CN112336873A - 用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备方法 - Google Patents

用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备方法。该蛋白型纳米颗粒包括聚酯和具有疏水结构域的蛋白，所述蛋白的疏水结构域与所述聚酯通过疏水相互作用结合；所述蛋白为白蛋白、球蛋白和胞壁蛋白中的至少一种。本发明的蛋白型纳米颗粒具有优异的稳定性和生物相容性，可以通过键合抗IgG‑Fc抗体或抗IgG‑Fc抗体片段制备多特异性抗体递送平台(αFc‑NP)，αFc‑NP能够通过抗原抗体相互作用力稳定、快速、简便地结合多种特异性抗体并增强特异性抗体的治疗效果。

Description

用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备 方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒及其应用、制备方法。
背景技术
单克隆抗体(mAbs)是最大的一类治疗性蛋白，可以用于多种疾病，如肿瘤、炎症以及自身免疫疾病等。大多数治疗性抗体都是通过阻断受体或配体，从而降低某些信号通路的活性达到治疗的目的。从1986年第一个用于阻断CD3治疗肾移植排斥的单克隆抗体被FDA批准后，经过三十多年的快速发展，单抗药物包括治疗性抗体和抗体衍生物(包括抗原结合片段Fab、Fc融合蛋白等)，目前已经成为全球生物制药增长最快的细分领域，诞生了数个年销售额超过50亿美元的“超级重磅药物”。2006年，美国FDA批准了抗血管内皮生长因子(anti-VEGF)的单抗ranibizumab作为一种新型药剂型用于老年渗出性视网膜黄斑变性(AMD)患者的治疗，让高达40％的患者视力有所改善。单克隆抗体药物具有良好的增效性，并且在临床应用中也具有高成功率。临床上已经发展了超过550种抗体，据预测到2020大约有70种单克隆抗体将进入市场治疗各种疾病。2018年全球药品销售中生物技术药达到2618亿美元，单抗药物规模达到1193亿美元。无论从研发规模还是销售规模来说抗体药物都成为生物技术药中最大的一类，开发和优化抗体药物已经成为全球医药发展的必然趋势。
虽然抗体药物具有良好的特异性以及高效性，但是抗体药物的临床应用仍然受到一定的限制。首先，抗体在进入血液循环后半衰期很短，甚至是只有几个小时，治疗过程中给药频率高。这不仅会导致强烈的副作用，而且会造成治疗成本高以及依从性差。另外，抗体分子量较大、结构稳定性差，组织渗透性差，因此将抗体有效地递送至靶组织和细胞成为一个挑战。21世纪初，为了解决异种治疗性抗体在人体内免疫原性高等问题，人源化治疗性抗体被研发批准上市。随后，研究人员为了提高抗体药物临床应用率，多种形式抗体药物被研发批准。一、治疗或成像抗体药物轭合物-将化疗药或放射性同位素与抗体通过化学键连接，增加抗体药物效果。如inotuzumab ozogamicin(anti-CD22)、brentuximab vedotin(anti-CD30)、90Y-ibritumomab tiuxetan(anti-CD20)等；二、抗体片段药物，包括Fab片段、单链可变片段scFv，此种形式可以增加抗体药物的组织渗透，但是体内保留时间较差。如ranibizumab(anti-VEGFA)、brolucizumab(anti-VEGF)等；三、重组以及化学修饰抗体药，包括白蛋白融合抗体、Fc融合蛋白抗体、PEG修饰抗体等，可以显著性降低抗体药物免疫原性、延长半衰期。如Ozoralizumab(anti-TNF×HSA)、alefacept(anti-CD20)、certolizumab pegol(anti-TNF)等；四、双特性抗体即人造的具有两个不同抗原结合位点的抗体分子，如blinatumomab(anti-CD3×CD19)等。五、基于控释系统的抗体药物，包括PLGA微球、水凝胶、脂质体等，延长抗体在体内的作用时间，如PolyActiveTM水凝胶系统释放抗体可以长达6个月。
综上所述，治疗性抗体的优化需要达到以下几个要求：1.减少抗体聚集以及降低免疫原性、增加抗体稳定性，延长体内半衰期；2.增加抗体的主动靶向性，包括靶组织的主动富集等；3.优化生产过程、降低生产成本。
如何实现简单便捷、稳定、生物相容性好的抗体递送系统，在低成本条件下实现体内治疗性抗体的高效递送，尤其是实现多特异性抗体的高效递送，仍有待实现进一步研究突破。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒，该蛋白型纳米颗粒具有优异的稳定性和生物相容性，可以通过键合抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段制备多特异性抗体递送平台(αFc-NP)，αFc-NP能够通过抗原抗体相互作用力稳定、快速、简便地结合多种特异性抗体，具有良好的应用潜能。
具体技术方案如下：
一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒，包括聚酯和具有疏水结构域的蛋白，所述蛋白的疏水结构域与所述聚酯通过疏水相互作用结合；所述蛋白为白蛋白、球蛋白和胞壁蛋白中的至少一种。
本发明的另一目的是提供一种上述的蛋白型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述蛋白与水或水溶液混合，得水相；将所述聚酯与有机溶剂混合，得油相；
(2)将步骤(1)所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
(3)将所述乳剂分离纯化，得蛋白型纳米颗粒。
本发明的另一目的是提供一种上述的蛋白型纳米颗粒在制备多特异性抗体递送平台中的应用。
本发明的另一目的是提供一种多特异性抗体递送平台，由包括上述的蛋白型纳米颗粒经化学键与抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段部分连接而成；
所述抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段的Fab结构域能够与所递送的特异性抗体的Fc结构域非共价结合；所递送的特异性抗体与所述抗Fc段抗体片段能识别的Fc段具有相同的种属来源。
本发明的另一目的是提供上述多特异性抗体递送平台的制备方法，包括以下步骤：
(A)将抗Fc段抗体经氧化剂氧化，得到含醛基抗Fc段抗体；
(B)将步骤(A)所得含醛基抗Fc段抗体与所述蛋白型纳米颗粒反应，所得产物再经还原剂还原。
本发明的另一目的是提供一种上述的蛋白型纳米颗粒或多特异性抗体递送平台在递送多特异性抗体中的应用或在制备多特异性抗体递送系统中的应用。
本发明的再一目的是提供一种多特异性抗体递送系统，包括上述的多特异性抗体递送平台和特异性抗体。
本发明的再一目的是提供一种上述的蛋白型纳米颗粒或多特异性抗体递送平台或多特异性抗体递送系统在制备免疫治疗药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过选择聚酯和特定的具有疏水结构域的蛋白制备用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒，疏水性的聚酯通过疏水相互作用与蛋白的疏水结构域进行缠结组装，具有优异的稳定性，可以在长循环过程中保持完整，进而维持多特异性抗体在蛋白型纳米颗粒表面呈现多价态。蛋白的表面具有亲水结构域，分布着大量的亲水基团(如氨基、羧基和巯基)，可以与抗IgG-Fc抗体键合得到多特异性抗体递送平台(αFc-NP)，进而αFc-NP可以迅速、稳定地、针对性地结合多种特异性抗体并增强特异性抗体的治疗效果。此外，蛋白表面的亲水结构域还有利于αFc-NP在体内分散。
本发明的蛋白型纳米颗粒制备所得αFc-NP是由经FDA批准的高分子聚酯和天然来源的白蛋白组装而成，具有优异的生物相容性。
本发明的αFc-NP有利于特异性抗体的Fab段朝外暴露，从而可以最大程度地保留抗体的功能。
本发明通过αFc-NP强结合多特异性抗体，形成的双层抗体的纳米颗粒具备多价态、多特异性、多功能性的特点，并且可以快速进行不同治疗抗体的联合，以适应目前临床上精准治疗下个性化治疗方案的策略，具有巨大的临床应用潜能。
附图说明
图1.不同种属白蛋白聚酯颗粒的粒径表征；
图2.人血清白蛋白与不同种类脂肪族聚酯的颗粒粒径表征；
图3.人血清白蛋白与不同旋光性聚丙交酯的颗粒粒径表征；
图4.人血清白蛋白与不同LA/GA比例的聚(乙交酯-co-丙交酯)的颗粒粒径表征；
图5.人血清白蛋白与不同端基修饰的左旋聚丙交酯的颗粒粒径表征；
图6.人血清白蛋白与不同分子量的左旋聚丙交酯的颗粒粒径表征；
图7.人血清白蛋白与聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯的颗粒粒径表征；
图8.不同质量比的人血清白蛋白脂肪族聚酯的颗粒粒径表征；
图9.不同质量比的人血清白蛋白脂肪族聚酯的颗粒的透射电镜图片；
图10.不同质量比的人血清白蛋白脂肪族聚酯的颗粒的扫描电镜图片；
图11.高效液相色谱表征颗粒内人血清白蛋白和脂肪族聚酯的实际比例；
图12.白蛋白脂肪族聚酯颗粒离心-重悬所得组合物的血清稳定性；
图13.白蛋白脂肪族聚酯(不同分子量)颗粒离心-重悬所得组合物的蛋白释放行为表征；
图14.高效液相色谱建立FITC-HSA标准曲线；
图15.白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合αFc抗体的表征；
图16.白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合抗体亲和力的测定；
图17.激光共聚焦观察αFc-NP(αPD-1/αPD-L1)促进肿瘤细胞和T细胞相互作用观察图；
图18.H 33342释放法检测αFc-NP(αPD-1/αPD-L1)促进T细胞杀伤肿瘤细胞；
图19.αFc-NP的制备和应用示意图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本实施方式提供一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒，包括聚酯和具有疏水结构域的蛋白，所述蛋白的疏水结构域与所述聚酯通过疏水相互作用结合；所述蛋白为白蛋白、球蛋白和胞壁蛋白中的至少一种。
所述蛋白与所递送的特异性抗体的受者具有相同的种属。所述特异性抗体的受者是指接受所述特异性抗体的治疗对象。
在其中一些实施例中，所述白蛋白可以为血清白蛋白或鸡卵清蛋白(ova)；血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，天然来源的白蛋白具有低免疫原性和优良的组织相容性，且白蛋白结合蛋白在许多肿瘤和肿瘤新生血管内皮细胞上均有高效表达，因此白蛋白载体可以介导药物靶向肿瘤。从化学角度分析，白蛋白表面亲水区域暴露大量可修饰的基团，如氨基、羧基和巯基，同时表面具有多个疏水结构域(疏水结合位点)，该疏水结构域可以与疏水性的聚酯进行组装；关键是，发明人发现白蛋白的亲水区域经化学键与抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段连接得到特异性抗体递送平台αFc-NP，从而可以实现快速、稳定地通过分子间相互作用结合特异性抗体。
在其中一些实施例中，所述白蛋白为血清白蛋白，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白或人血清白蛋白，在实际临床使用时，如果用于人体治疗，则选择使用人血清白蛋白，即与所递送抗体的治疗对象的种属相同即可，避免受者的排斥反应。
在其中一些实施例中，所述球蛋白可以为免疫球蛋白(IgG)。
在其中一些实施例中，所述胞壁蛋白可以为蛋白A(Protein A)和蛋白G(ProteinG)。
在其中一些实施例中，所述聚酯为脂肪族聚酯或聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯。所述脂肪族聚酯为聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)和聚己内酯(PCL)中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯为聚乙二醇修饰的聚丙交酯(PEG-PLA)、聚乙二醇修饰的聚乙交酯(PEG-PGA)、聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)(PEG-PLGA)和聚乙二醇修饰的聚己内酯(PEG-PCL)中的至少一种。在其中一些实施例中，所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯优选为聚乙二醇修饰的聚丙交酯(PEG-PLA)，其具有更强的疏水性，且降解速度慢。
在其中一些实施例中，所述脂肪族聚酯优选为聚丙交酯；所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯(PLLA)、右旋聚丙交酯(PDLA)或外消旋聚丙交酯(PDLLA)。优选聚丙交酯为左旋聚丙交酯(PLLA)，其具有更强的疏水性，且降解速度慢。
在其中一些实施例中，所述聚丙交酯的端基为酯基、羧基和羟基中的至少一种。优选聚丙交酯的端基为酯基，其具有更强的疏水性。
在其中一些实施例中，所述聚酯的分子量为7200～1100000道尔顿。
在其中一些实施例中，所述的脂肪族聚酯为左旋聚丙交酯，所述左旋聚丙交酯的端基为酯基，分子量范围在7200～1100000道尔顿，优选为100000～600000道尔顿，进一步优选为100000～240000道尔顿，此时聚酯的分子量和粘度合适，蛋白聚酯颗粒的稳定性更好。
在其中一些实施例中，所述聚酯为聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯，其中的聚乙二醇的分子量为4000～6000道尔顿，脂肪族聚酯为聚丙交酯(PLA)、聚(乙交酯-co-丙交酯)(PLGA)和聚己内酯(PCL)中的至少一种，脂肪族聚酯的分子量范围在10000～18000道尔顿。
具体地，所述聚丙交酯的引发剂分别为正十二醇、羟基酸和二醇。
在其中一些实施例中，所述的脂肪族聚酯为聚(乙交酯-co-丙交酯)，其LA/GA的比例范围为95/5～50/50，具体可以为95/5、85/15、75/25、50/50或任意两个具体比例之间的范围。优选LA/GA的比例范围为(75±5)/25，其大分子量的聚合反应容易控制，材料溶解性更好。
在其中一些实施例中，所述脂肪族聚酯与蛋白的重量比为1:0.1～1:30，优选为1:5～25，进一步优选为1:5～15，进一步为1:8～12，进一步优选为1:9～11，还可以为1:0.1，1:0.3，1:0.4，1:0.5，1:0.6，1:0.8，1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9，1:10，1:11，1:12，1:13，1:14，1:15，1:16，1:17，1:18，1:19，1:20，1:21，1:22，1:23，1:24，1:25，1:26，1:27，1:28，1:29，1:30或上述任意两个具体重量比之间的范围。优选地，重量比为1:9～11制备的蛋白型纳米颗粒回收率最高且蛋白具有最大利用率。
在其中一些实施例中，所述蛋白型纳米颗粒的平均粒径为74.8nm～384.2nm。优选地，粒径范围在100nm～200nm，蛋白型纳米颗粒表面可以更高效的结合特异性抗体。
本实施方式还提供一种上述蛋白型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述蛋白与水或水溶液混合，得水相；将所述聚酯与有机溶剂混合，得油相；
(2)将步骤(1)所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
(3)将所述乳剂分离纯化，得蛋白型纳米颗粒。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述蛋白在水相中的质量体积浓度为5～20mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述聚酯在油相中的浓度为1～10mg/ml。
在其中一些实施例中，步骤(1)中，所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯至少一种。更具体地，当聚合物分子量较小(7200～137000道尔顿)时，采用乙酸乙酯或乙酸乙酯-三氯甲烷的混合体系，可以更充分乳化，制备的纳米颗粒粒径较小且更容易控制；当聚合物分子量较大(137000～1100000道尔顿)时，采用三氯甲烷或二氯甲烷-三氯甲烷的混合体系，可以使聚合物溶解充分易于乳化。所述水溶液为氯化钠水溶液。
在其中一些实施例中，上述蛋白型纳米颗粒的制备过程中不含额外的稳定剂。
在其中一些实施例中，步骤(3)中，可以通过离心、切向流透析(通过切向流装置在切向剪切力的作用下透析)和排除色谱(根据纳米颗粒和游离蛋白的分子量大小)中的至少一种方法分离游离的蛋白和纳米颗粒。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，将所述水相和油相制备成水包油的乳剂的方法包括超声乳化或高压均质乳化。
本实施方式还提供一种上述的蛋白型纳米颗粒在制备多特异性抗体递送平台中的应用。
本实施方式还提供一种上述的特异性抗体递送平台，由包括上述的蛋白型纳米颗粒经化学键与抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段部分连接而成；所递送的特异性抗体与所述抗Fc段抗体片段能识别的Fc段具有相同的种属来源，所述抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段的Fab结构域能够与所递送的特异性抗体的Fc结构域非共价结合。
本发明所述多特异性抗体递送平台的抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段是通过抗体-抗原特异性识别的方式高效、便捷地特异性结合(定向、非共价地)多种特异性抗体，简便地实现了抗体的“多价化”和“多特异性化”，能最大程度保留特异性抗体的亲和力(抗原结合能力)。
本发明所述多特异性抗体递送平台具有通用性，不会破坏特异性抗体的结构，克服了传统化学键合固定方式会破坏抗体药物的结构、封闭其抗体识别区、显著影响抗体药物功能、复杂度高、难度高等缺陷。
在其中一些实施例中，所述抗Fc段抗体或抗体片段的Fc段区域具有糖基化修饰。
本实施方式还提供一种上述特异性抗体递送平台的制备方法，包括以下步骤：
(A)将抗IgG-Fc段抗体与氧化剂进行氧化反应，得到含醛基的抗IgG-Fc段抗体；
(B)将步骤(A)所得含醛基的抗IgG-Fc段抗体与上述的蛋白型纳米颗粒反应，所得产物再与还原剂进行还原反应。
在其中一些实施例中，所述氧化剂为高碘酸钠。进一步地，所述氧化反应的时间为1～4小时，进一步为2～3小时。进一步地，氧化反应完后，超滤除去高碘酸钠。进一步地，步骤(A)所述氧化反应在0～8℃避光环境下进行。
在其中一些实施例中，高碘酸钠在反应体系中的浓度低于10mM，可以防止将除Fc段外其他的糖链上的羟基氧化为醛基。
在其中一些实施例中，步骤(A)所述抗IgG-Fc段抗体在反应体系中的浓度为0.8～1.2mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(B)所述还原反应在0～8℃进行。
在其中一些实施例中，所述抗Fc段抗体或抗体片段的Fc段区域具有糖基化修饰；所述Fc段区域的糖基上的邻位羟基经氧化剂氧化为醛基后，与蛋白上的亲水区域的氨基发生席夫碱反应，再将亚胺基还原为甲胺基，得到所述特异性抗体递送平台。
在其中一些实施例中，步骤(B)所述蛋白型纳米颗粒在反应体系中的浓度为0.4～0.6mg/mL。
在其中一些实施例中，步骤(B)所述含醛基抗Fc段抗体在反应体系中的浓度为0.02～0.03mg/mL。
在其中一些实施例中，含醛基抗Fc段抗体与上述的蛋白型纳米颗粒反应的pH为6.7以下，反应的时间为0.5～1.5h。
在其中一些实施例中，步骤(B)所述还原剂为硼氢化钠。进一步地，所述还原反应的pH为8.3以上，反应温度为0～8℃，反应时间为6～10小时。进一步地，所述还原反应过程中保持硼氢化钠的浓度为0.4～0.6mg/mL。
本实施方式还提供一种上述的多特异性抗体递送平台在递送多特异性抗体中的应用或在制备多特异性抗体递送系统中的应用。
本实施方式还提供一种多特异性抗体递送系统包括上述的多特异性抗体递送平台和特异性抗体。
在其中一些实施例中，所述多特异性抗体递送系统包括至少1种特异性抗体，所递送的抗体可以是几种不同的特异性抗体，这样可以得到对两种细胞上的靶点都有很强的亲和力，达到放大的抗肿瘤效应，所述多特异性抗体递送系统可包括至少2种特异性抗体。
在其中一些实施例中，所述特异性抗体为抗免疫细胞抗体和抗肿瘤细胞抗体。其中的抗免疫细胞抗体可以为抗巨噬细胞抗体、抗自然杀伤性(NK)细胞抗体和抗T细胞抗体。本发明的所述多特异性抗体递送系统通过介导免疫细胞和肿瘤细胞相互作用，达到增强肿瘤抑制的效果。
本实施方式还提供一种上述的蛋白型纳米颗粒或多特异性抗体递送平台或多特异性抗体递送系统在制备免疫治疗药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述免疫治疗药物为肿瘤免疫治疗药物或自身免疫疾病治疗药物。
本发明的多价态多特异性抗体递送平台可以方便快捷的实现两个或多个抗体组合，此种特异性抗体载体具有多种潜在的优势，如桥连细胞、桥连受体、靶向异质性肿瘤、靶向多个免疫检查点、靶向免疫检查点和抗原、增加抗体抗原亲和力、延长抗体循环时间等。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例中所用原料来源及处理方法：
人血清白蛋白(HSA)，购于Equitech-Bio公司；
鼠血清白蛋白(MSA)，购于Cusabio公司；
牛血清白蛋白(BSA)，购于合肥志宏泰克生物技术有限公司；
脂肪族聚酯材料具体信息如下，购于济南岱罡生物科技有限公司；
Figure BDA0002617876720000111
Figure BDA0002617876720000121
聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯具体信息如下，购于西安瑞禧生物科技公司；
货号 具体组分 分子量(K)
R-PL1053 PEG5K-PLA16K 5K-16K
R-PL1103 PEG5K-PCL11.8K 5K-11.8K
R-PL1001 PEG5K-PLGA16K 5K-16K
三氯甲烷(氯仿)，二氯甲烷和乙酸乙酯等有机溶剂购于国药集团化学试剂有限公司；
异硫氰酸荧光素(FITC)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司
罗丹明B(RhoB)：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司
山羊抗大鼠IgG-Fc抗体，购于Rockland公司；
高碘酸钠：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
硼氢化钠，氰基硼氢化钠和醋酸硼氢化钠购自Sigma-Aldrich公司；
透射电镜铜网：购自海德创业(北京)生物科技有限公司；
实施例中所用仪器型号及公司：
超声波细胞破碎仪：型号为VCX130，美国Sonics公司；
台式微量冷冻离心机：型号为Microfuge 20R，美国Beckman公司；
纳米粒度及Zeta电位仪：型号为Nano ZSE，英国Malvern公司；
旋转蒸发仪：型号为RV10 digital V数显型，德国IKA公司；
透射电子显微镜：型号为Talos L120C，美国赛默飞世尔科技公司；
扫描电子显微镜：型号为Merlin，德国蔡司公司；
超高效纳升级液相色谱仪(UPLC)：美国Waters公司，型号为ACQUITY UPLC H-Class，配备四元溶剂管理器(QSM)和流通针式进样器设计样品管理器(SM-FTN)；
高效液相色谱仪(HPLC)：美国Waters公司，型号为Alliance 2695；
实施例1、白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒的制备
配制酯封端左旋聚丙交酯(PLLA-COOR-1100K)的氯仿溶液，浓度为5mg/mL，取10mg人血清白蛋白溶解在1mL的0.9％的氯化钠水溶液中，配制1％(w/v)的人血清白蛋白溶液，取200μL的酯封端左旋聚丙交酯氯仿溶液于15mL离心管中，加入1mL的1％(w/v)的人血清白蛋白溶液，利用超声波细胞破碎仪进行乳化；超声功率为130W，振幅为50％，超声5s停2s，总共超声时间为2min，超声结束后用超纯水将乳液洗出离心管，转移至250mL的圆底烧瓶，利用旋转蒸发仪，按照真空度300/120/70/40mbar的顺序依次保持5min去除氯仿，旋蒸结束后收集白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒备用。我们将此颗粒命名为颗粒1。
其他基于不同种类聚酯(不同种类，不同旋光性，不同端基，不同分子量)和不同种属蛋白的纳米颗粒的制备方法参考颗粒1的制备。
实施例2、白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒的纯化方法
方法一(离心法)：取实施例1所得颗粒1，利用台式微量冷冻离心机低速(3000rpm，4℃)条件下离心10min去除未组装的不溶于水的聚酯，将上清转移至新的EP管中高速(15000rpm，4℃)条件下离心60min分离游离的白蛋白和纳米颗粒，去除上清中游离的白蛋白，下层颗粒沉淀重悬于1×PBS中备用。
方法二(透析法)：取实施例1所得颗粒1，采用截留分子量为14000Da的透析袋(上海绿鸟)透析，透析液为1×PBS，透析8倍体积后透析袋内的游离白蛋白被全部置换，取透析袋内白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒备用。
实施例3、白蛋白脂肪族聚酯颗粒的粒径表征
取实施例2中纯化后的颗粒，将浓度稀释到0.1mg/mL(此浓度以蛋白为准，如无特殊说明，本专利内涉及的颗粒浓度均以此定义)，利用纳米粒度及Zeta电位仪，于比色皿中检测纳米颗粒水化直径，对应的纳米颗粒粒径分布图如图1-8所示，其平均分布粒径总结如下：
Figure BDA0002617876720000141
Figure BDA0002617876720000151
实施例4、白蛋白脂肪族聚酯不同比例的纳米颗粒制备
配制酯封端左旋聚丙交酯(PLLA-COOR-240K)的氯仿溶液，浓度为5mg/mL，取10mg人血白蛋白溶解在1mL的0.9％的氯化钠水溶液中，配制1％(w/v)的人血清白蛋白溶液，按照聚酯：白蛋白质量比为1:0.3，1:5，1:10，1:25混合，按照实施例1中的方法制备白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒，并按照实施例2中的离心方法进行纯化，分别命名为颗粒22(1:0.3)，23(1:5)，颗粒24(1:10)和颗粒25(1:25)按照实施例3的方法进行表征，结果如图8所示，白蛋白相对于脂肪族聚酯的比例过高导致纳米颗粒粒径较低，不利于介导特异性抗体的多价态功能；而白蛋白相对于脂肪族聚酯的比例过低会导致不充分组装所得颗粒粒径较大。
实施例5、透射电子显微镜观察白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒离心纯化后形状
按照实施例4的制备方法，制备颗粒22，颗粒23，颗粒24和颗粒25。按照实施例2的方法纯化颗粒后，将纳米颗粒的浓度稀释至0.1mg/mL，取10μL滴加到透射电镜铜网，水分挥发8h后于透射电子显微镜下观察。如图9所示，脂肪族聚酯和白蛋白不同比例的颗粒都是独立存在的圆球状形貌。
实施例6、扫描电子显微镜观察白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒离心纯化后表面形貌
按照实施例4的制备方法，制备脂肪族聚酯和白蛋白不同比例(1:0.3，1:5，1:10，1:25)的颗粒。按照实施例2的方法纯化颗粒后，将纳米颗粒的浓度稀释至0.1mg/mL，取10μL滴加到锡纸上，待水分挥发8h后于扫描电子显微镜下观察。如图10所示，白蛋白比例越高，颗粒表面结构越疏松，而白蛋白比例越低，颗粒越不稳定，扫描电镜下观察到的颗粒陷于崩解释放的蛋白中，这进一步说明优选的聚酯和白蛋白的比例为1:10。
实施例7、白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒中白蛋白和脂肪族聚酯的比例检测
事先用异硫氰酸荧光素(FITC)标记人血清白蛋白，用罗丹明B(RhoB)标记聚己内酯(PCL-COOR)，采用透析法或超滤法除去游离荧光试剂，得到荧光标记的白蛋白(FITC-HSA)和聚己内酯(RhoB-PCL-COOR)。参照实施例5所描述的脂肪族聚酯和白蛋白比例制备得到4个标记有荧光的颗粒NPFITC-HSA/RhoB-PCL-COOR。参照实施例2所描述的离心纯化方法得到纯化后的荧光纳米颗粒，命名为颗粒分别命名为颗粒22’(1:0.3)，颗粒23’(1:5)，颗粒24’(1:10)和颗粒25’(1:25)。
(1)采用HPLC法检测纳米颗粒中白蛋白的含量：将纯化后的颗粒稀释一定的倍数后，用高效液相色谱仪(Waters，Alliance 2695)检测488nm、540nm激发波长下的荧光强度和280nm处紫外吸收值，并且将FITC-HSA梯度稀释作为标准样品，可得到颗粒中的游离白蛋白浓度，根据颗粒的回收率和离心效率即可计算出颗粒中参与组装的白蛋白的含量；
液相条件：①色谱柱型号Ultrahydrogel Column，
Figure BDA0002617876720000161
10μm，7.8mm×300mm；②流动相：1×PBS；③流动相流速：0.6mL/min；④检测器：紫外(280nm)-荧光(488nm、540nm)联用；④进样体积：10μL。
(2)采用萃取法检测纳米颗粒中脂肪族聚酯的含量：取部分纯化后的纳米颗粒用乙腈或氯仿萃取，使用全波长扫描式多功能读数仪(Thermo Scientific VarioskanFlash)检测罗丹明B(激发光为540nm、发射光为590nm)的荧光强度，并且将RhoB-PCL-COOR梯度稀释作为标准样品，可得到纳米颗粒中脂肪族聚酯的浓度，根据纳米颗粒的回收率和离心效率即可计算出纳米颗粒中参与组装的脂肪族聚酯的含量。
白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒回收率检测方法：参照实施例1所描述的方法制备颗粒，采用低速离心去除未组装的不溶于水的聚酯，并将上清冻干，得到粉末的质量记为m1，投入白蛋白和聚酯的总质量记为m0，则颗粒的回收率为
Figure BDA0002617876720000171
白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒离心效率检测方法：事先用罗丹明B(RhoB)标记聚酯，参照实施例1所描述的颗粒制备方法得到聚酯标记有荧光的纳米颗粒，参照实施例2所描述的纳米颗粒纯化方法(离心法)采用低速离心去除未组装的不溶于水的聚酯，将上清继续用高速离心得到上清和沉淀，取少量上清加入五倍体积的DMSO破坏；沉淀用100μL超纯水重悬，取少量颗粒悬液加入200倍体积的DMSO破坏，室温破坏2h，然后用全波长多功能读数仪(Thermo Scientific Varioskan Flash)检测上清和沉淀中罗丹明B(激发光为540nm、发射光为590nm)的荧光强度，用DMSO将RhoB-PCL-COOR梯度稀释作为标准样品，可得到上清和沉淀中聚酯聚合物的相对含量为m1、m2，从而计算出颗粒的离心效率为
Figure BDA0002617876720000172
颗粒22’，颗粒23’，颗粒24’和颗粒25’的离心效率、回收率及白蛋白/脂肪族聚酯聚合物的相对比例如下表所示，液相色谱表征颗粒24’和FITC-HSA如图11所示。由下表中的数据可知，本发明中白蛋白聚酯纳米颗粒制备中优选的脂肪族聚酯和白蛋白比例是1:10，在此比例下制备的纳米颗粒其综合利用率(回收率×离心率)更高，可以用更少的疏水性聚酯组装更多的白蛋白。
Figure BDA0002617876720000173
实施例8、白蛋白脂肪族聚酯纳米颗粒离心-重悬所得组合物的血清稳定性
按照实施例1制备颗粒18，采用实施例2所述离心方法对纳米颗粒进行纯化后稀释至1mg/mL，用10×PBS稀释至1×PBS，加入10％FBS，分别在0h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，108h，120h，144h等时间点通过纳米粒度及Zeta电位仪检测纳米颗粒粒径和粒径分布。如图12所示，在长达一周的观察时间内，纳米颗粒粒径没有显著的改变，且粒径分布没有巨大波动，说明本发明的纳米颗粒可以在长达一周的时间保持水化半经的稳定。
实施例9、白蛋白脂肪族聚酯颗粒离心-重悬所得组合物的白蛋白释放行为
按照实施例1制备颗粒1、颗粒14-18，采用实施例2所述离心方法对颗粒进行纯化。纳米颗粒的白蛋白释放实验首先将已纯化颗粒稀释至1mg/mL，然后分别在不同时间点取100μL颗粒于4℃条件下按照15000rpm的离心速度离心1h，利用离心手段分离颗粒和上清(包含游离的HSA)，通过检测上清中游离出颗粒的白蛋白比例，以此观测纳米颗粒的白蛋白行为。上清中游离蛋白的浓度利用以下两种手段检测：
(1)BCA assay：以制备纳米颗粒的HSA为标准品，配制标准样品，利用BCA assay检测上清中游离出纳米颗粒的白蛋白比例。如图13所示，所有颗粒释放白蛋白比例都低于6％；
(2)HPLC法：采用HPLC法检测颗粒纯化后静置过程中释放白蛋白的比例，参考实施例6的方法，以颗粒24为例，将纯化后的颗粒稀释一定的倍数后，用高效液相色谱仪检测488nm激发波长下的荧光强度和280nm处紫外吸收值，并且将FITC-HSA梯度稀释作为标准样品，液相色谱表征FITC-HSA标准样品和所得标准曲线如图14所示，利用此标准曲线可计算得到颗粒中的游离白蛋白浓度，计算得出上清中游离出颗粒的白蛋白比例，结果同样显示有不超过6.5％的白蛋白从颗粒中释放。
上述结果说明颗粒1、颗粒14-18在长达一周的时间仅释放不到6.5％的白蛋白，纳米颗粒具有良好的稳定性，基于疏水作用结合的白蛋白可以稳定的组装。
实施例10、白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合抗IgG-Fc抗体(αFc-NP)
1)取山羊抗大鼠IgG-Fc抗体加超纯水稀释至1.0mg/mL，加入高碘酸钠水溶液至终浓度为7.5mM，4℃避光氧化2h。氧化反应结束后用Purpald法快速检测抗体醛基。0.05M醋酸钠缓冲液(pH 4.2)条件下使用100kDa超滤管超滤2-3次除去高碘酸钠。回收氧化抗体后用Nanodrop A280快速检测抗体浓度。
2)将颗粒1用超纯水稀释至0.5mg/mL，并加入上述氧化抗体至0.025mg/mL，利用1M的醋酸缓冲液调节反应体系pH为6.7以下，充分搅拌混合1h；混合吸附结束后，利用0.1M的NaOH调节反应体系pH至8.3以上，然后4℃反应8h，反应过程中分4次加入10mg/mL硼氢化钠使其作用浓度为0.5mg/mL；反应结束后于4℃15000rpm离心1.0h，保留上清用作后期表征，下层颗粒沉淀用等体积超纯水重悬后，再次离心2次，得到键合有山羊抗大鼠IgG-Fc抗体的白蛋白聚酯颗粒(αFc-NP)(如图19所示)，其粒径经表征为185.3nm，多分散指数为0.153。
实施例11、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合抗IgG-Fc抗体效率
取实施例10中反应结束后下层颗粒沉淀，加入25μL的1×PBS静置重悬，加入还原性的蛋白loading buffer通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征释放下来的抗体重链、轻链的比例来定性观察αFc的键合效果。如图15所示，αFc-NP其抗IgG-Fc抗体相比于游离抗体重链显著减少，说明其结合方式与预期相符。
实施例12、酶联免疫吸附测定(ELISA)表征白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合抗IgG-Fc抗体效率
取实施例10中反应结束后上清，通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)测试结合在颗粒上的山羊抗大鼠IgG-Fc抗体的量，通过投料的总量减去离心后上清中残留的游离抗体。抗IgG-Fc抗体的反应效率如图15所示，结果表明抗IgG-Fc抗体与白蛋白聚酯颗粒通过形成席夫碱的反应效率高于80％。
实施例13、αFc-NP结合功能性抗体亲和力表征
为更方便地表征αFc-NP结合功能性抗体的亲和力是否发生变化，将颗粒键合的抗IgG-Fc抗体替换为抗PD-1抗体，即αPD-1-NP，颗粒的制备方法参照实施例1，抗PD-1抗体的键合参照实施例10。表征方法采用ELISA法，具体步骤如下：
(1)预先在聚苯乙烯板(Corning)上包被Recombinant PD-1抗原(SinoBiological Inc.)，于37℃孵育2h，用1×PBST洗板2次，拍干；
(2)加入含2％BSA的1×PBS于室温封闭1h，封闭完后用1×PBST洗板2次，拍干；
(3)加入样品于室温孵育1h，样品为梯度稀释的抗PD-1抗体(BioXcell)及aPD-1-NP，用1×PBST洗板6次，拍干；
(4)加入HRP抗体(Sino Biological Inc.)，于室温孵育30min，用1×PBST洗板6次，拍干；
(5)加入TMB底物(Abcam)于避光条件下孵育10min；
(6)加入2M H2SO4终止显色，用酶标仪检测样品在450nm及630nm处的吸光度。
用软件“Graphpad Prism 7.00”计算出解离常数Kd值，并换算成结合常数Ka值，即可比较aPD-1-NP和PD-1亲和力的变化；
结果如图16所示，αPD-1对PD-1的解离常数为1.41E-07，αPD-1-NP对PD-1的亲和力为2.88E-5，结果说明白蛋白脂肪族聚酯颗粒键合抗体后仍然对功能性抗体保有较高的亲和力。
实施例14、αFc-NP结合功能性抗体(αFc-NP(αPD-1/αPD-L1))方法
取实施例10中得到的键合有山羊抗大鼠IgG-Fc抗体的白蛋白聚酯颗粒(αFc-NP)与功能性抗体总量(αPD-1/αPD-L1＝1/1)按照1:1的比例进行结合，在4℃的条件下结合6h，结合得到αFc-NP(αPD-1/αPD-L1)，其粒径为203.2nm，多分散指数为0.182。
实施例15、激光共聚焦观察αFc-NP(αPD-1/αPD-L1)促进肿瘤细胞和T细胞相互作用观察图
我们选取了小鼠黑色素瘤细胞系(B16-F10)用于探究结合有治疗抗体的αFc-NP与细胞的相互作用。对T细胞标记CFSE后，与B16-F10细胞(表达mCherry荧光蛋白)共同培养，分别设置mix free(αPD-1&αPD-L1)、separate NPs(αFc-NPαPD-1&αFc-NPαPD-L1)、αFc-NPαPD-1&αPD-L1([IgG]＝20μg/mL，[αPD-1]、[αPD-L1]各10μg/mL)，三个实验组。分别加入对应颗粒(参考实施例10)或抗体组分，培养4h后，洗去未结合颗粒及未与肿瘤细胞作用的T细胞，如图17所示，αFc-NP/2Abs相比其他组，更多的T细胞(绿色)与肿瘤细胞(红色)存在共定位现象，说明该颗粒能够促进两种细胞的相互作用。
实施例16、H 33342释放法检测αFc-NP(αPD-1/αPD-L1)促进T细胞杀伤肿瘤细胞
我们选取了小鼠黑色素瘤细胞系(B16-F10)用于探究结合有治疗抗体的αFc-NP促进T细胞杀伤肿瘤细胞的效果。利用CD3抗体特异性活化T细胞，用H 33342将B16-F10-ova染色，将T细胞和B16-F10-ova(H 33342)按照1:10的比例混合，设置PBS，mix free(αPD-1&αPD-L1)，separate NPs(αFc-NPαPD-1&αFc-NPαPD-L1)、aFc-NPαPD-1&αPD-L1([IgG]＝50μg/mL，[aPD-1]、[aPD-L1]各25μg/mL)，孵育12h和24h，孵育结束后最大释放组加入Triton X-100破坏细胞释放荧光染料，自然释放组只有肿瘤细胞，
Figure BDA0002617876720000211
Figure BDA0002617876720000212
如图18所示，αFc-NPαPD-1&αPD-L1在不同时间点均体现出显著的促进T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (26)

1.一种用于多特异性抗体递送的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，包括聚酯和具有疏水结构域的蛋白，所述蛋白的疏水结构域与所述聚酯通过疏水相互作用结合；所述蛋白为白蛋白、球蛋白和胞壁蛋白中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白与所递送的特异性抗体的受者具有相同的种属。
3.根据权利要求2所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、免疫球蛋白G、蛋白A和蛋白G中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述聚酯为脂肪族聚酯或聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯。
5.根据权利要求4所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述脂肪族聚酯为聚丙交酯、聚乙交酯、聚(乙交酯-co-丙交酯)和聚己内酯中的至少一种；所述聚乙二醇修饰的脂肪族聚酯为聚乙二醇修饰的聚丙交酯、聚乙二醇修饰的聚乙交酯、聚乙二醇修饰的聚(乙交酯-co-丙交酯)和聚乙二醇修饰的聚己内酯中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述脂肪族聚酯为聚丙交酯；所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯、右旋聚丙交酯或外消旋聚丙交酯；所述聚丙交酯的端基为酯基、羧基和羟基中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述聚丙交酯为左旋聚丙交酯，所述左旋聚丙交酯的端基为酯基，所述左旋聚丙交酯的分子量范围为7200～1100000道尔顿。
8.根据权利要求5所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述聚(乙交酯-co-丙交酯)中LA/GA的比例范围为95/5～50/50。
9.根据权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述聚酯与蛋白的重量比为1:0.1～1:30，优选为1:5～25，优选为1:5～15，更优选为1:9～11。
10.根据权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒，其特征在于，所述蛋白型纳米颗粒的平均粒径为74.8nm～384.2nm。
11.权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述蛋白与水、水溶液或缓冲液混合，得水相；将所述聚酯与有机溶剂混合，得油相；
(2)将步骤(1)所述水相和油相制备成水包油的乳剂；
(3)将所述乳剂分离纯化，得蛋白型纳米颗粒。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷和乙酸乙酯至少一种。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述蛋白在水相中的浓度为5～20mg/ml；步骤(1)所述聚酯在油相中的浓度为1～10mg/ml。
14.根据权利要求11～13任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述分离纯化的方法为离心、切向流透析和排除色谱中的至少一种；和/或，步骤(2)将所述水相和油相制备成水包油的乳剂的方法包括超声乳化或高压均质机乳化。
15.权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒在制备多特异性抗体递送平台中的应用。
16.一种多特异性抗体递送平台，其特征在于，由包括权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒经化学键与抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段部分连接而成；
其中，所述抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段的Fab结构域能够与所递送的特异性抗体的Fc结构域非共价结合；
所递送的特异性抗体与所述抗Fc段抗体或抗Fc段抗体片段所识别的Fc段具有相同的种属来源。
17.根据权利要求16所述的多特异性抗体递送平台，其特征在于，所述多特异性抗体递送平台递送至少2种特异性抗体。
18.权利要求16或17所述的多特异性抗体递送平台的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)将抗Fc段抗体经氧化剂氧化，得到含醛基抗Fc段抗体；
(B)将步骤(A)所得含醛基抗Fc段抗体与所述蛋白型纳米颗粒反应，所得产物再经还原剂还原。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述氧化剂为高碘酸钠，所述氧化的条件为：0～8℃下反应1～4小时。
20.根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，高碘酸钠在反应体系中的浓度低于10mM，抗Fc段抗体在反应体系中的浓度为0.8～1.2mg/mL。
21.根据权利要求18～20任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)所述蛋白型纳米颗粒在反应体系中的浓度为0.4～0.6mg/mL，所述含醛基抗Fc段抗体在反应体系中的浓度为0.02～0.03mg/mL；所述含醛基抗Fc段抗体与上述的蛋白型纳米颗粒反应时：反应体系的pH为6.7以下，反应的时间为0.5～1.5h。
22.根据权利要求18～20任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(B)所述还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠或醋酸硼氢化钠；
所述还原的条件为：反应体系的pH为8.3以上，于0～8℃温度下反应6～10小时，所述还原的过程中保持还原剂在反应体系中的浓度为0.4～0.6mg/mL。
23.权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒或权利要求16～17任一项所述的多特异性抗体递送平台在递送多特异性抗体中的应用或在制备多特异性抗体递送系统中的应用。
24.一种多特异性抗体递送系统，其特征在于，包括权利要求16～17任一项所述的多特异性抗体递送平台，以及特异性抗体。
25.权利要求1～8任一项所述的蛋白型纳米颗粒或权利要求16～17任一项所述的多特异性抗体递送平台或权利要求24所述的多特异性抗体递送系统在制备免疫治疗药物中的应用。
26.根据权利要求25所述的应用，其特征在于，所述免疫治疗药物为肿瘤免疫治疗药物或自身免疫疾病治疗药物。
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