CN112268870B - 一种甘薯耐贮藏特性的评价方法 - Google Patents

一种甘薯耐贮藏特性的评价方法 Download PDF

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Abstract

一种甘薯耐贮藏特性的评价方法，包括对甘薯叶片进行抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定；以耐贮藏品种徐55‑2中生理指标为标准，当待测甘薯品种叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性为耐贮藏品种徐55‑2叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性的70%及以上，且待测甘薯品种叶片的丙二醛含量、H2O2含量和超氧阴离子含量是耐贮藏品种徐55‑2叶片中对应指标的120%及以下，则可判定该品种是耐储存品种，反之则是不耐贮藏品种。本发通过对甘薯叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定，评价甘薯贮藏性能，可以早期判断甘薯是否耐贮藏。

Description

一种甘薯耐贮藏特性的评价方法
技术领域
本发明属于农产品贮藏技术领域，涉及一种甘薯耐贮藏特性的评价方法。
背景技术
甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一种富含营养物质的粮食和工业原料作物，属被子植物门(Magnoliophyta)、双子叶植物纲(Magnoliopsida)、茄目(Solanates)、旋花科(Convolvulaceae)、甘薯属(Ipomoea)、番薯种(I.batatas)。据联合国粮农组织(FAO)统计，我国每年甘薯耕种量达350万公顷，占全球的45％；产量高达8000万吨，占全球的75％。甘薯具有丰富的营养价值、保健功效以及较强的抗氧化特性。其中富含的花青素、多酚、黄酮等成分被认为具有较强的抗氧化活性被广泛提取研究。
甘薯常收获于春末及秋末，由于其体表面积较大、水分含量高、表皮薄，容易受伤且易受到低温的影响。当甘薯贮藏温度过低时，其呼吸作用会受到抑制，长时间的低温贮藏则会引发冷害，削弱了甘薯的抗病能力，导致其在储存过程中容易发生病害，采后贮藏损失十分严重。因此探索甘薯贮藏及保鲜技术意义重大，具有极其广阔的开发应用前景。
影响甘薯安全贮藏的因素主要包括温度、湿度和空气。温度与甘薯安全贮藏的关系最大，甘薯贮藏期间维持着薯块正常生命活动所需的最低温度9℃-10℃，低于9℃即受冻腐烂，低于1.5℃即成冻害。当贮藏温度长时间超过15℃，薯块呼吸作用加剧，消耗掉大量养分，还会促使其发芽，18℃以上则会发芽糠心。高温常常伴随高湿条件，助长病害的发生和蔓延。因此一般认为12℃-15℃是甘薯贮藏的最佳温度。除此之外，甘薯安全贮藏的相对湿度为85％-95％为宜，过高过低都会造成湿害或干害；而在正常的贮藏条件下，甘薯吸收大量氧气，呼出二氧化碳，使得氧气逐渐减少，二氧化碳浓度增加，甘薯被迫进行缺氧呼吸，产生大量酒精，引起甘薯酒精中毒而发生腐烂。
目前甘薯的贮藏方式主要包含四种：传统窖贮保鲜、冷库贮藏保鲜、气控贮藏保鲜、化学保鲜剂贮藏。传统窖贮保鲜方法工序多且复杂、耗费人力、不可控因素较多，现已很少被应用。冷库贮藏保鲜相较于传统窖贮保鲜更为科学，可方便地调节库内温湿度，避免过多外界因素的干扰，但因甘薯为冷敏性作物，温度过低会导致冷害的发生，故库温的选择十分重要。目前关于冷藏温度的研究颇多，但结论不一，这一类贮藏方法有待继续优化。气控贮藏保鲜和化学保鲜剂贮藏精准地利用气体或化学试剂调节贮藏条件，显著提高了甘薯的保鲜效果。但这两种方式多应用于小规模贮藏，各项技术手段仍不成熟。因此，筛选具有耐贮藏特性较高的甘薯品种对于减少采后甘薯损失，比较重要。
在甘薯的低温贮藏期间，体内会产生一定的ROS(reactive oxygen species，活性氧自由基)，而ROS是破坏细胞结构、损伤细胞功能的主要因素，影响细胞的正常生理功能。而在长期进化过程中，果蔬体内形成了活性氧清除系统以抵御外界环境胁迫和衰老，其中酶促清除系统起到很大作用。酶促清除系统为抗氧化酶类，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等。在正常情况下，植物中的ROS代谢产物的产生与其清除酶处于平衡状态，而在低温胁迫或长期贮藏条件下，抗氧化酶的活性呈上升趋势，但由于ROS过量产生，将破坏抗氧化酶的生理结构，抗氧化酶类活性降低，造成植物体的损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘薯耐贮藏特性的评价方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种甘薯耐贮藏特性的评价方法，包括对甘薯叶片进行抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定；
以耐贮藏品种徐55-2中生理指标为标准，当待测甘薯品种叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性为耐贮藏品种徐55-2叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性的70％及以上，且待测甘薯品种叶片的丙二醛含量、H2O2含量和超氧阴离子含量是耐贮藏品种徐55-2叶片中对应指标的120％及以下，则可判定该品种是耐储存品种，反之则是不耐贮藏品种。
优选的技术方案为：所述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定包括：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，接着将研磨后的产物加入至酶提取液中，提取得到混合液，将混合液转移到离心管中，离心后取上清得到粗酶液；然后对粗酶液中的抗坏血酸过氧化物酶活性进行测定。
优选的技术方案为：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，之后加入质量分数为4-6％的三氯乙酸溶液继续研磨，4℃的条件下以速度12000g离心10min，取等量的上清液和质量分数为0.67％的硫代巴比妥酸溶液混匀，沸水浴后，插入冰中冷却并离心，最后分别在600nm、532nm和450nm处测定吸光值；丙二醛含量的计算公式为c(μmol/L)＝6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。
优选的技术方案为：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，加入丙酮后进行离心，将上清液、质量分数为5％的硫酸钛和浓氨水混匀，离心去上清后再向沉淀中加入丙酮混匀，再离心去除上清，之后向沉淀中加入硫酸混匀，管底沉淀被完全溶解后，即可在410nm处测定吸光值。
优选的技术方案为：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，加入pH7.8磷酸缓冲液再次研磨后进行离心，上清液即为超氧根阴离子测定液；测定时将超氧根阴离子测定液分为两组，空白对照组和测定组，取上清液1mL与提取用的pH7.8磷酸缓冲液1mL和1mL的浓度为1mM的盐酸羟胺溶液加入两组试管混匀，25℃水浴加热1h，然后分别加入1mL的浓度为17mM的对氨基苯磺酸和1mL的浓度为7mM的α-萘胺1mL，摇匀，25℃水浴20min，于530nm处比色测定。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发通过对甘薯叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定，评价甘薯贮藏性能，可以早期判断甘薯是否耐贮藏。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
验证实验：实验材料及不同品种甘薯耐贮藏性能试验统计
甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)品种(Sinjami、徐22-5、美99573、Z15-1Z11-1、Z8-1、Z8-2、商薯9、徐23、徐55-2)的块根在温度11–15℃，相对湿度80％-90％下，贮藏290天后的腐烂率进行定义。甘薯耐贮藏试验统计表如下所示。
品种名称 耐贮藏特性 贮藏特性评分
徐55-2 耐储 4
Z15-1 耐储 4
Z8-2 不耐储 3
Z8-1 不耐储 3
商薯9号 不耐储 3
Sinjami 不耐储 3
美99573 不耐储 3
Z11-1 不耐储 2
徐薯23 不耐储 1
徐22-5 不耐储 2
确定影响甘薯耐贮藏性能的因子：
一、甘薯中ROS代谢产物(MDA、H2O2、O2 -)的含量测定
(1)、丙二醛(MDA)含量的测定，取2.0g不同品种的甘薯叶片样品，液氮下研磨，之后加入5％的三氯乙酸继续研磨，要保证研磨充分，低温离心，小心转移上清。取等量的上清液和0.67％硫代巴比妥酸(TBA)溶液混匀，沸水浴15min后，迅速插入冰中冷却并离心，最后分别在600nm、532和450nm处测定吸光值。
(2)、H2O2物质的测定：丙酮置于冰上预冷，取5.0g不同品种的甘薯叶片样品，液氮下研磨，加入3mL预先准备好的丙酮，在低温下离心,小心的将上清液移到干净的离心管中。取1mL上清液与5％的硫酸钛和浓氨水吹吸混匀，离心去上清，再向沉淀中加入丙酮吹吸混匀，再离心，去除上清，之后向沉淀中加入硫酸吹吸，见管底沉淀被完全溶解后，即可在410nm处测定吸光值，根据实验结果制作标准曲线，并计算出H2O2的含量。
(3)、超氧阴离子(·O2 -)的测定：取2.0g不同种类的甘薯叶片样品，液氮下研磨，加入3mL的0.1M，pH7.8磷酸缓冲液再次研磨后使用低温离心机，4℃12,000rmp条件下离心30min，上清即为超氧根阴离子测定液。测定时每个样品分为两组，空白对照组和测定组，取上清液1mL与提取用的磷酸缓冲液1mL和1mM 1mL盐酸羟胺加入两组试管混匀，25℃水浴加热1h，然后分别加入17mM对氨基苯磺酸和7mMα-萘胺1mL，摇匀，25℃水浴20min，于530nm处测定吸光值。同样的条件下制定标准曲线，根据标准曲线的结果，计算出样品中超氧根阴离子的含量。
二、抗氧化酶类APX、POD、SOD、CAT、LOX的提取
(1)、取4g不同种类的甘薯叶片样品,在研钵中加入液氮研磨充分后加入5mL在4℃条件下遇冷的酶提取液(磷酸缓冲液pH 7.8，含有0.5M EDTA,0.1M PMSF,5％PVP和1mMDTT)，保证研磨充分。将研磨后的液体转移到离心管中，低温离心30min。离心后取上清并分装(每次使用时拿分装后的样品，保证反复冻融造成的酶活性丧失)，-80℃保存备用。
(2)、抗氧化酶类APX、POD、SOD、CAT、LOX的活性测定
(3)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定：APX在能够催化H2O2和抗坏血酸(ASA)发生氧化还原反应，使ASA含量减少，H2O2被分解清除，同时反应体系在290nm处吸光值下降。测定时反应体系为3mL，其中含有pH 7.0 50mM磷酸缓冲液，15mM的抗坏血酸及15mM H2O2，还有适量的粗酶液。以每分钟，吸光度变化0.01个单位作为一个酶活单位(U)，单位是Ug-1 FW。
(4)、愈创木酚过氧化物酶(POD)活性测定：POD能够以H2O2和愈创木酚作为底物，发生氧化反应，同时生成茶褐色物质，这种茶褐色的物质在470nm波长处有最大吸光值。测定时取分装后的粗酶液加入50mM，pH 6.0的磷酸缓冲液、0.25％愈创木酚和3％H2O2，混匀后在470nm处测定吸光值，以每分钟内上升0.01个单位记为一个酶的活性单位(U)，单位是Ug-1FW。
(5)、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：在光照下，·O2-与氯化硝基四氮唑蓝(NBT)还原为蓝色甲腙，而SOD在清除·O2-后，蓝色物质产生减少，从而抑制NBT的光还原反应，使甲腙生成减慢，甲腙在560nm处有最大吸收，因此测定吸光值变化来计算SOD酶活大小。测定时，去适量上述分装后的粗酶液，加入50mM pH 7.8的磷酸缓冲液(内含有130mM蛋氨酸，0.75mM NBT，0.1mM乙二胺四乙酸二钠)，0.02mM核黄素(VB2)。最后加入VB2，立刻吹吸混匀，用均匀的灯光照射5min，时间结束后即可测定反应液的吸光值。以每克每分钟甘薯叶片的鲜重抑制50％NBT光还原反应作为为一个SOD活性单位(U)，单位是Ug-1 FW。
(6)、过氧化氢酶(CAT)活性测定：CAT的功能是以H2O2作为底物，生成的产物是水和氧气，因此测出的变化值既是H2O2的变化值。H2O2在240nm波长下有最大吸收值，故直接用紫外分光光度计测定吸光值的变化来计算CAT酶活性变化。取上述分装好的粗酶液，加入50mMpH 7.0的磷酸缓冲液以及3％的H2O2。以每分钟内吸光值下降0.1个单位记为1个CAT活性单位U，单位是Ug-1 FW。
评估甘薯中耐贮藏性与ROS代谢产物及抗氧化相关酶活性的相关性。
为了进一步验证甘薯抗氧化能力与贮藏性之间的关联，选取了Sinjami、徐22-5、美99573等十种不同贮藏性能的甘薯。利用基迪奥云平台(https://www.omicshare.com/)将这十种甘薯的贮藏性能与甘薯叶片中的ROS代谢产物(MDA、H2O2、O2 -)的含量及抗氧化相关酶(APX、POD、SOD、CAT、LOX)的活性进行了聚类分析、相关性分析及主成分分析(PCA)。结果显示，甘薯叶片中ROS代谢产物H2O2，、O2 -和MDA的数据与ROS清除酶(APX、POD、SOD、CAT)的活性呈负相关，与LOX呈正相关；甘薯的耐贮性与ROS清除酶类活性(APX、POD、SOD、CAT)呈正相关，而与ROS代谢产物含量及LOX活性正好相反，其中与LOX活性的相关系数达到-0.8543。此外，通过聚类分析，我们可以得到耐贮藏品种(徐55-2、Z15-1)和不耐贮藏品种(Sinjami、美99573、Z11-1、Z8-1、Z8-2、商薯9、徐22-5、徐薯23)存在明显的聚类。主成分分析结果显示PC1和PC2揭示了数据的56.6％和15.5％的可变性，根据上述测量参数，在PC1中耐贮藏品种和不耐贮藏品种之间存在明显的聚类，这与聚类分析结果一致。以上结果表明，在不同品种及耐贮性的甘薯中，抗氧化能力是具有明显差异性的，且抗氧化能力与贮藏性能的正相关性是具有普遍性的。因此建立了一种基于抗坏血酸过氧化物酶活性和ROS代谢产物水平对甘薯耐贮藏特性进行评价的方法，具体包括抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定，再根据测定结果进行耐贮藏特性判定。
实施例1-10：一种甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：包括抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定；
所述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定包括：将甘薯叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，将研磨后的产物加入至酶提取液中得到混合液，将混合液转移到离心管中，在温度为4℃的条件下以速度12000g离心20min；离心后取上清得到粗酶液；然后对抗坏血酸过氧化物酶活性进行测定。
抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定：APX在能够催化H2O2和抗坏血酸(ASA)发生氧化还原反应，使ASA含量减少，H2O2被分解清除，同时反应体系在290nm处吸光值下降。测定时反应体系为3mL，其中含有pH 7.0 50mM磷酸缓冲液，15mM的抗坏血酸及15mM H2O2，还有50μL的粗酶液。以每分钟，吸光度变化0.01个单位作为一个酶活单位(U)，单位是Ug-1 FW。
丙二醛含量的测定包括：将甘薯叶片在液氮下研磨，之后加入质量分数为5％的三氯乙酸继续研磨，4℃的条件下以速度12000g离心10min，取等量的上清液和质量分数为0.67％的硫代巴比妥酸(TBA)溶液混匀，沸水浴15min后，插入冰中冷却并离心，最后分别在600nm、532nm和450nm处测定吸光值；丙二醛含量的计算公式为c(μmol/L)＝6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。
H2O2含量的测定包括：将甘薯叶片在液氮下研磨，加入丙酮后在4℃的条件下以速度12000g离心10min，将上清液移到干净的离心管中；取0.4mL上清液与0.1mL质量分数为5％的硫酸钛和0.2mL浓度为0.91g/cm3的浓氨水吹吸混匀，4℃的条件下以速度12000g离心10min，再向沉淀中加入0.2mL丙酮吹吸混匀，4℃的条件下以速度12000g离心10min，去除上清，之后向沉淀中加入3mL 2mol/L硫酸吹吸，见管底沉淀被完全溶解后，即可在410nm处测定吸光值，根据实验结果制作标准曲线，并计算出H2O2的含量；标准曲线以体系中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL的100μmol/L H2O2，以上述同样步骤进行检测。
超氧阴离子含量的测定包括：将甘薯叶片在液氮下研磨，加入3mL的0.1M，pH7.8磷酸缓冲液再次研磨后使用低温离心机，4℃12,000rmp条件下离心30min，上清即为超氧根阴离子测定液；测定时每个样品分为两组，空白对照组和测定组，取上清液1mL与提取用的磷酸缓冲液1mL和1mM 1mL盐酸羟胺加入两组试管混匀，25℃水浴加热1h，然后分别加入17mM对氨基苯磺酸和7mMα-萘胺1mL，摇匀，25℃水浴20min，于530nm处测定吸光值；同样的条件下制定标准曲线，根据标准曲线的结果，计算出样品中超氧根阴离子的含量。标准曲线以体系中加入0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL的100μmol/L KNO2标准液，相当于0，20，40，60，80，100，120μmol超氧阴离子，以上述同样步骤进行检测进而绘制标准曲线。
以耐贮藏品种徐55-2中生理指标为标准，检测目标甘薯品种的抗氧化酶抗坏血酸过氧化物酶(APX)，如果抗氧化酶活性达到徐55-2中指标的70％以上，且丙二醛含量、H2O2含量和超氧阴离子含量是徐55-2品种中相应指标的120％以下，则可判定该品种是耐储存品种，反之则是不耐贮藏品种。
检测结果如下表。
由以上数据可知，甘薯品种Z15-1为耐贮藏品种，与甘薯块根贮藏实验一致。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (5)

1.一种甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：包括对甘薯叶片进行抗坏血酸过氧化物酶活性的测定，丙二醛含量的测定、H2O2含量的测定和超氧阴离子含量的测定；
以耐贮藏品种徐55-2中生理指标为标准，当待测甘薯品种叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性为耐贮藏品种徐55-2叶片的抗坏血酸过氧化物酶活性的70%及以上，且待测甘薯品种叶片的丙二醛含量、H2O2含量和超氧阴离子含量是耐贮藏品种徐55-2叶片中对应指标的120%及以下，则可判定该品种是耐储存品种，反之则是不耐贮藏品种。
2.根据权利要求1所述的甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：所述抗坏血酸过氧化物酶活性的测定包括：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，接着将研磨后的产物加入至酶提取液中，提取得到混合液，将混合液转移到离心管中，离心后取上清得到粗酶液；然后对粗酶液中的抗坏血酸过氧化物酶活性进行测定。
3.根据权利要求1所述的甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：丙二醛含量的测定包括：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，之后加入质量分数为4-6%的三氯乙酸溶液继续研磨，4oC的条件下以速度12000 g离心10 min，取等量的上清液和质量分数为0.67%的硫代巴比妥酸溶液混匀，沸水浴后，插入冰中冷却并离心，最后分别在600nm、532 nm和450 nm处测定吸光值；丙二醛含量的计算公式为c(µmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450。
4.根据权利要求1所述的甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：H2O2含量的测定包括：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，加入丙酮后进行离心，将上清液、质量分数为5%的硫酸钛和浓氨水混匀，离心去上清后再向沉淀中加入丙酮混匀，再离心去除上清，之后向沉淀中加入硫酸混匀，管底沉淀被完全溶解后，即可在410nm处测定吸光值。
5.根据权利要求1所述的甘薯耐贮藏特性的评价方法，其特征在于：超氧阴离子含量的测定包括：将待测甘薯品种叶片加入研钵中，然后加入液氮进行研磨，加入pH7.8磷酸缓冲液再次研磨后进行离心，上清液即为超氧根阴离子测定液；测定时将超氧根阴离子测定液分为两组，空白对照组和测定组，取上清液1mL与提取用的pH7.8磷酸缓冲液1mL和1mL 的浓度为1mM的盐酸羟胺溶液加入两组试管混匀，25℃水浴加热1h，然后分别加入1mL的浓度为17mM的对氨基苯磺酸和1mL的浓度为7mM的α-萘胺1mL，摇匀，25℃水浴20 min，于530 nm处比色测定。
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