上游分支与第一管道连通中的一段非直线型的管道，优选连续弯曲管道，进一步优选P型、S型、U型、折线型、波浪型中的一种或多种结构组成。也就是说可以是单一P型、S型、U型、折线型、波浪型的重复结构，也可以是该形状中的多种结构组合而成，可以是有规律的交替，也可以是无规则的随机组合。
不管非直线型管道或者弯曲管道是什么形状，其容纳液体的总体积为4～100µL，优选4～50µL，优选4～20µL，优选6～12µL，进一步优选8～10µL。具体来说，该体积跟管道中液滴的体积大小有关，其液滴的体积可以根据液滴的操作与功能改变。
本发明中，所述芯片还包括形成在第一管道上的第一检测窗和第二检测窗，以及与第一管道、第二管道、第三管道、第四管道密封连接的毛细管。
在一具体实施方式中，所述芯片基板上还包括形成在第一管道上的第一检测窗9和第二检测窗10，第一检测窗9和第二检测窗10只要可以用于实现管道中微液滴进行监控和检测即可，对其具体的形状和形式没有限制，如果芯片基本材质是透明材料形成的，则第一检测窗9和第二检测窗10为第一管道的两个检测点，如果芯片基板和管道材料本身是不透明的，第一检测窗9和第二检测窗10处在第一管道本身上形成两个透明的部位，即此处管道与基板材料均为透明。第二检测窗10位置不做限定；所述第一检测窗9在第一管道上，位于第三连通部位与第一连接口中间，所述第一检测窗9距离第三连通部位1mm-1cm，优选1.5-3 mm，有利于更方便更准确地对管道中运动的微液滴进行监控与检测。
在一具体实施方式中，例如所述第一管道两端分别包括第一连接口和第二连接口，第一连接口、第二连接口与芯片外面的毛细管相连，其一端毛细管连接第一动力源，另一端连接第一阀。第二管道的第三连接口通过毛细管道与芯片外部的第二动力源和位于芯片外部的第二阀连通。第三管道的第四连接口和毛细管道与位于芯片外部的第三阀连通。第四管道，其一端包括其上游分支的管道及第五连接口分别通过毛细管道与芯片外部的一一对应的动力源和控制阀相连。
在本发明中通过使用动力源可以实现高精度，平稳无脉动的液体传输。在本发明具体实施方式中，第一动力源、第二动力源，以及第四管道连接的动力源分别独立地选自注射泵、压力泵、蠕动泵、隔膜泵和/或柱塞泵中的任一种，优选第一动力源和第二动力源以及第四管道连接的动力源为注射泵。在本发明中，对于动力源的量程的大小没有限定，本领域技术人员可以根据需要进样样品的多少来适当地选定合适量程的注射泵、压力泵、蠕动泵、隔膜泵和/或柱塞泵。
在本发明中通过使用阀门，以及通过打开和关闭阀门来改变各密闭管道内的压力，通过压力的变化来控制各管道内液滴的流动方向。在本发明中，第一阀、第二阀、第三阀，以及第四管道分支第五连接口连接的控制阀分别独立地选自电磁阀、旋转阀、摇臂阀、夹断阀中的任一种。优选所述第一阀、第二阀、第三阀，以及第四管道分支第五连接口连接的控制阀为旋转阀。
在一些具体的实施方式中，本领域技术人员也可以理解，阀门也可以通过其他形式的机构或部件来代替，例如可以采用用作动力源的注射泵来当做阀门，只要是可以实现通过打开和关闭改变密闭管道内的压力即可。
在本发明中，第一动力源、第二动力源仅是用来表示发挥不同作用的动力源，并不意在限定动力源的数量，第一动力源可以为数个第一动力源，第二动力源可以为数个第二动力源。
在本发明中，第一阀、第二阀、第三阀仅是用来表示发挥不同作用的阀，并不意在限定阀的数量，第一阀可以为数个第一阀，第二阀可以为数个第二阀，第三阀可以为数个第三阀。
在本发明的具体实施方案中，所述毛细管道的横截面积的范围为2.5×10-3mm2~4mm2，优选为0.01~3mm2，进一步优选为0.1~2.5mm2，进一步优选为0.25~1mm2。
所述管道连接口和毛细管连接，连接处进行密封处理，再通过毛细管与动力源和/或阀连通。为保证动力源压力的稳定传导，所述毛细管为硬质管，管路无柔性变化。进一步优选所述毛细管为聚四氟乙烯管(PTFE管)、全氟丙基全氟乙烯基醚与聚四氟乙烯的共聚物管(PFA管)、聚醚醚酮管(PEEK管)、聚碳酸酯管(PC管)、聚苯乙烯管(PS管)中的任一种。
在本发明的一种实施方式中，所述芯片基板上有2个孔7、8，所述孔7、8位于第一管道1和第二管道2的第一连通部位13附近，其位置并不固定，可以分别位于第二管道2的两侧，也可以分别位于第一管道1的两侧，所述孔7、8与所述第一管道1和第二管道2的第一连通部位13的距离为0.1mm-1cm，优选0.3mm-5mm，进一步优选为0.5mm-2mm，所述孔7、8用于容纳另外设置的融合电极的正负两极201、202，本领域技术人员可以根据芯片设计需求在上述范围内设置孔7、8位置。加载在所述融合电极上的电压频率为0-20000Hz，优选1000-10000Hz，所述电极电压为1-5000V，优选500-1000V。当所述融合电极连通电源，产生电场作用在第一连通部位处的液滴处，其目的是促进液滴融合。所述电场可以是交变电场或恒定电场中的任意，电极施加的电压为1-5000V，优选500-1000V。
另外，在本发明中，对于孔7、8的具体形状和孔的大小没有限定，只要可以用来放置融合电极即可。其中融合电极可以参考上述对于本发明的装置中描述的融合电极。
在本发明的一种实施方式中，第一管道中容纳从第四管道中进入的待融合液滴。启动第一动力源，打开第一阀，在第一动力源的驱动下，推动融合液滴停留在第一连通部位正下方，关闭第一动力源，停止驱动，启动第二动力源通过第三连接口向管道内提供驱动力，从而推动第三连接口的液体定量进入液滴中，完成液滴融合。在液滴融合过程中，融合电极连通电源，产生电场作用在第一连通部位处促进液滴融合。
进一步，所述微流控芯片中可以存在多个待融合液滴，例如待融合液滴a1、待融合液滴a2、待融合液滴a3、…、待融合液滴an。通过上述方法依次进行液滴融合。
如图1所示，一种微流控芯片包括基板，以及形成在所述基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道，其中，所述第一管道两端分别包括第一连接口和第二连接口，第二管道，其一端包括第三连接口，另一端与第一管道连通，第三管道，其一端包括第四连接口，另一端与第一管道连通，所述第四管道上游分支为3个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c；第四管道a、第四管道b、第四管道c的一端分别与第五连接口41、41’、41’’相连接。
第五连接口41、41’、41’’ 分别接不同的动力源和阀，用于实现油相和水相进样。例如第五连接口41通过毛细管分别与第三动力源和第四阀连通，第五连接口41’通过毛细管分别与第四动力源和第五阀连通，第五连接口41’’通过毛细管分别与第五动力源和第六阀连通。使用之前，所有的管道都是充满油相，优选油相为矿物油做填充介质，因此，与第五连接口41、41’、41’’连接的管道中都充满矿物油。使用时，第五连接口41’、41’’通过对应连接毛细管和动力源接新鲜的基础培养液、含有化学因子的基础培养液、基质反应液等等。进一步例如，第五连接口41’连接新鲜的基础培养液，第五连接口41’’连接含有培养因子x的基础培养液。打开第一阀，分别启动第四动力源、第五动力源，让第四管道b、第四管道c中充满对应的培养液。启动第四动力源同时打开第一阀，当第四管道b中的基础培养液经过第四连通部位定量进入第四管道主管道时，关闭第四动力源，启动第三动力源，此时在第四连通部位处形成油包水的基础培养液的液滴p；液滴p进一步在第三动力源的驱动下，到达第五连通部位正下方，关闭第三动力源，启动第五动力源将含有培养因子x的基础培养液注入液滴p中，形成含有培养因子x的培养基液滴p’。培养因子x作为单一因素或单因素，通过相对应的动力源即第五动力源控制注入液体的流速和流量，改变培养因子的进入量，从而控制培养因子x的浓度，形成不同浓度梯度，实现单因素不同浓度培养液的形成。
本发明中，承接上述形成不同浓度培养因子的培养基液滴p’的实施方式，培养基液滴p’流动到连续弯曲管道处，通过弯道特殊的形状与结构，有效促进不同培养因子的缓冲与混合。
在一具体实施方式中，所述第四管道上游分支为4个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d，其一端分别与第五连接口41、41’、41’’、41’’’相连接。在上述第四管道3个上游分支的结构基础上，增加第四管道d及其第五连接口41’’’，其通过毛细管连接含有培养因子y的基础培养液，当含有培养因子x的培养基液滴p’到达第六连通部位处，驱动与第五连接口41’’’连接的第六动力源，定量控制培养因子y的基础培养液进入培养基液滴p’中形成含有培养因子x和培养因子y的培养液液滴p’’。本实施方式中，既可以通过单独控制培养因子x或者培养因子y的进入量来实现单因素不同浓度培养液的控制，也可通过分别控制培养因子x和培养因子y的进入量同时实现两因素不同浓度培养液的形成。
在一具体实施方式中，如图2所示，所述第四管道上游分支为5个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e；第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e的一端分别与第五连接口41、41’、41’’、41’’’、41’’’’相连接。
第五连接口41、41’、41’’、41’’’、41’’’’分别接不同的动力源和阀，用于实现油相和水相进样。例如，同上述单因素不同浓度培养液的形成，以及两因素不同浓度培养液的形成，在芯片刚开始使用之前，与上述管道连接口连接的都是油相进样系统，将其管道中充满油相介质，使用时第五连接口41’、41’’、41’’’、41’’’’可以接新鲜培养液、化学因子、基质反应液等等。进一步例如第五连接口41’连接新鲜培养基，在第四连通部位形成油包水的培养基液滴p，第五连接口41’’、41’’’、41’’’’分别连接培养因子x、培养因子y、培养因子z，其分别在第五连通部位、第六连通部位、第七连通部位与管道中的油包水的培养基液滴p融合，最终形成新的含有不同培养因子和/或不同浓度的培养因子的新培养基液滴p’’’或称液滴a。不同培养因子或不同浓度的培养因子是通过相对应的动力源控制其进入量来实现的。含有不同培养因子和/或不同浓度的培养因子的培养基液滴p’’’ 或液滴a在连续弯曲管道处，有效促进不同培养因子的缓冲与混合。本实施方式中，通过第五连接口41、41’、41’’、41’’’、41’’’’连接的动力源来实现三因素多水平微生物培养液的微体系自动配制。当然，本领域技术人员，可以根据第四管道更多的分支及连接口，实现多个因素多水平的微生物培养液的配制，从而实现多因素多水平微生物的培养。
完成不同因素不同水平培养基的配置后，所形成的液滴p’’’或液滴a通过第三动力源的驱动直接进入第一管道中，或者在第三连通部位经过液滴切割进行多个平行的液滴进入第一管道中。在本发明中，所形成的液滴p’’’或液滴a可以为一个液滴，也可以为数个液滴，如液滴a1、液滴a2、…、液滴an，根据培养需要制备液滴及其数量。当所有液滴进入第一管道中时，其液滴为待融合的液滴，在第一动力源的驱动下，依次达到第一连通部位正下方，关闭第一动力源，由第二管道连接的第二动力源驱动其连接的菌液分别依次进入液滴a1、液滴a2、…、液滴an中并完成液滴融合。在液滴融合过程中，融合电极连通电源，产生电场作用促进融合。在此操作过程中第一检测窗9对液滴进行识别，利于融合操作控制。
实施例
第一管道、第二管道、第三管道、第四管道为形成在芯片基板内的管道，芯片基板尺寸为3cm*5cm*4mm(长*宽*厚)，芯片基板所用材质为PMMA，形成于芯片基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道为横截面为正方形的管道，其横截面积为1mm2(其边长为1mm)，第一管道分别与第二管道、第三管道、第四管道相连通，第二管道和第一管道的第一连通部位位于第三管道和第一管道的第二连通部位，及第四管道和第一管道的第三连通部位的中间，其第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离为1.5 mm。管道中充满了油性介质。第四管道上游分支为5个，分别为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e，平行排列且相互间的间距为1.5mm。
第一管道的第一连接口连接有注射泵A，第二连接口连接有旋转第一阀；第二管道的第三连接口连接有注射泵B和旋转第二阀，第三管道的第四连接口连接有旋转第三阀，第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e分别连接注射泵C和旋转第四阀、注射泵D和旋转第五阀、注射泵E和旋转第六阀、注射泵F和旋转第七阀、注射泵G和旋转第八阀。管道和注射泵、旋转阀通过毛细管连接，毛细管内径为1.0 mm、材质为聚四氟乙烯。
在本实施例中，使用的注射泵A、注射泵B、注射泵C、注射泵D、注射泵E、注射泵F、注射泵G均为工业注射泵，注射泵所带阀头为三通阀，购买自河北保定兰格恒流泵有限公司的工业注射泵MSP1-C2。
旋转第一阀、旋转第二阀、旋转第三阀、旋转第四阀、旋转第五阀、旋转第六阀、旋转第七阀、旋转第八阀均为购买自南京润泽流体控制设备有限公司Mrv-01高压二通阀。
本发明芯片在使用前，管道先是中充满有油相，然后第五连接口分别连接好油相、培养基、各种培养因子溶液，并使第四管道上游分支管道中充满对应液体，其中，介质油相为矿物油，注射泵C用于驱动油相，注射泵D用于驱动充满10g/L胰化蛋白胨、10g/L酵母提取液的培养液（简称“初始培养液”），注射泵E、注射泵F、注射泵G分别用于驱动培养因子X、培养因子Y、培养因子Z的初始培养液；本实施例中，培养因子X、培养因子Y、培养因子Z分别为50g/LNaCl、25mol/LNaOH、250mg/L氨苄青霉素。
启动注射泵C同时打开第一阀，驱动第四管道a中的油相进入管道，关闭注射泵C同时启动注射泵D，第一阀开启状态不变，第四管道b中“初始培养液”注入4µL到第四连通部位下方时，立即关闭注射泵D，启动注射泵C，此时4µL“初始培养液”在第四连通部位下方形成油包培养液的液滴p；在注射泵C的驱动下，液滴p运动达到第五连通部位正下方，关闭注射泵C同时启动注射泵E，驱动第四管道c中的50g/LNaCl的“初始培养液” 2µL进入管道液滴p中，关闭注射泵E，启动注射泵C，此时形成液滴p’；在注射泵C的驱动下，液滴p’运动达到第六连通部位正下方，关闭注射泵C同时启动注射泵F，驱动第四管道d中的25mol/LNaOH的“初始培养液” 2µL进入管道液滴p’中，立即关闭注射泵F，启动注射泵C，此时形成液滴p’’； 在注射泵C的驱动下，液滴p’’运动达到第七连通部位正下方，关闭注射泵C同时启动注射泵G，驱动第四管道e中的250mg/L氨苄青霉素的“初始培养液” 2µL进入管道液滴p’’中，立即关闭注射泵G，启动注射泵C，此时形成液滴p’’’或称液滴a。此时液滴中p’’’或液滴a为10µL含有10g/L胰化蛋白胨、10g/L酵母提取液、10g/LNaCl、5mol/LNaOH、50mg/L氨苄青霉素的培养液。
进一步通过注射泵C推动液滴a经过连续弯曲管道达到第三连通部位，通过“掐头去尾中间分”操作进行液滴切割，其中，形成中间平行液滴的3个体积为2µL的液滴a1、液滴a2、液滴a3，掐头去尾的液体大小为2µL左右并通过第三管道排出。在液滴a1、液滴a2、液滴a3形成过程中，第一检测窗9在第一管道上，位于第三连通部位与第一连接口中间，所述第一检测窗9距离第三连通部位2mm，对其进行操作控制，当液滴a1到达第一检测窗9时，进行液滴a2的切割操作，当液滴a2到达第一检测窗9时，进行液滴a3的切割操作。
打开旋转第一阀，继续驱动注射泵A，推动液滴a1、液滴a2、液滴a3向第二连接口方向运动。当液滴a1达到第一连通部位正下方，注射泵A停止驱动，开通注射泵B提供驱动力，从而推动与第二管道连接的菌液b进入液滴a1中，在注射泵B提供驱动力的同时，融合电极连通500V电源，产生电场促进液滴融合。实施例中菌液b为大肠杆菌菌液。循环重复上述步骤，完成液滴a2、液滴a3的融合操作，从而实现3个平行浓度的大肠杆菌接种培养。第一检测窗9 用作液滴识别点，识别液滴的位点；第二检测窗10 液滴检测点，用于菌浓度OD 检测。
工业实用性
本发明的用于微生物培养与检测的微流控芯片可以在微流控芯片领域制造并使用。本发明适用于通过多因素多水平满足微生物培养生长条件，适于适应性进化、耐药机理研究和培养优化以及微生物检测。
尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。
本申请接受各种修改和可替换的形式，具体的实施方式已经在附图中借助于实施例来显示并且已经在本申请详细描述。但是，本申请不意在受限于公开的特定形式。相反，本申请意在包括本申请范围内的所有修改形式、等价物、和可替换物，本申请的范围由所附权利要求及其法律等效物限定。
在本发明中列举的数值范围均包括该数值范围的两个端点的数据，也包括该数值范围中具体的每一个数值，并且该数值可以与端点任意组合组成新的小范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片，其包括：
基板；以及形成在所述基板内的第一管道、第二管道、第三管道、第四管道，
其中，所述第一管道两端分别包括第一连接口和第二连接口，
第二管道，其一端包括第三连接口，另一端与第一管道连通，
第三管道，其一端包括第四连接口，另一端与第一管道连通，
第四管道，其一端包括其上游分支为3个及以上的管道及第五连接口，另一端通过一段共同的管道与第一管道连通，所述一段共同的管道包括连续弯曲管道；
第二管道和第一管道的第一连通部位位于第三管道和第一管道的第二连通部位，及第四管道和第一管道的第三连通部位的中间。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述第四管道上游分支的管道相互平行排列，其相互间的间距为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其中，所述第四管道上游分支为3个、4个或5个，即3个分支管道为第四管道a、第四管道b、第四管道c，4个分支管道为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d，5个分支管道为第四管道a、第四管道b、第四管道c、第四管道d、第四管道e。
4.根据权利要1所述的微流控芯片，其中，所述第四管道上游分支与第一管道连通的连续弯曲管道，为P型、S型、U型、折线型、波浪型中的一种或多种结构组成。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其中，所述连续弯曲管道容纳液体的总体积为4～100µL，优选4～50µL，优选4～20µL，优选6～12µL，进一步优选8～10µL。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离为500µm～2000µm，优选750µm～1800µm，优选为1000µm～1500µm；进一步优选第一连通部位分别与第二连通部位、第三连通部位之间的距离相同。
7.根据权利要求1～6中任一所述的微流控芯片，其中，所述微流控芯片还包括形成在第一管道上的第一检测窗和第二检测窗，以及与第一管道、第二管道、第三管道、第四管道密封连接的毛细管。
8.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述基板和第一管道、第二管道、第三管道和第四管道由自玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)形成，优选由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)形成。
9.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述第一管道，第二管道，第三管道以及第四管道的横截面积的范围为2.5×10-3mm2~4mm2，优选为0.01~3 mm2，进一步优选为0.1~2.5mm2，进一步优选为0.25~1mm2，进一步优选所述第一管道、第二管道，第三管道以及第四管道的横截面积相同。
10.根据权利要求1所述的微流控芯片，其中，所述基板上包括2个孔，所述孔与所述第一管道和第二管道的第一连通部位的距离为0.1mm~1cm，优选0.3mm~5mm，进一步优选为0.5mm~2mm，用于容纳融合电极。
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