CN112322497A - 一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统 - Google Patents

一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物源性食品致病微生物流行趋势评估技术领域，公开了一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统，包括：田间监测模块、市场调研模块、分离纯化模块、制片鉴定模块、中央控制模块、致病力确认模块、抗药性分析模块、农残测定模块、防治举措模块、评估模块、显示模块。本发明提供的石榴病原菌流行趋势评估方法，通过从田间种植到市场贸易，监测和调研产地当前阶段石榴典型微生物症状及其关键病原菌生物性状，基于产地环境因素通过对产地石榴关键病原菌致病力及抗药性、产地施用杀菌农药残留以及防治举措的系统分析，评估石榴病原菌发生流行趋势。本发明提供的石榴病原菌分离纯化方法，步骤简单，可操作性强。

Description

一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统
技术领域
本发明属于植物源性食品致病微生物流行趋势评估技术领域，尤其涉及一种石榴病原菌流行趋势评估的方法及系统。
背景技术
石榴病原菌不仅危害植株叶片、新梢、枝干，有的还侵染果实。目前，国内外针对石榴病原菌相关研究可概括为三个方面：
(一)发生流行的石榴微生物病症与关键病原菌：石榴枯萎病与甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)，石榴叶霉病与极细枝孢(Cladosporium tenuissimum)，石榴黑斑病(褐斑病)与生尾孢霉菌(Cercosporapunicae)、 (Pseudocercosporapunicae)和(Alternaria alternata)，石榴干腐病与鲜壳孢菌(Zythia versoniana)和垫壳孢菌(Coniella granati)，石榴果腐病与黑曲霉 (Aspergillus niger)、丛梗孢菌(Monilialaxa)、酵母菌(Nematospora sp.)和青霉(Penicillium italicum)等。这些石榴微生物病症不仅在田间种植期常有发生，石榴果实采后进入市场流通环节由于贮藏不当也会让病原菌滋生，发生果皮褐变、干缩、果实腐烂等问题。
(二)石榴病原菌抗药性与农药残留：农药长期、随意地不合理使用，容易造成病原菌产生变型，产生抗药性，表现出常用农药抑菌效果降低的现象，种植户加大农药使用量控制微生物病症发生，使农药依赖性呈恶性循环。不仅石榴鲜果，所有植物源性食品都存在着不同程度的病原菌抗药性和农药残留问题，全球每年估计有100万-500万起农药中毒事件发生，农药在使用过程中暴露出自然生态平衡的破坏，严重影响到植物源性食品食用安全问题。
(三)防治石榴微生物病症的方法：除了科学管理防控，适时合理地使用农药依然是防治石榴病原菌的主要手段，现阶段防治石榴微生物病症的农药有波尔多液、代森锰锌、甲基托布津、甲基硫菌灵、多菌灵、咪鲜胺、百菌清、氟硅唑、万霉灵、倍得丰、果病灵、枯萎必克、三唑酮、粉锈宁、石硫合剂、腐必清等。为防止病原菌抗药性和化学农药剂量加大引起的农药残留问题，生物防治方法以及生防菌种的应用越来越重要，现阶段生防菌种资源有芽孢杆菌、木霉菌、放线菌、假单胞菌、巴氏杆菌、毛壳菌等。
中国石榴栽培面积大、分布广，产量较高的有四川、云南、陕西、河南、山东、安徽、新疆等省(自治区)。其中，云南省尤以蒙自甜石榴最具代表性，不仅有市场，而且常作为典型优势品种对比其它产地石榴品质，成为了云南乃至全国特色资源和优势果品。但是石榴微生物病害的发生流行给优质石榴鲜果的生产及其产业带来了巨大威胁。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有基于产地环境因素和防治举措系统分析植物源性食品致病微生物发生流行的综合体系。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统。
本发明是这样实现的，一种石榴病原菌流行趋势评估方法，所述石榴病原菌流行趋势评估方法包括：
步骤一，通过田间监测模块在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴微生物病症进行田间监测；通过市场调研模块在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
步骤二，通过分离纯化模块在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
所述对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝包括：
(1)在培养病原菌的PDA平板接种处切取一0.4×0.8cm PDA菌块，放置于离心管中；
(2)加无菌水于离心管中，剧烈振荡，令菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；
(3)吸取制备的分生孢子悬浮液，用血球计数器测量分生孢子浓度；把孢子悬浮液配制成浓度为100-1000个/mL的分生孢子悬浮液；
(4)吸取100uL分生孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上，进行平板培养，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA试管斜面或另一PDA平板上，即可得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
步骤三，通过制片鉴定模块对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；通过中央控制模块控制致病力确认模块将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
步骤四，通过抗药性分析模块通过生长速率测定法分别进行杀菌农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对杀菌农药的抗药性分析；通过农残测定模块通过液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析杀菌农药对石榴病原菌的抑制及残留影响；
步骤五，通过防治举措模块对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；通过评估模块通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
所述通过评估模块运用趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估的方法，包括：
1)通过流行趋势评估模块获取病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果以及农残测定结果数据，并将所述数据进行融合获得数据集；
2)构建混杂贝叶斯网络模型，并通过训练程序利用数据集对混杂贝叶斯网络模型进行训练；
3)利用趋势评估程序利用训练好的混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估；
步骤六，通过显示模块利用显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
进一步，步骤二中，所述平板培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉 20g、超纯水1000mL组成。
进一步，步骤二(4)中，所述平板培养包括：于25℃下平板培养60h。
进一步，步骤三中，所述通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定包括：
基于纯化后的病原菌菌落的形态、颜色、生长速度、菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽进行病原菌鉴定。
进一步，步骤三中，所述斜面培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉 20g、超纯水1000mL组成。
进一步，步骤五1)中，所述将所述数据进行融合获得数据集的方法，包括：
1.1)确定待融合的多源数据，所述待融合的多源数据中每一数据绑定有维度关系记录标识，所述维度关系记录标识用于标识维度关系记录；
1.2)基于待融合的每一数据的维度关系记录标识在预先建立的维度关系记录表中提取维度关系记录；
1.3)基于提取到的维度关系记录中包括的维度值，对所述待融合的多源数据进行数据融合。
进一步，所述维度关系记录表是基于多源数据的维度预先建立的维度关系映射表。
本发明的另一目的在于提供一种实施所述石榴病原菌流行趋势评估方法的石榴病原菌流行趋势评估系统，所述石榴病原菌流行趋势评估系统包括：
田间监测模块、市场调研模块、分离纯化模块、制片鉴定模块、中央控制模块、致病力确认模块、抗药性分析模块、农残测定模块、防治举措模块、评估模块、显示模块；
田间监测模块，与中央控制模块连接，用于在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴微生物病症进行田间监测；
市场调研模块，与中央控制模块连接，用于在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
分离纯化模块，与中央控制模块连接，用于在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
制片鉴定模块，与中央控制模块连接，用于对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；
中央控制模块，与田间监测模块、市场调研模块、分离纯化模块、制片鉴定模块、致病力确认模块、抗药性分析模块、农残测定模块、防治举措模块、评估模块、显示模块连接，用于通过中央处理器控制所述石榴病原菌流行趋势评估系统各个模块的正常运行；
致病力确认模块，与中央控制模块连接，用于将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
抗药性分析模块，与中央控制模块连接，用于通过生长速率测定法分别进行农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对农药的抗药性分析；
农残测定模块，与中央控制模块连接，用于通过液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析杀菌农药对石榴病原菌的抑制及残留影响；
防治举措模块，与中央控制模块连接，用于对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；
评估模块，与中央控制模块连接，用于通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
显示模块，与中央控制模块连接，用于通过显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
本发明的另一目的在于提供一种存储在计算机可读介质上的计算机程序产品，包括计算机可读程序，供于电子装置上执行时，提供用户输入接口以实施所述的石榴病原菌流行趋势评估方法。
本发明的另一目的在于提供一种计算机可读存储介质，储存有指令，当所述指令在计算机上运行时，使得计算机执行所述的石榴病原菌流行趋势评估方法。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供了一套完整的病原菌流行趋势评估的方法和系统，该方法和系统对石榴鲜果及其它植物源性食品相关致病微生物的发生流行分析有重要参考和借鉴作用。
本发明提供的石榴病原菌流行趋势评估方法，通过从田间种植到市场贸易，监测和调查产地当前阶段石榴典型微生物症状及其关键病原菌生物性状，基于产地环境因素通过对产地石榴关键病原菌致病力及抗药性、产地施用杀菌农药残留以及防治举措的系统分析，评估石榴病原菌发生流行趋势。本发明提供的石榴病原菌分离纯化方法，步骤简单，可操作性强。
本发明将贝叶斯网络模型和混杂系统进行有效结合构建了混杂贝叶斯网络模型，提高了评估的适用性和精确性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的石榴病原菌流行趋势评估方法原理图。
图2是本发明实施例提供的石榴病原菌流行趋势评估方法流程图。
图3是本发明实施例提供的对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的通过评估模块运用趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估的方法流程图。
图5是本发明实施例提供的石榴病原菌流行趋势评估系统结构示意图；
图中：1、田间监测模块；2、市场调研模块；3、分离纯化模块；4、制片鉴定模块；5、中央控制模块；6、致病力确认模块；7、抗药性分析模块；8、农残测定模块；9、防治举措模块；10、评估模块；11、显示模块。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种石榴病原菌流行趋势评估方法及系统，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1-图2所示，本发明实施例提供的石榴病原菌流行趋势评估方法包括以下步骤：
S101，通过田间监测模块在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴微生物病症进行田间监测；通过市场调研模块在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
S102，通过分离纯化模块在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
S103，通过制片鉴定模块对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；通过中央控制模块控制致病力确认模块将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
S104，通过抗药性分析模块通过生长速率测定法分别进行杀菌农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对杀菌农药的抗药性分析；通过农残测定模块通过液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析杀菌农药对石榴病原菌的抑制及残留影响；
S105，通过防治举措模块对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；通过评估模块通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
S106，通过显示模块利用显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
步骤S102中，本发明实施例提供的平板培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉20g、超纯水1000mL组成。
如图3所示，步骤S102中，本发明实施例提供的对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝包括：
S201，在培养病原菌的PDA平板接种处切取一0.4×0.8cm PDA菌块，放置于离心管中；
S202，加无菌水于离心管中，剧烈振荡，令菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；
S203，吸取制备的分生孢子悬浮液，用血球计数器测量分生孢子浓度；把孢子悬浮液配制成浓度为100-1000个/mL的分生孢子悬浮液；
S204，吸取100uL分生孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上；25℃下平板培养60h后，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA试管斜面或另一 PDA平板上，即可得到典型而无杂菌的菌落、菌丝。
步骤S103中，本发明实施例提供的通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定包括：
基于纯化后的病原菌菌落的形态、颜色、生长速度、菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽进行病原菌鉴定。
步骤S103中，本发明实施例提供的斜面培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉20g、超纯水1000mL组成。
如图4所示，步骤S105中，本发明实施例提供的通过评估模块运用趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估的方法，包括：
S301，通过评估模块获取病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果以及农残测定结果数据，并将所述数据进行融合获得数据集；
S302，构建混杂贝叶斯网络模型，并通过训练程序利用数据集对混杂贝叶斯网络模型进行训练；
S303，运用趋势评估程序利用训练好的混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估。
步骤S301中，本发明实施例提供的将所述数据进行融合获得数据集的方法，包括：
确定待融合的多源数据，所述待融合的多源数据中每一数据绑定有维度关系记录标识，所述维度关系记录标识用于标识维度关系记录；基于待融合的每一数据的维度关系记录标识在预先建立的维度关系记录表中提取维度关系记录；基于提取到的维度关系记录中包括的维度值，对所述待融合的多源数据进行数据融合。
本发明实施例提供的维度关系记录表是基于多源数据的维度预先建立的维度关系映射表。
如图3所示，本发明实施例提供的石榴病原菌流行趋势评估系统包括：田间监测模块1、市场调研模块2、分离纯化模块3、制片鉴定模块4、中央控制模块5、致病力确认模块6、抗药性分析模块7、农残测定模块8、防治举措模块9、评估模块10、显示模块11。
田间监测模块1，与中央控制模块5连接，用于在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴发微生物病症进行田间监测；
市场调研模块2，与中央控制模块5连接，用于在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
分离纯化模块3，与中央控制模块5连接，用于在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
制片鉴定模块4，与中央控制模块5连接，用于对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；
中央控制模块5，与田间监测模块1、市场调研模块2、分离纯化模块3、制片鉴定模块4、致病力确认模块6、抗药性分析模块7、农残测定模块8、防治举措模块9、评估模块10、显示模块11连接，用于通过中央处理器控制所述石榴病原菌流行趋势评估系统各个模块的正常运行；
致病力确认模块6，与中央控制模块5连接，用于将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
抗药性分析模块7，与中央控制模块5连接，用于通过生长速率测定法分别进行杀菌农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对杀菌农药的抗药性分析；
农残测定模块8，与中央控制模块5连接，用于通过液相色谱仪、液相色谱- 串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析残留影响；
防治举措模块9，与中央控制模块5连接，用于对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；
评估模块10，与中央控制模块5连接，用于通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
显示模块11，与中央控制模块5连接，用于通过显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
实施例1：
《云南蒙自产地石榴病原菌发生流行趋势评估》项目：
一、研究的目的、意义
(一)研究目的
为保障“云南蒙自石榴”安全和品质，本项目采取田间监测、市场调研和实验室研究相结合的综合分析方法，通过从田间种植到贸易环节，对云南蒙自产地石榴发生病状调查及病原菌致病力确认、抗药性分析、农残测定以及防治举措分析，结合这些产地地理环境因素明确现阶段产地石榴典型发病症状及其关键病原菌生物性状，评估产地石榴病原菌发生流行趋势。
(二)研究意义
云南省蒙自市素有“中国石榴之乡”美誉，石榴种植总面积达12万余亩，年产量约26万吨，年出口量约15万吨，出口总值超过1亿美元。蒙自产区石榴品牌具有中国地理标志，受原产地保护，在市场上具有较强的竞争力。尤其“蒙自甜石榴”果实成熟早，色泽白里透红，皮薄，内聚性强，口感纯正，更受大众欢迎。但令人担心的是，气候变化异常、外来生物入侵、农药使用不规范、缺乏科学管理以及技术指导等这些问题，一定程度造成了云南蒙自产地石榴病害和农药残留隐患加重，国内外科研领域也屡见引用云南蒙自产地爆发石榴微生物病害的文献报道，对原本已具备中国地理标志的“蒙自甜石榴”品牌形象升级，尤其在国际市场上极为不利，“蒙自甜石榴”良好口碑受到了极大的负面影响。近年来，云南省红河州积极推动蒙自市出口食品农产品质量安全示范区建设，建成出口石榴种植基地质量安全核心示范区，打造特色石榴庄园，推动优质石榴继续走出国门。
《云南蒙自产地石榴病原菌发生流行趋势评估》项目实施，明确现阶段云南蒙自产地石榴典型发病症状及其关键病原菌生物性状，评估蒙自产区石榴病原菌发生流行趋势，这对于(1)提高进出口石榴鲜果的检验检疫把关能力，体现海关监管作用；(2)预防和控制石榴病原菌发生流行及农药残留现象，消除植物源性食品安全隐患；(3)科学指导农产品种植和环境保护、储运和加工标准；(4)推动“蒙自甜石榴”继续成为受中国地理标志保护的农产品，巩固国际市场品牌形象，推动地方经济和社会综合发展，具有现实意义。
二、研究内容及预期达到的最终目标(主要技术、经济指标与研究结果)
(一)研究内容
1、记录分析云南蒙自产地石榴典型发病症状及关键病原菌生物性状。
(1)对采摘前蒙自产地石榴(出口种植基地)杀菌农药使用情况、石榴发生微生物病状进行田间调查。
(2)对采摘前蒙自产地石榴关键病原菌进行实验室生物学研究。
(3)对采摘后蒙自产地石榴在农产品出口市场(出口水果包装厂)发生病状进行市场调查。
(4)对采摘后蒙自产地石榴在农产品出口市场发现的关键病原菌进行实验室生物学研究。
2、评估云南蒙自产地石榴病原菌发生流行趋势。
(1)比较分析蒙自产地地理环境因素对石榴关键病原菌的影响。杀菌农药使用情况及其在石榴中的残留状况。
(2)对石榴关键病原菌致病力、农药抑制效果以及防治举措综合进行分析研究，进一步评估石榴病原菌发生流行趋势。
(二)研究预期达到的最终目标
1、研究预期结果
记录现阶段蒙自产区石榴典型微生物病症，完成石榴病原菌发生流行趋势分析评估。
2、研究预期效益
项目实施，将进一步提高海关进出口石榴鲜果的检验检疫把关能力，体现海关监管作用。有助于云南省地方特色资源“蒙自甜石榴”肃清负面影响、巩固品牌形象，继续成为受中国地理标志保护农产品，促进红河州地方外贸健康发展和植物源性食品经济发展，具有良好的社会效益和经济效益。
三、采用的研究、试验方法和技术路线(包括工艺流程)
(一)研究方法、试验方法
1、田间监测法
在云南省蒙自市出口石榴种植基地，涉及新安所镇、文澜镇、草坝镇、雨过铺镇、芷村镇等石榴田间设点实地调查农药使用成分、用量、使用频率和喷洒部位，并开展周边农药店出售调查，依照农药标签、说明记录成分和含量。在田间设点区逐株调查石榴发病状况和发病严重程度，拍照、数据记录，实地采集石榴病叶、病枝和染病果实，作标记，于实验室保存，采集时间从5月份开始，采集要求叶片、病枝、果实病斑典型。
2、市场调研法
在产地出口包装厂调研石榴鲜果发病状况和发病严重程度，图片、数据资料记录，随机采集石榴病果，作标记，于实验室保存。
3、实验室研究法
病菌分离纯化试验：在超净工作台上对采集到的病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
病菌制片鉴定试验：综合镜检结果，通过生物形态学对纯化的病原菌进行鉴定；
致病力确认试验：根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力分析；采用生长速率测定法进行农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对农药的抗药性研究。
农药抑制试验：(1)菌块制备。将分离、保存的石榴关键病原菌接种到PDA 平板培养基中，于28℃恒温扩繁培养7d后，采用直径5mm打孔器在培养基同一半径周围取菌块备用。(2)含药PDA平板处理。采用菌丝生长速率法，将产地常施用的杀菌化学农药按供货说明书的使用浓度配制后，加入PDA培养液中，摇匀后倒入已灭菌的培养皿制成含药PDA平板备用。(3)抑菌试验。将石榴关键病原菌菌块分部接种于含药PDA平板中心位置，以接种到不含药的 PDA平板中心位置为对照。每个处理重复3次，于28℃恒温培养7d后，采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑菌率并进行数据统计。所有试验数据均采用 Excel进行数据汇总并计算平均值。抑菌率计算公式如下：
Figure BDA0002759292930000141
式中:dCK表示对照病原菌菌落直径，mm；dB表示含药平板处理病原菌菌落直径，mm。
农残测定试验：采用液相色谱仪(LC)、液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱仪(GC-MS)，测定产地常用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析残留影响。
4、综合分析法
结合田间监测、市场调研和实验室检测鉴定结果，结合产地防治举措，对石榴病原菌发生流行与产地地理环境因素进行分析，进而评估云南蒙自产地石榴病原菌发生流行趋势。
在上述实施例中，可以全部或部分地通过软件、硬件、固件或者其任意组合来实现。当使用全部或部分地以计算机程序产品的形式实现，所述计算机程序产品包括一个或多个计算机指令。在计算机上加载或执行所述计算机程序指令时，全部或部分地产生按照本发明实施例所述的流程或功能。所述计算机可以是通用计算机、专用计算机、计算机网络、或者其他可编程装置。所述计算机指令可以存储在计算机可读存储介质中，或者从一个计算机可读存储介质向另一个计算机可读存储介质传输，例如，所述计算机指令可以从一个网站站点、计算机、服务器或数据中心通过有线(例如同轴电缆、光纤、数字用户线(DSL))或无线(例如红外、无线、微波等)方式向另一个网站站点、计算机、服务器或数据中心进行传输。所述计算机可读取存储介质可以是计算机能够存取的任何可用介质或者是包含一个或多个可用介质集成的服务器、数据中心等数据存储设备。所述可用介质可以是磁性介质(例如软盘、硬盘、磁带)、光介质(例如DVD)、或者半导体介质(例如固态硬盘(SSD))等。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，所述石榴病原菌流行趋势评估方法包括：
步骤一，通过田间监测模块在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴微生物病症进行田间监测；通过市场调研模块在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
步骤二，通过分离纯化模块在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
所述对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝包括：
(1)在培养病原菌的PDA平板接种处切取一0.4×0.8cm PDA菌块，放置于离心管中；
(2)加无菌水于离心管中，剧烈振荡，令菌块上的分生孢子充分释放于水中，制备成分生孢子悬浮液；
(3)吸取制备的分生孢子悬浮液，用血球计数器测量分生孢子浓度；把孢子悬浮液配制成浓度为100-1000个/mL的分生孢子悬浮液；
(4)吸取100uL分生孢子悬浮液均匀涂布于PDA平板上，进行平板培养，生长出多个单孢菌落，挑选部分单孢菌落于PDA试管斜面或另一PDA平板上，即可得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
步骤三，通过制片鉴定模块对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；通过中央控制模块控制致病力确认模块将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
步骤四，通过抗药性分析模块通过生长速率测定法分别进行杀菌农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对杀菌农药的抗药性分析；通过农残测定模块通过液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析杀菌农药对石榴病原菌的抑制及残留影响；
步骤五，通过防治举措模块对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；通过评估模块通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
所述通过评估模块运用趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估的方法，包括：
1)通过流行趋势评估模块获取病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果以及农残测定结果数据，并将所述数据进行融合获得数据集；
2)构建混杂贝叶斯网络模型，并通过训练程序利用数据集对混杂贝叶斯网络模型进行训练；
3)利用趋势评估程序利用训练好的混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估；
步骤六，通过显示模块利用显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
2.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，步骤二中，所述平板培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉20g、超纯水1000mL组成。
3.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，步骤二(4)中，所述平板培养包括：于25℃下平板培养60h。
4.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，步骤三中，所述通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定包括：
基于纯化后的病原菌菌落的形态、颜色、生长速度、菌丝形态、孢子形态、孢子长和孢子长宽进行病原菌鉴定。
5.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，步骤三中，所述斜面培养基由马铃薯200g、葡萄糖16g、琼脂粉20g、超纯水1000mL组成。
6.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，步骤五1)中，所述将所述数据进行融合获得数据集的方法，包括：
1.1)确定待融合的多源数据，所述待融合的多源数据中每一数据绑定有维度关系记录标识，所述维度关系记录标识用于标识维度关系记录；
1.2)基于待融合的每一数据的维度关系记录标识在预先建立的维度关系记录表中提取维度关系记录；
1.3)基于提取到的维度关系记录中包括的维度值，对所述待融合的多源数据进行数据融合。
7.如权利要求1所述石榴病原菌流行趋势评估方法，其特征在于，所述维度关系记录表是基于多源数据的维度预先建立的维度关系映射表。
8.一种实施如权利要求1-7所述石榴病原菌流行趋势评估方法的石榴病原菌流行趋势评估系统，其特征在于，所述石榴病原菌流行趋势评估系统包括：
田间监测模块、市场调研模块、分离纯化模块、制片鉴定模块、中央控制模块、致病力确认模块、抗药性分析模块、农残测定模块、防治举措模块、评估模块、显示模块；
田间监测模块，与中央控制模块连接，用于在石榴鲜果采摘前，在产地种植区域对杀菌农药使用情况和石榴微生物病症进行田间监测；
市场调研模块，与中央控制模块连接，用于在石榴鲜果采摘后，获取种植区域周边杀菌农药销售流向，并对市场发生石榴微生物病症进行市场调研，获取相应石榴微生物病症数据；
分离纯化模块，与中央控制模块连接，用于在超净工作台上对病叶、枝干挑取典型病斑接种到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对石榴幼果和石榴鲜果切取小块病组织移到在平板培养基上进行病原菌分离培养，对分离培养后的病原菌进行纯化处理，得到典型而无杂菌的菌落、菌丝；
制片鉴定模块，与中央控制模块连接，用于对纯化处理后的病菌制片，于显微镜下观察病原菌生物性状、测量、拍照，通过生物形态学对纯化处理后的病原菌进行鉴定；
中央控制模块，与田间监测模块、市场调研模块、分离纯化模块、制片鉴定模块、致病力确认模块、抗药性分析模块、农残测定模块、防治举措模块、评估模块、显示模块连接，用于通过中央处理器控制所述石榴病原菌流行趋势评估系统各个模块的正常运行；
致病力确认模块，与中央控制模块连接，用于将纯化后的病原菌转入斜面培养基划线培养，置于28℃恒温培养箱培养7～8d，于4℃冰箱保存备用，根据柯赫氏证病律进行病原菌致病力确认；
抗药性分析模块，与中央控制模块连接，用于通过生长速率测定法分别进行杀菌农药对石榴病原菌的抑菌率测定和病原菌对杀菌农药的抗药性分析；
农残测定模块，与中央控制模块连接，用于通过液相色谱仪、液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-质谱仪，测定产地施用杀菌农药在石榴鲜果和果皮中的残留量，并分析杀菌农药对石榴病原菌的抑制及残留影响；
防治举措模块，与中央控制模块连接，用于对产地开展的物理防治、化学防治、生物防治措施进行汇总分析；
评估模块，与中央控制模块连接，用于通过趋势评估程序利用混杂贝叶斯网络模型对石榴病原菌流行趋势进行评估，并生成流行趋势评估报告；
显示模块，与中央控制模块连接，用于通过显示器显示病原菌鉴定结果、致病力确认结果、抗药性分析结果、农残测定结果以及流行趋势评估报告的实时数据。
9.一种存储在计算机可读介质上的计算机程序产品，包括计算机可读程序，供于电子装置上执行时，提供用户输入接口以实施如权利要求1～7任意一项所述的石榴病原菌流行趋势评估方法。
10.一种计算机可读存储介质，储存有指令，当所述指令在计算机上运行时，使得计算机执行如权利要求1～7任意一项所述的石榴病原菌流行趋势评估方法。
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