CN112263585B - 原人参二醇ppd在制备治疗不孕和流产药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属医药技术领域，具体是原人参二醇PPD在制备治疗不孕和流产药物中的应用。本发明经体外实验和体内动物试验显示，原人参二醇PPD可明显抑制腹腔巨噬细胞炎性因子的表达、提高子宫内膜容受性相关基因的表达、提高受孕率、增加胚胎总个数以及降低胚胎吸收率，同时PPD不具有肝肾毒性。进一步可用于制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及流产的药物，有很强的实用性，可很好的应用于临床上。

Description

原人参二醇PPD在制备治疗不孕和流产药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是原人参二醇PPD在制备治疗不孕和流产药物中的应用。

背景技术

统计显示，我国社区人群不孕不育症发病率达到10％～15％，自然流产人群发生率同样达10％～15％。多种因素会引发女性不孕和流产，包括生殖内分泌异常、炎症因素、输卵管因素、子宫内膜容受性降低和解剖因素等。

炎性环境影响胚胎着床和妊娠维持。巨噬细胞(macrophage,Mφ)是固有免疫和体液免疫的重要组成细胞，可以识别并吞噬病原体，充当抗原呈递细胞，激活T细胞并在组织再生中起作用。Mφ在增生期占子宫内膜免疫细胞的1-2％，在分泌期占3-5％，在月经期占6-15％。它们在月经期间数量的增加可能归因于它们的吞噬作用特性以及在子宫内膜脱落过程中清除细胞碎片和凋亡细胞的作用。它们还可以促进子宫内膜的再生。持续性活化的Mφ能分泌大量高浓度的促炎细胞因子等，这些对于胚胎着床和妊娠维持是不利的，与不孕和自然流产密切相关。

子宫内膜容受性是胚胎着床和妊娠维持的前体条件。子宫内膜容受性是指母体子宫内膜在特定时间内对胚胎植入的接受能力，这一时期被称为“着床窗口期”。胚胎植入是由众多细胞因子协同发挥作用的结果，包括细胞黏附、侵袭和免疫调节。在月经周期的第一阶段，雌激素(estrogen,E2)的水平升高促进子宫内膜增生。排卵后，黄体化的卵泡分泌的孕激素(progesterone,P4)水平升高促进子宫内膜细胞分化。在这个时间点上，子宫内膜已经成熟并准备号接受胚胎植入。P4诱导子宫内膜整合素表达,而E2则抑制其表达。因而雌孕激素异常表达或敏感性异常均可降低了子宫内膜容受性。容受性不仅不利于胚胎植入，同时与子宫内膜蜕膜化不良及其诱发的自然流产密切相关。

黏附分子如选择素、整合素和钙粘蛋白异常引起子宫内膜容受性下降。排卵后第四天，囊胚进入子宫腔，以滚动的形式在宫腔内移动，选择素(selectins)发挥重要的作用，它可以帮助囊胚的滚动；滋养细胞表达的L-选择素与其在子宫内膜表达的寡糖配体之间的相互作用可能构成植入过程的第一步。虽然关于选择素在胚胎植入过程中的作用我们知之甚少，但是选择素似乎参与了胚胎与子宫内膜相互作用的早期阶段。类似于白细胞在内皮细胞的特定位置停止，囊胚在宫腔内找到最佳位置黏附，以确保囊胚成功植入。整合素αvβ3及其配体骨桥蛋白表达于子宫内膜腔上皮，是最早与滋养层相互作用的分子之一，而且整合素αvβ3被认为是胚胎附着的潜在受体。整合素αvβ3的表达受到正向[如表皮生长因子，肝素结合表皮生长因子(heparin binding-epidermal growth factor-like factor,HB-EGF)及负向(如E2)的调控。有研究表明，第21天整合素mRNA水平可以预测体外受精成功率。与低整合素水平的患者相比，整合素水平正常的患者妊娠率增加了一倍。

其他的细胞因子和生长因子异常也会引起子宫内膜容受性的下降。例如，IL(interleukins,IL)-11和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)同属IL-6家族，在子宫内膜中的表达随胚胎植入呈现短暂性升高，也被认为使子宫内膜容受性的相关标志物。LIF对于胚胎植入起着重要作用。LIF敲除雌性纯合子小鼠中，观察到胚胎植入缺失，但是胚胎是正常的，将这些胚胎植入正常对照小鼠子宫中是可以成功种植在子宫上。对人类子宫内膜样本的检测也同样说明了这一点。在分泌中期的内膜(种植窗口期)，LIF在不孕组的表达明显减弱,而IL-11则几乎不表达，提示不孕患者生育力下降与IL-11和LIF在子宫内膜的表达降低所致的子宫内膜容受性下降有关。

人参作为名贵中药在中国已有五千多年的使用历史，含有多种有效成分，如人参皂苷、多糖、黄酮类化合物、挥发油、氨基酸、维生素等。其中人参皂苷为三萜达玛烷结构的甾体皂苷，具有4环、甾体样结构、糖基偶联，已从人参根中分离得到40多种不同类型的人参皂苷。人参皂苷的化学结构一般分为两组:原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)类和原人参三醇(protopanaxatriol,PPT)类。随着生物活性研究的深入，其在中枢神经、心脑血管、内分泌、免疫系统、抗肿瘤、缓解压力和抗氧化方面的功效已被广泛接受。然而在子宫内膜容受性和生殖系统炎症中的作用尚不清楚。

基于现有技术的现状，本申请拟通过实验研究评估原人参二醇PPD在治疗EMs相关不孕及流产中的潜在价值，提供原人参二醇PPD用于制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及流产药物中的用途，为不孕和流产患者的临床治疗提供新方法和新思路。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供原人参二醇PPD的药用用途，具体涉及的是原人参二醇PPD在制备治疗不孕及流产药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了原人参二醇PPD在制备治疗不孕及流产药物中的应用。

进一步地，本发明提供了原人参二醇PPD在制备治疗不孕及自然流产药物中的应用。

第二方面，本发明提供了原人参二醇PPD在制备抑制腹腔炎症的药物中的应用。

优选地，原人参二醇PPD在制备抑制腹腔巨噬细胞炎性因子表达的药物中的应用。

更优选地，所述的炎性因子包括COX-2、IL-10、IL-12和IFN-γ。

第三方面，本发明提供了原人参二醇PPD在制备促进子宫内膜容受性相关基因表达的药物中的应用。

优选地，所述的相关基因包括Pgr、Esr2、dPrp、Wnt4、Hoxa10、Il-11、Lif、Igfbp1、Prlr、Cebpd、Ihh、Bmp2和Mmp9。

第四方面，本发明提供了原人参二醇PPD在制备降低胚胎吸收率、增加受孕数的药物中的应用。

具体地，本发明通过实验研究发现原人参二醇PPD在体外实验和腹腔炎症动物模型中可明显抑制腹腔炎症，促进子宫内膜容受性相关基因的表达，提高内异症小鼠怀孕率，增加胚胎着床总个数以及降低胚胎吸收率；提供了一种原人参二醇PPD在制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及流产的药物中的用途。

其中，体外实验结果显示，原人参二醇PPD显著增强了子宫内膜容受性相关基因的表达；动物实验显示，腹腔注射PPD可以明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子的表达，上调小鼠子宫内膜容受性相关基因的表达，提高小鼠怀孕率，增加胚胎总个数以及降低胚胎吸收率，同时PPD不具有肝肾毒性。提示该原人参二醇单体进一步可用于制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及流产的药物。

本发明优点在于：

本发明首次发现原人参二醇单体PPD可用于治疗不孕及自然流产。通过构建腹腔炎症动物模型，使用PPD干预，结果表明原人参二醇单体可显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子的表达、对腹腔炎症模型小鼠在位子宫内膜容受性具有促进作用、显著提高腹腔炎症模型小鼠受孕率，增加胚胎总个数，降低胚胎吸收率，且无明显的毒副作用。这提示原人参二醇单体PPD可用于制备治疗不孕及自然流产的药物，为该类患者带来了福音，有很好的应用前景。

附图说明

附图1是腹腔炎症小鼠模型(EMS模型)腹腔巨噬细胞炎性因子表达升高，子宫内膜容受性相关基因表达降低；

其中，Ctrl：假手术组(生理盐水，200uL)

Model：腹腔炎症模型组(子宫内膜碎片悬液，200uL)

IFN-γ：干扰素-γ

Lif：白血病抑制因子

Igfbp1：胰岛素样生长因子结合蛋白1

ns P>0.05,**P<0.01and***P<0.001。

附图2是PPD显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子表达。

其中，Ctrl：对照组，

PPD：PPD处理组(45mg/kg)

COX-2：环氧化酶-2

IL-12：白细胞介素-12

IL-10：白细胞介素-10

IFN-γ：干扰素-γ

ns P>0.05,**P<0.01and***P<0.001。

附图3是PPD促进EMS小鼠在位子宫内膜容受性相关基因表达。

其中，Ctrl：对照组，

PPD：PPD处理组(45mg/kg)

ns P>0.05,*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001。

附图4是PPD促进人子宫内膜基质细胞细胞系(Human endometrial stromal cellline,HESC)内膜容受性相关基因表达。

其中，Ctrl：对照组，

MPA+E2：孕激素(1mM)联合雌激素(1uM)处理组，

PPD：PPD处理组(40uM)，

MPA+E2+PPD：孕激素(1mM)、雌激素(1uM)联合PPD(40uM)处理组，

*P<0.05,**P<0.01and***P<0.001。

附图5是PPD提高EMS小鼠受孕率，增加胚胎着床总个数，降低胚胎吸收率。

其中，Ctrl：对照组，

PPD：PPD处理组(45mg/kg)，

**P<0.01and***P<0.001。

附图6是PPD治疗内异症的安全性分析。

其中，Ctrl：对照组，

PPD：PPD处理组(45mg/kg)

ALT：谷丙转氨酶

BUN：血尿素氮

ns p>0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

本实施例重在构建腹腔炎症模型，验证腹腔炎症模型小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子表达升高，子宫内膜容受性相关基因表达降低，小鼠受孕数降低，胚胎吸收率升高。

1方法

对于腹腔炎症模型鼠的构建，我们首先将健康7周龄雌性BalB/C小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，将供体小鼠子宫取出，剪碎至<1mm的组织碎屑，将其腹腔注射受体小鼠(体积大约为200uL)。对照组为假手术组，腹腔注射相同剂量的生理盐水。建模当日为D0，术后D4常规一批小鼠，然后用PBS灌洗腹腔，收集腹腔灌洗液，离心后收集细胞沉淀，采用流式细胞术分析巨噬细胞炎性因子干扰素-γ(IFN-γ)的表达(所有流式抗体均购于Biolegend公司)。

2结果

结果显示腹腔炎症模型小鼠IFN-γ表达升高(如图1A和1B所示)；同时收集小鼠子宫内膜，采用Rt-PCR技术检测小鼠在位内膜Lif和Igfbp1表达水平，结果显示，腹腔炎症模型小鼠子宫内膜容受性相关基因表达水平降低(如图1C所示)。另外一批小鼠与同种成年雄鼠合笼4天，在合笼后第14天常规处死小鼠，统计小鼠受孕率、胚胎着床总个数以及胚胎吸收率，结果显示小鼠怀孕率无明显差异(如图1D和1E所示)，但是腹腔炎症模型鼠受孕数显著减低以及胚胎吸收率显著上升(如图1E所示)。

实施例2

本实施例通过动物实验验证PPD显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子的表达。

1方法

同实施例1法构建腹腔炎症模型小鼠，建模当日为D0，从术后D4天开始每四天一次腹腔注射PPD(45mg/kg)或者生理盐水对照(100uL)。术后D32天常规处死小鼠，用PBS灌洗腹腔，收集腹腔灌洗液，离心后收集细胞沉淀，采用流式细胞术分析巨噬细胞炎性因子环氧化酶-2(COX-2)，白细胞介素-12(IL-12)，白细胞介素-10(IL-10)，干扰素-γ(IFN-γ)的表达(所有流式抗体均购于Biolegend公司)。

2结果

结果显示，PPD处理可以显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性因子表达，降低腹腔炎症(如图2所示)。

实施例3

本实施例通过动物实验验证PPD对腹腔炎症模型小鼠在位子宫内膜容受性具有促进作用。

1方法

同实施例1法构建腹腔炎症模型小鼠，建模当日为D0，从术后D4天开始每四天一次腹腔注射PPD(45mg/kg)或者生理盐水对照(100uL)。术后D32天常规处死小鼠，收集小鼠子宫提取RNA，利用Rt-PCR技术检测小鼠在位内膜Pgr、Esr1、Esr2、dPrp、Wnt4、Hoxa10、Il-11、Lif、Igfbp1、Prlr、Cebpd、Ihh、Bmp2、Mmp2和Mmp9的表达(所有的引物均购于生工生物公司)。

2结果

结果显示，PPD可以抑制Esr1和Mmp2的表达，相反显著升高其余子宫内膜容受性相关基因的表达(如图3所示)。

实施例4

本实施例通过体外实验证明PPD对HESC子宫内膜容受性具有促进作用。

1方法

在体外，用孕激素(1mM)联合雌激素(1uM)处理组，PPD处理组(40uM)，孕激素(1mM)、雌激素(1uM)联合PPD(40uM)处理组，以溶媒为对照(1‰DMSO)(所有试剂均购于Sigma)，处理6天后，收集RNA，利用Rt-PCR技术检测BMP2、PGR、ESR1、ESR2、IHH、PTGS2、IGFBP1、HOXA10、PRL、LIF、WNT4和MMP2的表达。

2结果

结果显示，与对照组、MPA+E2以及MPA+E2+PPD相比，PPD可以显著上调上述子宫内膜容受性相关基因的表达(如图4所示)。

实施例5

本实施例通过动物实验验证PPD显著提高腹腔炎症模型小鼠受孕率，增加胚胎总个数，降低胚胎吸收率。

1方法

同实施例1法构建腹腔炎症模型小鼠，建模当日为D0，从术后D4天开始每四天一次腹腔注射PPD(45mg/kg)或者生理盐水对照(100uL)；术后D32天停药4天，再与正常同种雄鼠合笼4天，在合笼后第14天常规处死小鼠，统计小鼠受孕率、胚胎着床总个数以及胚胎吸收率。

2结果

小鼠受孕率、胚胎着床总个数以及胚胎吸收率如图5A、5B和5C所示，结果表明，PPD可以显著提高腹腔炎症模型小鼠受孕率(如图5B所示)，增加小鼠受孕数以及降低胚胎吸收率(如图5C所示)。

实施例6

本实施例旨在通过动物实验对PPD治疗腹腔炎症的安全性分析。

1方法

同实施例1法构建腹腔炎症模型小鼠，建模当日为D0，从术后D4天开始每四天一次腹腔注射PPD(45mg/kg)或者生理盐水对照(100uL)；术后D32天常规处死小鼠，收集小鼠血清，肝脏和肾脏。将小鼠肝脏和肾脏做成石蜡切片，采用HE染色观察肝脏和肾脏组织炎性细胞浸润情况，收集小鼠血清通过全自动生化分析仪分析ALT和BUN水平。

2结果

如图6A所示为HE染色观察肝脏和肾脏组织炎性细胞浸润情况，如图6B所示为小鼠血清通过全自动生化分析仪分析ALT和BUN水平，结果发现PPD不具有肝肾毒性，对于腹腔炎症的治疗是安全有效的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.原人参二醇PPD在制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及流产药物中的应用。

2.原人参二醇PPD在制备治疗炎症和子宫内膜容受性不良相关不孕及自然流产药物中的应用。

3.原人参二醇PPD在制备抑制腹腔炎症的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，原人参二醇PPD在制备抑制腹腔巨噬细胞炎性因子表达的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的炎性因子包括COX-2、IL-10、IL-12和IFN-γ。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，原人参二醇PPD在制备促进子宫内膜容受性基因表达的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的基因包括Pgr、Esr2、dPrp、Wnt4、Hoxa10、Il-11、Lif、Igfbp1、Prlr、Cebpd、Ihh、Bmp2和Mmp9。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，原人参二醇PPD在制备降低胚胎吸收率、增加受孕数的药物中的应用。

Images