CN112190578A - 植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，在本发明中，选择了三种具有最高结合亲和力的植物化合物表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯，白蛋白素和黑色素来对由大鼠秋水仙碱的集中给药诱导的阿尔茨海默氏病进行研究，通过计算机仿真模拟分子对接，获取了植物化合物对接四种蛋白AChE，AKT‑1，BACE‑1和COX‑2的核心结构部分，证明了与AD有关的这四种蛋白均可用作潜在靶标。表没食子儿茶素‑3‑没食子酸酯，白蛋白素和黑色素不仅具有潜在的抗炎，抗氧化和抗胆碱酯酶特性，而且还可以抑制ROS升高，保护大脑免受tau过度磷酸化，Aβ斑块沉积，可以用作预防和治疗AD的潜在药物。

Description

植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease，AD)是一种不可逆的，异质性和进行性神经退行性疾病，其特征是认知障碍和行为障碍。其病理症状表现为细胞外出现淀粉样斑块，神经原纤维缠结(NFT)的细胞内积累，突触的丧失，神经炎症和氧化应激(OS)。
据统计，阿尔茨海默症已知影响全球约3500万人，预测显示，到2050年，AD的发病率预计每年将影响上百万人，患病人数将达到1100万至1600万人。近年来的研究表明，AD患者脑部神经细胞外存在大量淀粉样蛋白斑沉积及胞内神经纤维高度缠结，其中，淀粉样蛋白斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)，而高度缠结的神经纤维的主要成分则是过度磷酸化的tau蛋白(一种微管相关蛋白)。Aβ是β-淀粉样前体蛋白(β-amyloidprecursor protein,APP)先后经β、γ-分泌酶剪切的产物，β-淀粉样前体蛋白是一种重要的膜蛋白，包含单个域，一个较长的胞外N端和一个较小的胞质C端。处于上游的β-分泌酶(βamyloid cleaving enzyme 1，BACE-1)是治疗AD的关键靶点，因此抑制BACE-1是防治AD的重要途径。另一方面，蛋白磷酸激酶与蛋白磷酸酯酶的调节失衡，直接导致了阿尔茨海默病样tau蛋白的过度磷酸化，tau蛋白过度磷酸化和tau蛋白异常聚集所形成的神经原纤维缠结促使活性氧(ROS)产生，造成神经元损伤，最终导致神经元的凋亡，影响学习和记忆缺失，因此，抑制Tau蛋白的过度磷酸化和修复受损神经元成为有希望治疗AD的方法。
AD分为两种类型，与年龄相关的散发性AD，以及由于基因突变而引起的家族性早发性AD(FAD)。APP和Aβ-42在散发性AD中积累的主要原因不清楚，但与氧化应激有关。氧化应激生物标志物升高会在大脑中产生压力，AD中已显示出许多氧化应激的血液生物标志物，涉及蛋白质羰基化合物和3-硝基酪氨酸，8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)，8-羟基鸟苷(8-OHG)，丙二醛(MDA)，4-羟基壬烯醛(4-HNE)和F2-异前列腺素(F2-IsoPs)。Aβ和OS彼此相关，因为Aβ在体内和体外均可增加OS，而OS也可提高Aβ的形成。此外，OS增强了体内分泌酶的活性和BACE-1的表达。如所述的Aβ诱导的氧化应激在痴呆症发病机理中的作用，考虑到以抗氧化剂疗法为代表的一种预防方法，该方法通过引入内源性抗氧化剂阻止了ROS升高的破坏作用。新的AD替代疗法亟需解决，据资料显示，天然化合物对神经元细胞具有神经保护作用。
植物化合物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，白蛋白素(Albeginin)和黑色素(Melanoxetin)是否存在潜在功效，为制备预防和治疗阿尔茨海默症药物提供可能性，还未有相关资料报道。
发明内容
本发明的目的在于提供植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
进一步的，植物化合物为酚类植物化合物。
进一步的，植物化合物包括没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素。
进一步的，植物化合物作为抑制剂阻止ROS的升高。
进一步的，接受没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素联合疗法的大鼠体内氧化应激标志物和炎症标志物的减少水平优于单一疗法。
进一步的，在分子对接中，AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2为靶标蛋白。
进一步的，选择AChE和BACE-1的蛋白复合模型用于分子动力学模拟。
本发明的有益效果是：
在本发明中，对几种含有不同活性基团的植物化合物质进行了分子对接研究，选择了三种具有最高结合亲和力的植物化合物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素来对由秋水仙碱集中给药诱导的阿尔茨海默氏病大鼠进行研究，证实表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白和黑素具有抗胆碱酯酶活性。
通过计算机仿真模拟分子对接，获取了植物化合物对接四种蛋白AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2的核心结构部分，证明了与AD有关的这四种蛋白均可用作潜在靶标。通过分子动力学模拟，确定了对接复合物的稳定性。
酚类植物化合物，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素不仅具有潜在的抗炎，抗氧化和抗胆碱酯酶特性，而且还可以抑制ROS升高，保护大脑免受tau过度磷酸化，Aβ斑块沉积。综上所述，植物化合物表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素可以用作预防和治疗AD的潜在药物，为AD的预防和治疗提供了一种新思路。
附图说明
图1为配体2D结构图。(a)白蛋白素2D结构图，(b)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯2D结构图，(c)黑色素2D结构图
图2为三种植物化合物与AChE靶蛋白对接复合物3D结构图。(A)白蛋白素与AChE靶蛋白对接复合物3D结构图，(B)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与AChE靶蛋白对接复合物3D结构图，(C)黑色素与AChE靶蛋白对接复合物3D结构图
图3为三种植物化合物与AKT-1靶蛋白的对接复合物3D结构图。(A)白蛋白素与AKT-1靶蛋白的对接复合物3D结构图，(B)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与AKT-1靶蛋白的对接复合物3D结构图，(C)黑色素与AKT-1靶蛋白的对接复合物3D结构图
图4为三种植物化合物与BACE-1靶蛋白的对接复合物3D结构图。(A)白蛋白素与BACE-1靶蛋白的对接复合物3D结构图，(B)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与BACE-1靶蛋白的对接复合物3D结构图，(C)黑色素与BACE-1靶蛋白的对接复合物3D结构图
图5为与三种植物化合物与COX-2靶蛋白的对接复合物3D结构图。(A)白蛋白素与COX-2靶蛋白的对接复合物3D结构图，(B)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯与COX-2靶蛋白的对接复合物3D结构图，(C)黑色素与COX-2靶蛋白的对接复合物3D结构图
图6为50ns MD模拟运行期间，BACE-1氨基酸残基和所有对接结构的均方根偏差(RMSD)
图7为50ns MD模拟运行期间，AChE氨基酸残基和所有对接结构的均方根偏差(RMSD)
图8为50ns内BACE-1氨基酸残基和所有对接结构的均方根均方根波动(RMSF)
图9为50ns内AChE氨基酸残基和所有对接结构的均方根均方根波动(RMSF)
图10为50ns内BACE-1氨基酸残基和所有对接结构的回转半径(Rg)
图11为50ns内AChE氨基酸残基和所有对接结构的回转半径(Rg)
图12为植物化合物对秋水仙碱诱导的大鼠毒性影响图
图13为大鼠模型中白蛋白素，黑色素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的生化反应结果图
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。实验中未详述的试验操作均为本领域技术人员所熟知的常规试验操作。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。在一些实施例中，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例所用原料：分析级的表没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素从美国Sigma-Aldrich获得，用于分析目的和实验结果。
配体的2D结构如图1所示。
实施例1，选定化合物的药代动力学分析
使用admetSAR服务器计算所选植物化合物的ADMET性质。在吸收方面，选择两个参数，血脑屏障(BBB)渗透和人体肠道吸收(HIA)。总体预测结果如表1所示，证明了它们良好的ADMET行为是合理的，这表明它们有可能被用作特定疾病的靶标。
表1植物化合物的ADMET分布计算
Figure BDA0002752048530000041
实施例2，植物化合物的化学信息学分析
通过计算方法评价植物化合物的化学信息学性质。结果显示，三种化合物白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素有更好的分子量预测值。化合物的分子量也与标准值相当。表2列出了所有化合物的总体预测值。
表2 3种植物化合物的药物相似性分析
性能 白蛋白素 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 黑色素
分子量(g/mol) 458.37 302.23 426.67
脂水分配系数值(LogP) 2.23 1.98 7.10
氢键供体个数(HBA) 11 7 2
氢键受体个数(HBD) 8 5 1
PSA(A<sup>2</sup>) 197.37 131.36 37.300
RO5 2 0 1
原子 51 32 77
Rings 4 3 5
实施例3，蛋白质序列的检索、结构预测和蛋白质模型的结构分析
在本发明中，有14种与AD相关的蛋白，乙酰胆碱酯酶(AChE)，RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT-1)，β-分泌酶-1(BACE-1)，环氧合酶2(COX-2)，Caspase-3，糖原合酶激酶3(GSK-3)，白介素6(IL-6)，丝裂原活化蛋白激酶2(MAPK-2)，基质金属蛋白8(MMP-8)，N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR)，肽基精氨酸脱亚氨酶2(PAD-2)，早老素1(PSEN-1)，促分裂原活化蛋白激酶14(MAPK-14/P38)和肿瘤坏死因子(TNF-α)，这14种蛋白质用作靶分子。蛋白质的氨基酸序列AChE，AKT，BACE-1，COX-2，Caspase-3，GSK-3，IL-6，MMP-8，PAD-2，PSEN-1，MAPK-14和TNF-alpha分别从UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)中以FASTA格式检索，其登录号分别为P37136，P47196，P56819，P35355，P55213，P18266，P20607，P20717，P97887和P70618。对所有14种蛋白质进行计算分析，选择最合适的模板，3D结构的预测通过基于线程和同源性的建模方法进行。此外，使用MODELLER v9.18和I-TASSER对结果进行确认和交叉验证。
使用不同的验证工具ERRAT，Rampage和Verify3D分析预测模型的结构可靠性。用ERRAT评估3D结构的总体质量因子，拉式图提供有关蛋白质结构的有利，不利和较复杂的区域的信息。最终选择的蛋白质结构是使用Amber力场参数使用1000个最陡峭和1000个共轭梯度运行进行能量最小化的。
实施例4，配体设计和分子对接
选定的植物化合物,，包括白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素在ChemDraw软件中进行了缩酮化。这些化合物的精制和几何优化分别通过Chem3D Pro和UCSFChimera v1.12进行分析。分别从在线服务器mCule和admetSAR计算化合物的相似性和ADMET吸收，分布，代谢，排泄和毒性特性，结果如表1所示。分别对三种植物化合物白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素在1500步最陡和共轭梯度步骤进行能量最小化。最后，使用AutoDock-Vina针对最小化的植物化合物和14种选定的靶向蛋白进行对接实验。通过选择结合口袋来固定所有蛋白质的网格框值。在每个对接分析中，调整100次运行以生成对接复合体，在结合能的基础上分析产生的对接复合物。基于最小能量值和键相互作用模式检查所有生成的对接配合物。根据计算机模拟结果，选择四个主要目标AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2来评估所选化合物的结合相互作用，在结合相互作用行为的基础上进一步分析对接的复合物。此外，还针对最佳选择的蛋白质的所有三个配体观察到了靶蛋白质活性位点内的结合构象。UCSF Chimera v1.12和Discovery Studio 2017对停放的复合物的图形描述进行调查和可视化。
对接结果证明，植物化合物白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素分别具有良好的对接能值，如表3所示，，四种蛋白AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2在对接结果中具有良好的能量值。
表3针对14种靶向蛋白质的AUTODOCK抗原的结合亲和力计算
靶标蛋白 白蛋白素 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯 黑色素
AChE -10.5 -11.5 -9.9
AKT-1 -10.3 -11.6 -10.2
BACE-1 -10.7 -11.9 -9.3
COX-2 -9.8 -11.0 -10.5
Caspase-3 -8.5 -8.1 -7.5
GSK-3 -8.5 -8.2 -8.5
IL-6 -8.2 -8.1 -7.9
MAPK-2 -8.3 -8.4 -7.2
MMP-8 -7.9 -7.8 -7.9
NMDAR -8.6 -7.9 -7.7
PAD-2 -9.4 -8.9 -8.2
PSEN-1 -11.2 -8.1 -7.7
P-38 -8.2 -9.2 -8.6
TNF-α -10.0 -7.0 -6.7
如图2所示，三种植物化合物白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素牢固地结合在AChE的活性位点内，并分别具有-10.5，-11.5，-9.9Kcal/mol的良好对接能值。
如图2(A)所示，在白蛋白素-AChE对接复合物中，在键距分别为
Figure BDA0002752048530000061
和
Figure BDA0002752048530000062
的Glu323和Tyr373上观察到了一对疏水相互作用。如图2(B)所示，在表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-AChE对接复合物中，在Glu323，Ser324和Thr106处观察到3个氢键，其键长分别为
Figure BDA0002752048530000063
和
Figure BDA0002752048530000064
如图2(C)所示，在黑色素-AChE对接中，Ser324和Ile325出现两个氢键，键长分别为
Figure BDA0002752048530000065
和
Figure BDA0002752048530000066
在前两个对接结果中，Glu323在绑定相互作用模式中都很常见，这确保了我们对接结果的准确性。
如图3所示，针对AKT-1，白蛋白素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素分别具有-10.3，-11.6和-10.2Kcal/mol的良好对接能值。
如图3(A)所示，在白蛋白素-AKT-1对接复合物中，在Lys276处观察到单个氢键，键距为
Figure BDA0002752048530000071
如图3(B)所示，在表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-AKT-1对接复合物中，在Glu324，Leu155，Asn279，Glu278和Lys158上观察到5个氢键，键长分别为
Figure BDA0002752048530000072
Figure BDA0002752048530000073
和
Figure BDA0002752048530000074
如图3(C)所示，在黑色素-AKT-1对接复合物中，在Thr291，Asn279，Lys297处观察到三个氢键，其键距分别为
Figure BDA0002752048530000075
和
Figure BDA0002752048530000076
氢键的数量加强了对接复合物的稳定性，我们的对接结果预示了对接复合物的良好稳定性。
如图4所示，为BACE-1和与植物化合物质的相互作用，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素结合在BACE-1的活性位点内，分别具有-10.5，-11.5，-9.9Kcal/mol的良好对接能值。
如图4(A)所示，在白蛋白素-BACE-1对接复合物中，在Pro44，Leu39和Ala218处观察到三个疏水相互作用，键距分别为
Figure BDA0002752048530000077
和
Figure BDA0002752048530000078
如图4(B)所示，在表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-BACE-1对接复合物中，在His423，Leu34和Glu226处观察到3个氢键，键距分别为
Figure BDA0002752048530000079
和
Figure BDA00027520485300000710
如图4(C)所示，在黑色素-BACE-1对接复合物中，在Ser243和Arg45处观察到2个氢键，键距分别为
Figure BDA00027520485300000711
和
Figure BDA00027520485300000712
如图5所示，对COX-2而言，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素结合在COX-2的活性位点内分别具有-9.8，-11.0和-10.5Kcal/mol的良好对接能值。
如图5(A)所示，在白蛋白素-COX-2对接复合物中，在Thr181和Lys180处观察到两个氢键。键距分别为
Figure BDA00027520485300000713
和
Figure BDA00027520485300000714
如图5(B)所示，在表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-COX-2对接复合物中，在Thr81和Gln423处观察到2个氢键，键距分别为
Figure BDA00027520485300000715
和
Figure BDA00027520485300000716
如图5(C)所示，在黑色素-COX-2对接复合物中，在Thr81，Phe179和Ala168处观察到三个氢键，键距分别为
Figure BDA00027520485300000717
和
Figure BDA00027520485300000718
对比分析表明，在所有最佳靶向蛋白对接复合物中，大多数残基在配体相互作用中很常见。如表4所示，显示所有对接复合物的结合口袋残基。在AChE对接复合物中，两个对接残基Tyr-103和Trp-317都是常见的。此外，在所有三种AKT-1对接复合物中，Leu-155，Lys-158，Glu-278，Asn-279和Lys-297氨基酸在结合口袋的共同区域相互作用。BACE-1蛋白在所有三个对接复合物中均显示单个共同残基Pro-44。在COX-2对接中，大多数残基是常见的His-176，Phe-179，Thr-181，Tyr-354，His-357和Val-416，常见的残留物表明了我们对接结果的可靠性和有效性。
表4 4种蛋白质的对接复合物的结合口袋残基
Figure BDA00027520485300000719
Figure BDA0002752048530000081
通过对比分析表明，与其他受体相比，AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2均可用作潜在靶标。
实施例5，分子动力学模拟
为了确定蛋白质-配体复合物的构象和过渡稳定性，进行分子动力学研究。选择AChE和BACE-1的模型用于分子动力学模拟。蛋白质的操纵和质子化是通过GROMOS96力场完成的。GROMACS(用于化学模拟的格罗宁根机)模拟程序包5.1.4用于分子动力学模拟和程序。为了观察所选配体对各个蛋白质的作用，针对两个受体建立具有对照的系统。使用PRODURG服务器对两种受体的配体进行了参数化。MOE和VMD用于蛋白质和配体的可视化和分子检查。使晶体结构溶剂化，并加入抗衡离子Na+(7和12个原子)以分别中和AChE和BACE-1。此外，完成了系统的能量最小化，然后使用两个连续的NVT(100ps)和NPT(100ps)运行来平衡系统。
最小化后，将所得的复合物进行50ns的MD模拟，每个模拟的时间步长为2fs。周期性边界条件PBC用于所有模拟。最陡下降法用于简单的能量最小化。所有NVT和NPT使用Berendsen温控器和Parrinello-Rahman恒压器温度，303K和压力偶合，1.01bar。隔断观察到
Figure BDA0002752048530000082
无线电和平滑的Mesh Mesh Ewald协议方法。每5ns保存一次轨迹以进行分析。使用XMGRACE v5.1.19绘制蛋白质骨干和侧链的均方根偏差(RMSD)，氨基酸残基的均方根波动(RMSF)和蛋白质骨架的回转半径(Rg)。
如图6所示，在评估过程中，BACE-1的RMSD图表明，在动态模拟开始时，系统是稳定的，而随着时间的流逝，注意到白蛋白素-BACE-1复合物已稳定下来，而表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和黑色素对蛋白质的稳定性较差。黑色素-BACE-1复合物在21到27ns内不稳定，一段时间后发现稳定。然而，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-BACE-1复合物在23-26ns和29-32ns以及45-48ns期间不稳定。BACE-1在50ns内变得比BACE-1同源复合物更稳定。白蛋白素-BACE-1复合物显示出相似的行为，并且在50ns MD运行期间显示出比其他2个配体更高的稳定性。
如图7所示，当观察到AChE的RMSD图时，轨迹在仿真过程中仅显示出很小的漂移。在仅载脂蛋白和蛋白质-配体复合物的整体结构中可能的构象变化中观察到偏差和灵活性。在39–42ns的时间内，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯-AChE复合物有适度的跳跃，之后发现该系统在蛋白质抑制剂的轨迹中是稳定的。此外，由于该蛋白质的活性位点内广泛的氢键网络，发现该系统稳定。
蛋白质BACE-1和AChE与所选植物化合物的残基都以蛋白质的载脂蛋白形式和整体状态进行了分析。如图8和图9所示，给出了50ns的蛋白质和蛋白质-配体复合物的RMSF图。如图8所示，从载脂蛋白的RMSF图中可以看出，BACE-1稳定且波动较小。然而，当监测载脂蛋白+抑制剂/配体复合物的残基时，在各种残基处观察到波动增加。蛋白质与黑色素复合的情况最明显。然而，与白蛋白素复合的蛋白质是稳定的，从1到300个氨基酸观察到较小的波动，但此后观察到更多的波动，几乎没有稳定性。如图9所示，当考虑到AChE载脂蛋白形式和与所选植物化合物的复合物的RMSF时，从40个氨基酸到100个氨基酸，波动更大。含有氨基酸编号289-302和500-535的区域，AChE-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯复合物在52-78个残基数区域不稳定。与其他2种配体相比，使用黑色素时，AChE的波动较小。
如图10所示，Rg图分析并显示了蛋白质活性口袋中选定的对接位姿的结构稳定性。BACE-1的Rg图表明，与载脂蛋白相比，在植物化合物存在下蛋白的稳定性均得到增强，BACE-1蛋白的完整Rg值与植物化合物-蛋白的复合物在2.25至2.34nm之间。如图11所示，直到24ns为止，AChE载脂蛋白和植物化合物-蛋白复合物都显示出相似的模式，但是此后，发现该系统不稳定，并且在复合物结构中发现了波动。AChE复合物和蛋白质的Rg值在2.24至2.35nm之间。
实施例6，实验研究
在6-8周龄的Sprague Dawley大鼠上进行体内研究。将这些大鼠分为11个不同的组，分别标记为A，B，C，D，E，F，G，H，I，J和K。-ICV注射溶解于ACSF中的秋水仙碱15μg/大鼠，(7.5μg，5μl/部位)，使用Hamilton微型注射器向大鼠的侧脑室两侧注射。为了对大鼠进行麻醉，将戊巴比妥钠(45mg/kg)用于立体定位仪中。反射中线的矢状切口并在颅骨上打孔，以将注射剂放置在脑侧脑室中，并向大鼠给予术后抗生素(庆大霉素5mg/kg，腹膜内)。通过使用Hamilton微型注射器来施用秋水仙碱。将新孢菌素粉末从外部喷洒，并使用无菌蜡封住伤口。
对照组被标记为A组，未给予秋水仙碱治疗。B组接受秋水仙碱治疗，但未给予其他治疗。C-J组接受了计算机化学筛选后选择的植物化合物处理。J组除植物化合物质外还给予维生素D3，而K组大鼠则联合给予秋水仙碱和
Figure BDA0002752048530000101
口服(100mg.kg)植物化合物的单药和联合疗法，为期三周。然后收集血样，离心，并保存在-80℃下直至进一步分析。
表5实验设计
Figure BDA0002752048530000102
ICV注射溶解于ACSF中的秋水仙碱15μg/大鼠(7.5μg，5μl/部位)，使用汉密尔顿微注射器双向注入侧脑室。接受白蛋白素，黑色素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(100mg/kg B.Wt./天)六个月。皮下每天42IU/kg的维生素D3(1，25-二羟基胆钙化固醇)(1，25(OH)2D3)连续三周。
Figure BDA0002752048530000103
(2.5mg/Kg B.Wt/天)一个月。
如图12所示，显示了植物化合物对秋水仙碱诱导的大鼠毒性的影响，其显示了不同器官的细胞明显的髓鞘形成。如图12(A)所示，对照大鼠大脑皮层的内颗粒层营养神经元显示少突胶质细胞和深色的核，脑皮质显示神经孔，深色核和少突胶质细胞。如图12(B)所示，接受溶解于ACSF 15μg/大鼠(7.5μg，5μl/部位)的秋水仙碱的-ICV注射的大鼠显示多灶性坏死，在大脑中可见突出的血管。如图12(C)所示，在接受白蛋白素(100mg/kg B.Wt./天)六个月的大鼠中，发现小脑白质中浦肯野细胞坏死，也观察到血管周围的袖带。如图12(D)所示，接受黑色素(100mg/kg B.Wt./天)六个月的大鼠中，可以看到在小脑细胞核中并了扩展的液泡，神经元肿胀，苍白，细小，囊泡状细胞质。如图12(E)所示，接受表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(100mg/kg B.Wt./天)六个月的大鼠显示，髓鞘中的液泡无神经元变化和反应性反应，大小不等的液泡散布在小脑中。如图12(F)所示，在接受白蛋白素和黑色素(100mg/kg B.w.t./day)六个月的大鼠小脑中，发现浦肯野细胞坏死，毛细纤维蛋白血栓和外溢性红细胞，病变包括明显的分子层和浦肯野细胞层空泡化。如图12(G)所示，接受白蛋白素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(100mg/kg B.Wt./天)六个月的大鼠，表现出浦肯野细胞层明显空泡和轻度脱髓鞘，在白质中还发现了血管周围的淋巴细胞套扎。如图12(H)所示，接受黑色素和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(100mg/kg B.Wt./天)六个月的大鼠显示，小叶和小脑的远端区域坏死，小脑乔木中白质脱髓鞘。如图12(I)所示，接受秋水仙碱和白蛋白素+黑色素+表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(100mg/kg B.Wt./天)的大鼠，小脑几个叶面的远端区域是正常的，小脑叶具有外部生发层，分子层，浦肯野细胞层和颗粒细胞层，散布着深色的正常浦肯野细胞。如图12(J)所示，在接受(100mg/kg Bwt/天)的白蛋白素，黑色素，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(42IU/kg B.Wt/天)的维生素D3三周的大鼠可看见其修复细胞层和远端区域，以及白质。如图12(K)所示，接受(2.5mg/Kg B.Wt/天)一个月
Figure BDA0002752048530000111
的大鼠显示出完整的液泡和对神经元变化的反应性反应，并且小脑中的红细胞破裂减少。
实施例7，体内研究
本发明还研究了植物化合物对AD大鼠模型生化参数的个体以及协同作用。通过苏木精和曙红染色将组织储存在甲醛中后，观察到不同器官的组织病理学变化。将大鼠不同器官的切片保存在福尔马林溶液中。切下每组的肝和肾切片，并将其浸入浓缩的福尔马林中两个小时。每个样品在“自动组织处理器”中进行处理。自动组织处理器包含12个罐，两个福尔马林，四个罐丙酮，四个罐二甲苯和两个罐石蜡。标本在每个广口瓶中放置大约两个小时，因此该过程可以在24小时内完成。来自组织处理器的标本被“阻塞”。出于封闭目的，将样品放入块状盒子中并填充蜡。放在冰箱中冷却，以更好地让切片机切割。用切片机将试块(试样+蜡)切成5μm的切片。首先将切片置于冷水中，然后置于热水中并固定在载玻片上。载玻片上涂有蛋清和甘油混合物的薄膜。这种涂层有助于组织固定在幻灯片上。将载玻片放置在温度为500℃的烤箱中，将载玻片放置10-15分钟，当将载玻片完全脱蜡时，将载玻片放置在放置在烤箱中的二甲苯罐中，在该过程中，蜡从组织中完全除去，载玻片被染色。将玻片浸入无水乙醇罐中2分钟，用水洗涤，置于苏木精染色中2分钟，然后再次洗涤，将玻片置于酸性酒精中20-30秒，并用水洗涤。然后将洗涤后的载玻片放在曙红染色罐中2分钟。
用植物化合物处理后，通过使用市售的Elisa试剂盒分析血清样品中的生物标志物4-HNE，8-OHdG，IsoP-2α，COX-2，ACHE，ALT，MMP-8，TGF-β，TAS，IL-6，AChE，Aβ，PAD-2，β-分泌酶，γ-分泌酶，GSK3β，谷氨酸，高半胱氨酸和Caspase-3。使用SPSS v.21进行独立的T检验和Pearson相关，结果以Mean±S.D表示，其中p<0.05显示显着结果，结果如图13所示。
秋水仙碱治疗后的B组血清循环水平的Aβ(pg/ml)，β-分泌酶(ng/ml)，γ-分泌酶(ng/ml)，AChE(pg/ml)和PAD2(pg/ml)的水平较A组显着升高，均升高两倍以上，分别为613.08±18.33、1.66±0.12、1.88±0.61、3.89±0.956和9.37±2.35，但在组合使用植物化合物的G，H，I，J和K组中观察到较B组相比显着减少。在接受秋水仙碱的大鼠B组中观察到4-HNE(ng/l)，8-OHdG(pg/ml)，MDA(nmol/ml)，IsoP-2α(pg/ml)和COX-2(ng/ml)的氧化应激标志物水平升高，分别为16.58±3.56、31.88±6.35、12.35±3.59、102.58±8.78和4.26±1.08，植物化合物处理后的C，D，E，F，G，H，I，J和K组相较于B组，氧化应激指标4-HNE，8-OHdG，MDA，IsoP-2α和COX-2的水平均降低，在I，J和K组中，氧化应激标志物的水平降低明显，但是在组合使用植物化合物质的I组中，观察到最大程度的降低。秋水仙碱处理后记录到兴奋性神经递质NO(μmol/L)和iNOS(IU/ml)的血清循环浓度较高，分别为16.26±3.29和55.56±6.35，并在接受植物化学药物组合的I组中记录到最大减少量。同样，秋水仙碱治疗后炎症生物标志物TNF-α(pg/ml)，IL-6(pg/ml)，TGF-β(μmol/ml)和MMP-8(pg/ml)的在I组的水平最大程度减少，分别为21.88±4.17、12.16±4.29、14.23±3.07和40.29±5.66。
由以上可知，对于生化参数，氧化应激标志物和炎症生物标志物，在接受单一疗法和联合疗法的组中观察到显着降低，但是使用联合疗法的I组在所有组中显示最大程度的降低。

Claims (7)

1.植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，植物化合物为酚类植物化合物。
3.根据权利要求1或2所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，植物化合物包括没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素。
4.根据权利要求1所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，植物化合物作为抑制剂阻止ROS的升高。
5.根据权利要求1所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，接受没食子儿茶素-3-没食子酸酯，白蛋白素和黑色素联合疗法的大鼠体内OS和炎症标志物的减少水平优于单一疗法。
6.根据权利要求1所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，在分子对接中，AChE，AKT-1，BACE-1和COX-2为靶标蛋白。
7.根据权利要求1所述的植物化合物在制备预防和治疗阿尔茨海默症药物中的应用，其特征在于，选择AChE和BACE-1的蛋白复合模型用于分子动力学模拟。
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US20120009288A1 (en) * 2009-06-08 2012-01-12 National Taiwan University Use of acacia extracts and their compounds on inhibition of xanthine oxidase

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