CN112345745A - 无标记血管紧张素ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法及应用，具体地说是涉及一种血管紧张素Ⅱ受体的亚型(AT1受体)，用无标记细胞动态质量重置技术在不同细胞系上进行模型建立，筛选和应用。本发明所述AT1受体模型在内源性表达AT1受体的A549和Hep G2细胞系上分别构建。该方法具有接近体内真实环境、无标记、实时监测、通量高、操作简单的特点，可以筛选具有AT1受体活性的配体，包括激动剂和拮抗剂，以及评价AT1受体拮抗剂的结合特点。

Description

无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法及应用
技术领域
本发明属于药理学研究及药物筛选研究领域，具体涉及血管紧张素Ⅱ受体的亚型，即AT1受体的在内源性细胞上的模型建立，本发明还涉及AT1受体的配体筛选方法和分析及应用。
背景技术
血管紧张素Ⅱ受体(AT1)属于G蛋白偶联受体中的视紫红质A类家族，主要分布于血管、肾脏、心脏、肾上腺和脑组织中。AT1受体主要通过与内源性配体血管紧张素Ⅱ作用，引起血管收缩、醛固酮和精氨酸加压素的释放、盐和水的重吸收、细胞的增殖和迁移等一系列反应，从而维持血压稳定等。而AT1受体的过度激活会导致血压升高和心肌肥厚。在最近的研究中，AT1受体系统对于血管重塑、动脉粥样硬化、心脏疾病和癌症等也有相关调节作用。
AT1受体的抑制剂是目前最常用的六大类降压药之一，有氯沙坦、缬沙坦、伊贝沙坦、替米沙坦等，它们选择性地作用于AT1受体，并不影响其它激素受体或心血管中重要的离子通道的功能，具有长效、高效、低毒等特点。此外，临床研究表明AT1受体抑制剂不仅能够有效降压，还可改善高血压并发症，逆转左室肥厚，保护肾功能，治疗心力衰竭等。对于高血压合并糖调节受损患者，AT1受体抑制剂氯沙坦较左旋氨氯地平可降低患者进展为2型糖尿病的风险。因此寻找并发现AT1受体抑制剂是新药开发人员的持续关注焦点。特别是新结构的AT1受体抑制剂的发现，将会打破非肽类AT1受体抑制剂结构单一的现状，为临床用药提供新鲜高效的候选药物。研究和发现AT1受体的配体在生命医学研究和药物发展上都有重要的意义(Burnier,M.,&Brunner,H.R.(2000).Angiotensin II receptorantagonists.Lancet,355(9204),637-645；Burnier,M.,&Maillard,M.(2001).Thecomparative pharmacology of angiotensin II receptor antagonists.BloodPressure,10,6-11；Shin-icbiro Miura,S.S.K.a.K.S.(2011).Angiotensin II type1receptor blockers class effects.Journal of the Renin-Angiotensin-AldosteroneSystem,12(1).)。
对于GPCR受体的模型构建和配体筛选方法，通常建立于转染细胞模型上。而对于内源性细胞，更多用于检测化合物对于细胞内功能因子，如白细胞介素，NF-κB等的影响。DMR技术的特点在于，可以使用内源性细胞对GPCR受体进行模型构建和配体筛选。DMR技术的原理是，将探针分子或待测分子与细胞受体结合后引起的细胞底部的质量变化，通过远程波导光栅芯片转化成光信号输出，从而在一定时间内实时监测信号升降，判断探针分子或待测分子与受体的结合情况。因此，在内源性细胞上得到的DMR信号可以覆盖更广泛的信号通路，也使得检测环境更接近生物体的真实环境。但是，由于受体在每个细胞内的表达量和功能状态都不相同，使得对于特定GPCR在DMR技术平台上的模型构建是需要研究的。本发明技术在以往研究的基础上，通过多种技术手段，发现A549细胞系和Hep G2细胞系都可以表达功能性的、可被DMR技术检测分析的AT1受体，能够用于AT1受体的模型构建和应用。
发明内容
本发明涉及GPCR中的血管紧张素Ⅱ的AT1受体的无标记配体细胞筛选模型的建立和应用，目的之一是采用无标记细胞整合药理学技术建立AT1受体的无标记配体细胞筛选模型；目的之二是将所建立的模型用于化合物库的受体活性筛选，为发现结构新颖、活性高、选择性强的AT1受体的激动剂或拮抗剂，用于后续的药物开发等；目的之三是用同一种技术多角度评价AT1受体拮抗剂，有利于对后续发现的新型拮抗剂进行分析和比较。
本发明的技术方案为：
由内源性表达AT1受体的细胞作为载体，将该细胞置于光学生物传感器微孔板中进行培养，培养结束后将其放置于Epic仪器的信号检测位置，并在其中加入AT1受体激动剂或拮抗剂或待测化合物，对其进行实时响应信号的检测，获得实时响应信号，通过对实时响应信号的处理结果来表征和评判AT1受体配体的药理学特性，从而实现无标记AT1受体细胞模型构建和筛选。
一种AT1受体分别在不同细胞系上，用无标记细胞动态质量重置技术进行模型建立和配体筛选系统构建，具体地，AT1受体模型在内源性表达AT1受体的A549或Hep G2细胞系上分别构建。
所述AT1受体模型由如下方法构建得到：
A.培养A549或Hep G2细胞；
B.收获步骤A所培养的A549或Hep G2细胞，接种到Epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
C.吸弃步骤B微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的HBSS缓冲液，置于Epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
D.在Epic仪器系统上建立基线，在微孔板内加入一定量的AT1受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤S1；
E.重新在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板内加入AT1受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤S2；
F.以S1中的探针分子剂量与本身S1的DMR信号或者S2中AT1受体激动剂引起DMR响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在AT1受体上的药理学参数。完成AT1受体模型在A549或Hep G2细胞系上的构建。
所述AT1受体筛选系统由如下方法构建得到：
A.培养A549或Hep G2细胞；
B.收获步骤A所培养的A549或Hep G2细胞，接种到Epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
C.吸弃步骤B微孔板中培养细胞的培养基，加入一定体积的HBSS缓冲液，置于Epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
D.在Epic仪器系统上建立基线，在微孔板内加入一定量的待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤S1；
E.重新在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板内加入所需浓度的AT1受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤S2；
F.以S1中待测化合物剂量与本身S1的DMR信号或者S2中AT1受体激动剂引起DMR响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在AT1受体上的药理学参数。完成待测化合物在AT1受体模型上的筛选。
所述AT1受体激动剂为下列之一：血管紧张素Ⅱ、DAA-I乙酸盐。所用的AT1受体拮抗剂为下列之一:阿奇沙坦，坎地沙坦，EMD 66684，伊普沙坦，EXP 3174，厄贝沙坦，洛沙坦，奥美沙坦酯，替米沙坦,缬沙坦和ZD 7155。
步骤S1所用的AT1受体激动剂浓度为0-1000nM。步骤S2所用的AT1受体激动剂浓度为其在该细胞上获得的EC50值～EC100值,其中血管紧张素Ⅱ的所用浓度是4-160nM。
步骤S1的处理时间为0-120分钟，步骤S2的处理时间为3-120分。
本发明无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法在筛选AT1受体或其信号转导途径中的激动剂或拮抗剂的应用和在检测AT1受体的配体与AT1受体的结合活性中的应用。
本发明的优势主要有：应用本方法建立的AT1受体的模型和筛选策略，是在内源性表达待测受体的细胞内，具有广泛的下游信号通路，更接近体内的真实环境；同时，应用细胞动态质量重置技术，具有无标记、实时监测、通量高、操作简单的特点。将该技术发明可用于化合物库的受体活性筛选，也可以用于发现受体下游信号通路的激动剂和拮抗剂等。另外，该方法的扩展可以对受体的配体进行多种药理学参数的测定和解析。
说明书附图
图1为AT1受体在A549细胞系上的表征：(A)血管紧张素Ⅱ在A549细胞系上的实时DMR曲线；(B)80nM血管紧张素Ⅱ在A549细胞系上的脱敏DMR曲线；(C)80nM血管紧张素Ⅱ对梯度坎地沙坦在A549细胞系上的脱敏DMR曲线；(D)血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦在A549细胞系上的量效关系曲线。
图2为AT1受体在Hep G2细胞系上的表征：(A)血管紧张素Ⅱ在Hep G2细胞系上的实时DMR曲线；(B)80nM血管紧张素Ⅱ在Hep G2细胞系上的脱敏DMR曲线；(C)80nM血管紧张素Ⅱ对梯度坎地沙坦在Hep G2细胞系上的脱敏DMR曲线；(D)血管紧张素Ⅱ和坎地沙坦在Hep G2细胞系上的量效关系曲线。
图3为70个待测化合物对血管紧张素Ⅱ信号的影响百分比。
图4为11个拮抗剂在AT1受体上的量效关系曲线(包括预处理0min、30min和60min)：(A)阿奇沙坦，(B)坎地沙坦，(C)EMD 66684，(D)伊普沙坦，(E)EXP 3174，(F)厄贝沙坦，(G)洛沙坦，(H)奥美沙坦酯，(I)替米沙坦，(J)缬沙坦和(K)ZD 7155。
图5为11个拮抗剂与梯度的血管紧张素Ⅱ共处理，得到拮抗剂在不同浓度下对血管紧张素Ⅱ剂量曲线的影响：(A)阿奇沙坦，(B)坎地沙坦，(C)EMD 66684，(D)伊普沙坦，(E)EXP 3174，(F)厄贝沙坦，(G)洛沙坦，(H)奥美沙坦酯，(I)替米沙坦，(J)缬沙坦和(K)ZD7155。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得；人非小细胞肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系Hep G2均购于中国科学院上海细胞库，血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ)购于上海吉尔生化有限公司，坎地沙坦(candesartan)、奥美沙坦酯(olmesartan medoxomil)、EXP 3174、EMD 66684和ZD 7155购于Tocris生物科技公司，阿奇沙坦(azilsartan)、伊普沙坦(eprosartan mesylate)、厄贝沙坦(irbesartan)、洛沙坦(losartan potassium)、替米沙坦(telmisartan)和缬沙坦(valsartan)购于大连美仑生物技术有限公司，
Figure BDA0002158437310000051
384孔生物感应器微型板购自Corning公司，检测平台为康宁第三代
Figure BDA0002158437310000052
成像仪。
实施例1
AT1受体在A549细胞系上的模型构建
将A549细胞接种于Epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约1.8×104个细胞，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μL HBSS缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定，放置于Epic仪器的信号检测位置。在Epic仪器系统上建立2min的基线后，加入梯度的AT1受体激动剂(如血管紧张素Ⅱ，从终浓度160nM起步，1/2倍递减至0.020nM，共14个浓度点)或拮抗剂(如坎地沙坦，其中坎地沙坦从终浓度1nM起步，1/2倍递减至0.122pM，共14个浓度点)，每孔10μL，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤S1。在Epic仪器系统上重新建立基线，每孔加入终浓度为80nM的血管紧张素Ⅱ(10μL)，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤S2。
使用Imager Beta v3.7软件将Epic仪器所得信号响应原始文件转化成数据导出，用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，得到激动剂的DMR信号(图1A)、80nM血管紧张素Ⅱ脱敏的DMR信号(图1B)和拮抗剂的拮抗信号(图1C)，EC50和IC50值的计算中，使用数据来自DMR信号响应的最高点对应的数值(图1D)。
经过计算，在A549细胞系上，血管紧张素Ⅱ的EC50值为4.13±0.17nM，IC50值为2.87±0.18nM。坎地沙坦的IC50值为0.0407±0.0026nM。
实施例2
AT1受体在Hep G2细胞系上的模型构建
将Hep G2细胞接种于Epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约1.8×104个，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μL HBSS缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定，放置于Epic仪器的信号检测位置。在Epic仪器系统上建立2min的基线后，加入梯度的AT1受体激动剂(如血管紧张素Ⅱ，从终浓度160nM，1/2倍递减至0.020nM，共14个浓度点)或拮抗剂(如坎地沙坦，从终浓度4nM起步，1/2倍递减至0.488pM，共14个浓度点)，每孔10μL，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤1。在Epic仪器系统上重新建立基线，每孔加入终浓度为80nM的血管紧张素Ⅱ(10μL)，继续监测细胞响应信号1h，记为步骤2。
使用Imager Beta v3.7软件将所得信号响应原始数据转化成数据导出，用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，得到激动剂的DMR信号(图2A)、80nM血管紧张素Ⅱ脱敏的DMR信号(图2B)和拮抗剂的拮抗信号(图2C)，EC50和IC50值的计算中，使用数据来自DMR信号响应的最高点对应的数值(图2D)。
经过计算，在Hep G2细胞系上，血管紧张素Ⅱ的EC50值为4.76±0.26nM，IC50值为2.86±0.29nM。坎地沙坦的IC50值为0.076±0.003nM。
实施例3
AT1受体的配体筛选
将Hep G2细胞接种于Epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约1.8×104个，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μL HBSS缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定，放置于Epic仪器的信号检测位置。在Epic仪器系统上建立2min的基线后，加入终浓度100μM或50μM的待测化合物，每孔10μL，处理60min，记为S1。重新在Epic仪器系统上建立基线，每孔加入终浓度为80nM的血管紧张素Ⅱ(10μL)，监测细胞响应信号1h，得到待测化合物对激动剂血管紧张素Ⅱ的信号影响，记为S2。
使用Imager Beta v3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用MicrosoftExcel 2010和GraphPad Prism 6软件对导出数据进行处理，得到待测化合物对血管紧张素Ⅱ的信号影响图(图3)。结果显示，显示化合物编号的是AT1的激动剂或者拮抗剂。
实施例4
11个AT1受体拮抗剂在Hep G2细胞系上的拮抗活性测定
将Hep G2细胞接种于Epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约1.8×104个，培养24小时后，吸弃培养基，加入孵育好的30μL HBSS缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定，放置于Epic仪器的信号检测位置。在Epic仪器系统上建立2min的基线后，加入梯度的AT1受体拮抗剂(如坎地沙坦、奥美沙坦酯、阿奇沙坦、洛沙坦、替米沙坦和缬沙坦等)，每孔10μL，处理0min(即拮抗剂和激动剂同时加入)、30min或60min，记为S1。重新在Epic仪器系统上建立基线，每孔加入终浓度为80nM的血管紧张素Ⅱ(10μL)，监测细胞响应信号1h，得到拮抗剂在不同浓度下对激动剂内皮素-1的信号影响，记为S2。
使用Imager Beta v3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用MicrosoftExcel 2010和GraphPad Prism 6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，使用数据来自DMR信号响应的最高点对应的数值对拮抗剂的IC50值进行计算(图4)。11个化合物得到多个处理时间下的IC50值列于表1。
表1，11个AT1受体抑制剂在不同预处理时间下的IC50值
Figure BDA0002158437310000071
实施例5
11个AT1受体抑制剂与血管紧张素Ⅱ的竞争结合
将Hep G2细胞接种于Epic光学生物传感器384微孔板中，每孔约1.8×104个，培养24小时后，换无血清培养基将细胞饥饿处理24h。吸弃培养基，加入孵育好的30μL HBSS缓冲液，静置1小时待细胞状态稳定，放置于Epic仪器的信号检测位置。在Epic仪器系统上建立2min的基线后，加入等浓度的AT1受体拮抗剂(如坎地沙坦、奥美沙坦酯、阿奇沙坦、洛沙坦、替米沙坦和缬沙坦等)与梯度的血管紧张素Ⅱ，每孔10μL，处理60min，记为S1。
使用Imager Beta v3.7软件将所得信号响应转化成数据导出，用MicrosoftExcel 2010和GraphPad Prism 6软件对导出数据进行处理。经过空白校正后，使用数据来自DMR信号响应的最高点对应的数值对激动剂的EC50值进行计算(图5)。
计算结果显示，在Hep G2细胞系上，11个AT1受体拮抗剂使得血管紧张素Ⅱ的剂量曲线发生移动，但最大值不变。

Claims (9)

1.一种无标记血管紧张素Ⅱ受体细胞模型构建和筛选方法，其特征在于：由内源性表达AT1受体的细胞作为载体，将该细胞置于光学生物传感器微孔板中进行培养，培养结束后将其放置于Epic仪器的信号检测位置，并在其中加入AT1受体激动剂或拮抗剂或待测化合物，对其进行实时响应信号的检测，获得实时响应信号，通过对实时响应信号的处理结果来表征和评判AT1受体配体的药理学特性，从而实现无标记AT1受体细胞模型构建和筛选。
2.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以A549或Hep G2细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立AT1受体模型；具体AT1受体模型由如下方法构建得到：
A.培养A549或Hep G2细胞；
B.收获步骤A所培养的A549或Hep G2细胞，接种到Epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
C.吸弃步骤B微孔板中培养细胞的培养基，加入HBSS缓冲液，置于Epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
D.在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板内加入AT1受体激动剂或拮抗剂，继续监测细胞响应信号指定时间，记为步骤S1；
E.重新在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板里加入AT1受体激动剂继续监测到指定时间，记为步骤S2；
F.以S1中的探针分子剂量与本身S1的DMR信号或者S2中AT1受体激动剂引起DMR响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算激动剂或拮抗剂在AT1受体上的药理学参数，完成AT1受体模型在A549或Hep G2细胞系上的构建。
3.如权利要求1所述的构建和筛选方法，其特征在于：以A549或Hep G2细胞为载体，通过光学生物传感器微孔板得到实时响应信号，通过对实时响应信号的处理来建立AT1受体筛选系统；具体AT1受体筛选系统由如下方法构建得到：
A.培养A549或Hep G2细胞；
B.收获步骤A所培养的A549或Hep G2细胞，接种到Epic光学生物传感器微孔板中，置于培养箱中培养；
C.吸弃步骤B微孔板中培养细胞的培养基，加入HBSS缓冲液，置于Epic仪器上平衡孵育至细胞状态稳定；
D.在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板内加入待测化合物，继续监测细胞响应信号到指定时间，记为步骤S1；
E.重新在Epic仪器的系统上建立基线，在微孔板内加入所需浓度的AT1受体激动剂继续监测至指定时间，记为步骤S2；
F.以S1中待测化合物剂量与本身S1的DMR信号或者S2中AT1受体激动剂引起DMR响应信号的对应关系，绘制量效关系曲线，计算待测化合物的在AT1受体上的药理学参数。完成待测化合物在AT1受体模型上的筛选。
4.如权利要求2或3任一所述的构建和筛选方法，其特征在于：所用的AT1受体激动剂为下列之一：血管紧张素Ⅱ、DAA-I乙酸盐；所用的AT1受体拮抗剂为下列之一:阿奇沙坦，坎地沙坦，EMD 66684，伊普沙坦，EXP 3174，厄贝沙坦，洛沙坦，奥美沙坦酯，替米沙坦,缬沙坦和ZD 7155。
5.如权利要求2或3所述的构建和筛选方法，其特征在于：步骤S1所用的AT1受体激动剂浓度为0-1000nM。
6.如权利要求2或3任一所述的构建和筛选方法，其特征在于：步骤S2所用的AT1受体激动剂浓度为其在该细胞上获得的EC50值～EC100值,其中血管紧张素Ⅱ的所用浓度是4-160nM。
7.如权利要求2或3任一所述的构建和筛选方法,其特征在于:步骤S1的处理时间为0-120分钟；步骤S2的处理时间为3-120分钟。
8.如权利要求1所述的方法在筛选AT1受体或其信号转导途径中的激动剂或拮抗剂的应用。
9.如权利要求1所述的方法在检测AT1受体的配体与AT1受体的结合活性中的应用。
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