CN112166191A - 经修饰的寡核苷酸及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了用于降低耐药性的方法和组合物。描述了用于减少m6A RNA甲基化的药剂。还描述了包含所述药剂的组合物、制备所述药剂的方法，以及使用所述药剂来降低有需要的受治疗者的耐药性或刺激免疫应答的方法。
Description
技术领域
本公开涉及药剂，包括寡核苷酸，诸如2'-氟-腺苷修饰的RNA寡核苷酸，并且涉及降低用药物治疗的受治疗者的耐药性的方法。本发明还涉及降低用抗病毒活性剂治疗的受治疗者的耐药性的方法，以及通过刺激免疫应答治疗牵涉I型免疫应答的病症的方法。还描述了包含寡核苷酸的缀合物或组合物、制备寡核苷酸的方法，以及使用寡核苷酸、其缀合物或组合物来降低受治疗者的耐药性或治疗牵涉I型免疫应答的病症的方法。
以电子方式提交的参考序列表
本专利申请含有序列表，该序列表以电子方式经由EFS-Web作为ASCII格式化序列表提交，文件名为“ALP0057WOPCT1 Sequence Listing”，创建日期为2019年3月21日，并且大小为4.0KB。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
耐药性可能是一个严重的问题，尤其是对用于治疗病毒感染的药物的抗性。治疗病毒感染的主要问题是感染后耐药变体的快速出现。流感是可以引起严重呼吸道疾病、导致器官衰竭的炎症以及最终死亡的RNA病毒。由于没有针对RNA中的错误的修复机制，流感病毒和其它RNA病毒具有高突变率，并且由于牵涉由病毒聚合酶引入的突变的抗原性转变与牵涉人体中逃脱现有的抗体介导的免疫应答的病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白内生成的抗原变体的抗原性转变的组合而出现季节性流感病毒(Iwasaki等人,NatureReviews Immunology,2014)。
流感病毒的治疗靶标包括聚合酶复合物的组分，即PA、PB2和PB1；M2通道；和神经氨酸酶NA。神经氨酸酶抑制剂是主要类别的抗流感药品。靶向NA的药物的示例包括奥司他韦和扎那米韦。扎那米韦通过与NA蛋白的活性位点结合而起作用，致使流感病毒无法逃脱其宿主细胞，而奥司他韦是NA的竞争性抑制剂。虽然奥司他韦和扎那米韦是治疗流感的有效疗法，但是在用这些药物中的任一种治疗的患者中都可出现耐药性(Colman,Annu.Rev.Biochem.,2009)。由耐受神经氨酸酶抑制剂的流感病毒引起的大流行病是一种严重的威胁，因为大流行病防备中的一线防御将被解除(
Acta Vet Scand.201860(1):6)。
N6-腺苷甲基化(m6A)是影响RNA结构和功能的修饰(Desrosiers等人,Proc NatlAcad Sci U S A,1974)，认为该修饰对耐药性有影响。RNA的m6A修饰是动态且可逆的。在哺乳动物细胞中，m6A修饰通过由甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)组成的复合物催化，并且m6A修饰通过脱甲基酶脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)以及通过AlkB同源物5(ALKBH5)逆转(Brocard等人,Journal of General Virology,2017)。因此，m6A的水平受宿主甲基转移酶METTL3和宿主脱甲基酶FTO的控制。
甲基化RNA(诸如m6A甲基化RNA)的免疫原性显著低于未甲基化RNA(McGuinness和McGuinness,Journal of Cancer Science and Clinical Oncology,2014)。具体而言，RNA的甲基化(诸如m6A甲基化RNA)防止在先天免疫应答中起关键作用的Toll样受体(TLR)活化。未甲基化的病原体(诸如细菌RNA、真菌RNA、寄生虫RNA和病毒RNA)对TLR的活化导致一系列信号传导事件，导致I型干扰素(IFN)、炎性细胞因子和趋化因子的产生，以及对免疫应答的诱导(Lichinchi等人,Cell Host and Microbiome,2016；Narayan等人,Molecularand Cellular Biology,1987；Kennedy等人,Journal of Virology,2017)。最终，该炎症反应还激活了适应性免疫系统，这随后导致侵入的病原体和受感染的细胞被清除。然而，病原性RNA可变成甲基化的，并且甲基化的病毒RNA，例如，避开宿主TLR的检测。事实上，病毒RNA中m6A水平的增加与获得通过药物诸如扎那米韦治疗甲型流感(IVA)病毒的抗性相关。此外，用3-去氮杂腺苷(3DZA)(m6A的化学抑制剂)治疗IVA会降低耐药性(Scholtissek和Müller,Archives of Virology,1991)，而用甲氯芬那酸(MA)促进m6A则会提高耐药性。
因此，仍然需要可以有效降低用药物治疗的受治疗者的耐药性的治疗剂。
发明内容
本公开满足对可以有效降低用药物(诸如抗病毒活性剂)治疗的受治疗者中的耐药性发生率的治疗剂的需要。为此，本公开提供了降低N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化水平的药剂，诸如RNA寡核苷酸分子。优选地，本公开的寡核苷酸包括经修饰以提高稳定性的RNA寡核苷酸。
令人惊讶地发现，结合METTL3并充当METTL3的空间抑制剂的根据本公开实施方案的寡核苷酸抑制剂可以减少宿主和病毒RNA两者中的m6A甲基化。还已发现，用抑制性寡核苷酸和抗病毒药物诸如扎那米韦共同治疗病毒感染诸如IVA可抑制病毒RNA中的m6A水平并导致耐药性病毒的减少。
在一个总的方面，本公开涉及一种降低有需要的受治疗者(诸如需要用抗病毒活性剂治疗的受治疗者)的耐药性的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，诸如所公开的寡核苷酸，所述药剂降低所述受治疗者中的m6A RNA甲基化的水平，从而降低所述受治疗者的耐药性。
在本专利申请的一个实施方案中，所述方法包括向所述受治疗者施用METTL3、METTL14和WTAP中的至少一种的抑制剂。
在本专利申请的一个实施方案中，所述方法包括向所述受治疗者施用包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
根据一个特定方面，所公开的寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
根据一个特定方面，所公开的寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ IDNO:1)的多核苷酸序列组成，并且任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
根据一个特定方面，所公开的寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
根据一个特定方面，将有效量的降低m6A RNA甲基化水平的所公开的寡核苷酸与抗流感药物组合施用于所述受治疗者，所述抗流感药物优选地为神经氨酸酶抑制剂，诸如扎那米韦或奥司他韦。
在另一个总的方面，本公开涉及一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的所公开的寡核苷酸，所述寡核苷酸降低所述受治疗者中的m6A RNA甲基化的水平，从而在所述受治疗者中刺激免疫应答。
在一个总的方面，本公开涉及一种RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
在一个总的方面，本公开涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成的RNA寡核苷酸，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
根据一个特定方面，所述药物组合物还包含抗病毒活性剂，优选地抗流感药物，更优选地神经氨酸酶抑制剂，诸如扎那米韦或奥司他韦。
在一个总的方面，本公开涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含抗病毒活性剂和由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成的RNA寡核苷酸，其中i2FA表示2'-氟-腺苷，其中所述寡核苷酸和所述抗病毒活性剂存在于同一组合物或不同组合物中，并且其中所述抗病毒活性剂是抗流感药物，优选地神经氨酸酶抑制剂，诸如扎那米韦或奥司他韦。
根据以下公开内容，包括详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，所公开的实施方案的其他方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解上述发明内容以及下文的具体实施方式。应当理解，本发明不限于附图中示出的精确实施方案。
在附图中：
图1A示出了在抗性传代期间使用的扎那米韦的剂量；
图1B示出了扎那米韦传代的流感A/PC的EC50值；
图2示出了在用扎那米韦(ZanR)进行抗性传代之前和之后，流感A/PC和流感B/Vic病毒RNA中的m6A水平的倍数变化；
图3示出了对照样品和用3DZA或MA处理的样品中的m6A水平；
图4示出了用3DZA或MA处理的流感A/PC或流感A/PC/ZanR毒株中的m6A水平；
图5示出了用3DZA或MA处理的流感A/PC或流感A/PC/ZanR毒株中的EC50值；
图6示出了生物素标记的寡核苷酸的免疫沉淀测定的示意图(左)和结果(右)；
图7A示出了用所公开的RNA寡核苷酸处理后MDCK细胞中的m6A水平；
图7B示出了用本公开中所公开的RNA寡核苷酸处理后HEK293细胞中的m6A水平；
图8示出了用流感A/PC或流感A/PC/ZanR毒株感染的MDCK细胞在用本公开中所公开的RNA寡核苷酸处理之后的m6A水平；并且
图9示出了在用本公开中所公开的RNA寡核苷酸处理后，流感A/PC或流感A/PC/ZanR毒株的EC50值。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
如本文所用，术语“降低”、“减少”或“抑制”全部是指降低统计上显著的量。根据本公开的特定实施方案，“降低”、“减少”或“抑制”意指与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或最多并且包括降低100％，或与参考水平相比降低10％至100％的任意量。
如本文所用，术语“统计上显著的”或“显著地”是指统计显著性，并且通常意指测量值的两个标准偏差或更大的差值。该术语是指存在差异的统计证据，并且定义为当零假设实际为真时作出拒绝零假设的决定的概率。统计显著性可以例如通过t检验或使用p值来测定。
如本文所用，术语“用药物治疗的受治疗者”或“用活性剂治疗的受治疗者”是指在施用根据本公开的实施方案的降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如所公开的寡核苷酸)之前、期间或之后用药物或活性剂治疗的受治疗者。根据本公开的特定实施方案，将降低m6ARNA甲基化水平的药剂(诸如RNA寡核苷酸)施用于当前正在用药物或活性剂治疗的受治疗者。根据本公开的其他特定实施方案，将所公开的降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如RNA寡核苷酸)预防性地施用于未来会用药物或活性剂进行治疗的受治疗者。根据本公开的特定实施方案，将降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如RNA寡核苷酸)施用于先前已经用药物或活性剂进行治疗的受治疗者。
如本文所用，术语“抗病毒活性剂”是指用于治疗或预防受治疗者中的病毒感染的任何化合物。根据本公开的特定实施方案，抗病毒活性剂是用于治疗或预防任何病毒感染的化合物，所述病毒的耐药性由m6A RNA甲基化调节，诸如双链(ds)/单链(ss)RNA或DNA病毒，诸如流感病毒、HIV或寨卡病毒(Zika virus)。
如本文所用，术语“有效量”是指在受治疗者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。有效量可相对于指定目的根据经验和/或以常规方式进行确定。例如，可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。基于若干因素的考虑，包括要治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状态以及技术人员已知的其他因素，本领域的技术人员可确定具体有效剂量的选择(例如，经由临床试验)。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可通过源自体外或动物模型测试体系的剂量应答曲线来推导。
如本文所用，术语“N6-甲基腺苷”、“m6A”或“m6A”是指在细胞中RNA的氮-6位置处的腺苷碱基的甲基化。
如本文所用，术语“受治疗者”是指动物。根据特定实施方案，受治疗者是哺乳动物，包括非灵长类(例如骆驼、驴、斑马、牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、犬、大鼠、兔子、豚鼠或小鼠)或灵长类(例如猴、黑猩猩或人)。在特定实施方案中，受治疗者是人。
如本文所用，术语“抑制剂”是指防止或降低蛋白质的量或活性的化合物或分子。例如，术语“抑制剂”可以指负调控蛋白质的表达、稳定性或活性，包括但不限于蛋白质mRNA的转录、蛋白质mRNA的稳定性、蛋白质mRNA的翻译、蛋白质多肽的稳定性、蛋白质的翻译后修饰、蛋白质活性、蛋白质信号传导途径或它们的任何组合的化合物或分子。METTL3、METTL14或WTAP的抑制剂包括但不限于核酸，诸如结合并抑制所述蛋白质中的一种或多种的核酸抑制剂，或减少或防止所述蛋白质中的一种或多种的表达的反义核酸；抑制所述蛋白质中的一种或多种的活性的小分子抑制剂；结合所述蛋白质中的一种或多种并抑制所述蛋白质中的一种或多种的活性的肽或蛋白质，诸如选择性结合所述蛋白质中的一种或多种并抑制其活性的抗体；碳水化合物、脂质或降低所述蛋白质中的一种或多种的水平或活性的任何其他分子。根据特定方面，抑制剂包括例如抑制(在空间上或其他方面)所述蛋白质中的一种或多种的寡核苷酸、靶向所述蛋白质中的一种或多种的转录物的siRNA分子、或抑制所述蛋白质中的一种或多种的活性的抗体或小分子。
如本文所用，术语“甲基转移酶样蛋白3”或“METTL3”，也称为N6-腺苷-甲基转移酶70kDa亚基或MT-A70，是指形成N6-甲基转移酶复合物的METTL3-METTL14异源二聚体的组分，N6-甲基转移酶复合物使一些RNA的N6位置处的腺苷残基甲基化并调节各种过程，诸如昼夜节律钟、胚胎干细胞和造血干细胞的分化、皮质神经形成、对DNA损伤的应答、T细胞分化和初级miRNA加工。METTL3的示例包括但不限于人METTL3，即由2038个核苷酸长的mRNA转录物(NM_019852.4)编码的580个氨基酸长的蛋白质。所例示的人METTL3的氨基酸序列以GenBank登录号NP_062826.2表示。如本文所用，术语“METTL3”包括来自人以外的物种，诸如Macaca Fascicularis(食蟹猴)或Pan troglodytes(黑猩猩)的METTL3同源物。如本文所用，术语“METTL3”包括包含全长野生型METTL3的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“METTL3”还涵盖METTL3氨基酸序列的翻译后修饰。
如本文所用，术语“甲基转移酶样蛋白14”或“METTL14”，也称为KIAA1627，是指上述METTL3-METTL14异源二聚体的组分。METTL14的示例包括但不限于人METTL14，即由3520个核苷酸长的mRNA转录物(NM_020961.3)编码的456个氨基酸长的蛋白质。所例示的人METTL14的氨基酸序列以GenBank登录号NP_066012.1表示。如本文所用，术语“METTL14”包括来自人以外的物种，诸如Macaca Fascicularis(食蟹猴)或Pan troglodytes(黑猩猩)的METTL14同源物。如本文所用，术语“METTL14”包括包含全长野生型METTL14的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“METTL14”还涵盖METTL14氨基酸序列的翻译后修饰。
如本文所用，术语“威尔姆氏瘤1相关蛋白”或“WTAP”，也称为KIAA1627，是指上述METTL3-METTL14 N6-甲基转移酶复合物的调节亚基。WTAP的示例包括但不限于人WTAP，即由2265个核苷酸长的mRNA转录物(NM_004906.4)编码的396个氨基酸长的蛋白质。所例示的人WTAP的氨基酸序列以GenBank登录号NP_004897.2表示。如本文所用，术语“WTAP”包括来自人以外的物种，诸如Macaca Fascicularis(食蟹猴)或Pan troglodytes(黑猩猩)的WTAP同源物。如本文所用，术语“WTAP”包括包含全长野生型WTAP的突变，例如点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。术语“WTAP”还涵盖WTAP氨基酸序列的翻译后修饰。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指由多个连接的核苷酸单元(即，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者)形成的多核苷酸。此类寡核苷酸可从现有的核酸来源获得，或者可通过合成方法制备。在一些实施方案中，寡核苷酸各自具有约10至约30个核苷酸残基，优选地约10至约25个核苷酸残基，更优选地约10至约20个核苷酸残基。根据特定实施方案，寡核苷酸的核苷酸间连键包括但不限于磷酸二酯连键、硫代磷酸酯连键以及它们的混合。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受治疗者的上下文中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。术语“联合”的使用并不限制疗法施用于受治疗者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受治疗者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，与此同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。可替代地，例如，第一疗法和第二疗法可在同一组合物中或在单独的组合物中同时施用。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知的用于药物制剂中的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据本公开，根据特定实施方案，适用于基于RNA寡核苷酸的药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
如本文所用，术语“诱导”和“刺激”及其变型形式是指细胞活性的任何可测量的增大。免疫应答的诱导可包括增加B细胞的增殖；产生抗原特异性抗体；增加抗原特异性T细胞的增殖；改善树突细胞抗原呈递；和/或提高某些细胞因子、趋化因子和共刺激标记物的表达。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与其中免疫应答的刺激将会有益的疾病，诸如免疫疾病、障碍或病症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受治疗者中可识别的，但能够在受治疗者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症的发展。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与其中免疫应答的刺激将会有益的疾病，诸如免疫疾病、障碍或病症(包括病毒感染或癌症)相关的一种或多种症状的持续时间。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指预防疾病、障碍或病症的复发。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受治疗者的存活提高。在特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受治疗者中疾病、障碍或病症的消除。
如本文所用，“其中免疫应答的刺激将会有益的疾病”包括免疫应答的刺激将有益于受治疗者的任何疾病。例如，其中免疫应答的刺激将会有益的疾病可包括免疫疾病、障碍或病症。根据特定实施方案，待治疗的疾病、障碍或病症为炎性疾病、障碍或病症，自身免疫疾病、障碍或病症，或由病原体引起的疾病、障碍或病症，诸如病毒感染。根据特定实施方案，其中免疫应答的刺激将会有益的疾病是病毒感染，即RNA或DNA病毒诸如腺病毒、细胞巨化病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、嗜肝病毒(包括HBV、慢性HBV)、黄病毒(包括黄热病病毒)、肝炎病毒(包括丙型肝炎病毒(HCV))、1型和2型单纯疱疹病毒、带状疱疹病毒、人疱疹病毒6型、人免疫缺陷病毒(HIV)、寨卡病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、副流感病毒、瘟病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV)、引起出血热的多个家族的病毒(包括沙粒病毒、布尼亚病毒和丝状病毒)，以及由RNA和DNA病毒引起的一系列病毒性脑炎。
降低耐药性或刺激免疫应答的方法
在一个总的方面，本公开涉及一种降低用药物诸如抗病毒剂治疗的受治疗者的耐药性的方法，该方法包括向受治疗者施用有效量的药剂，诸如所公开的寡核苷酸。在一个实施方案中，药剂，诸如所公开的寡核苷酸，降低受治疗者中的m6A RNA甲基化的水平，从而降低受治疗者的耐药性。
本公开还涉及一种降低用药物治疗的受治疗者的耐药性的方法，该方法包括向受治疗者施用有效量的抑制METTL3、METTL14和WTAP中的至少一种的药剂，诸如核酸抑制剂，从而降低受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平。
本公开还涉及一种降低用药物治疗的受治疗者的耐药性的方法，该方法包括向受治疗者施用有效量的包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，任选地，寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
在一个实施方案中，该寡核苷酸的多核苷酸序列是(GGACU)n，其中n为2-6。
在一个实施方案中，该寡核苷酸的多核苷酸序列为(GG/i2FA/CU)n，其中i2FA表示2'-氟-腺苷，并且n为2-6。
通过向受治疗者施用该药物而在受治疗者中引起的耐药性的存在或水平，以及药剂诸如所公开的核酸抑制剂对耐药性的存在或水平的影响，可以鉴于本公开使用本领域已知的方法进行测定。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。
根据本公开的特定实施方案，抗病毒活性剂是抗流感药物(例如，神经氨酸酶抑制剂，例如扎那米韦、奥司他韦、零流感(Tamiphosphor)、帕拉米韦(Peramivir))、抗HIV药物(例如，AZT、ddC、TiBO衍生物、阿昔洛韦(acyclovir)、α-干扰素)、抗寨卡药物、或免疫刺激剂或免疫调节剂(例如，白细胞介素、细胞因子)。根据本公开的特定实施方案，抗病毒活性剂是选自扎那米韦和奥司他韦的抗流感药物。
在另一个总的方面，本公开涉及一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，该方法包括向受治疗者施用有效量的药剂，诸如所公开的核酸抑制剂。在一个实施方案中，所公开的核酸抑制剂降低受治疗者中的m6ARNA甲基化的水平，从而在受治疗者中刺激免疫应答。
鉴于本公开，免疫应答的刺激可以使用本领域已知的方法测定。示例性方法包括，例如使用ELISA或对细胞因子和趋化因子具有特异性的抗体测量免疫应答，测量接触了药剂诸如所公开的核酸抑制剂的免疫细胞(例如，由淋巴细胞和单核细胞组成的外周血单核细胞(PBMC))或报告细胞的免疫应答，或在注射所公开的核酸抑制剂后测量动物体内的细胞因子诱导。
受治疗者中m6A RNA甲基化的水平，以及药剂诸如所公开的核酸抑制剂对受治疗者中m6A RNA甲基化的水平的影响，可以鉴于本公开使用本领域已知的方法进行测定。例如，可以使用ELISA或结合并且可以分离m6A修饰的mRNA以使其能够定量的抗体来测量m6A。示例性方法在本文中描述于例如以下实施例中。
如本文关于降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)所用，有效量意指该药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)的量，该量降低有需要的受治疗者中的m6ARNA甲基化水平，从而降低受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒的抗病毒药物耐药性或在有需要的受治疗者中诱导免疫应答。另外如本文关于降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)所用，有效量意指该药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)的量，该量引起对受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染的治疗；预防或减缓受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染的进展；减少或完全减轻与受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染相关的症状。另外如本文关于降低m6A RNA甲基化水平的药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)所用，有效量意指该药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)的量，该量引起对其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症的治疗；预防或减缓其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症的进展；减少或完全减轻与其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症相关的症状。
根据特定实施方案，有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的严重性；(ii)缩短受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的进展；(iv)引起受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的的消退；(v)预防受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的发展或发作；(vi)预防受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的复发；(vii)减少具有受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的受治疗者的住院治疗；(viii)减少具有受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的受治疗者的住院治疗时长；(ix)增加具有受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或与之相关的症状的受治疗者的存活期；(xi)抑制或减少受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染或受治疗者中与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
根据其他特定实施方案，有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重性；(Ii)缩短其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的发展；(iv)引起其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的消退；(v)预防其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的发展或发作；(vi)预防其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的复发；(vii)减少具有其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受治疗者的住院治疗；(viii)减少具有其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受治疗者的住院时长；(ix)增加具有其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受治疗者的存活期；(xi)抑制或减少受治疗者中其中免疫应答的刺激将会有益的疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，诸如施用方式、受治疗者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康状态)、受治疗者是人还是动物、以及施用的其他药物。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
本公开的药剂(诸如核酸抑制剂)出于治疗用途的施用模式可以是将该药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)递送至宿主的任何合适的途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适用于肠胃外施用，例如真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内或颅内施用，或它们可施用到脑或脊柱的脑脊髓液中。
根据特定实施方案，受治疗者用抗病毒活性剂治疗的病毒感染是通过m6A RNA甲基化调节其耐药性的任何病毒的感染。例如，病毒感染可包括流感病毒、HIV、埃博拉病毒(Ebola virus)、HCV或寨卡病毒。根据特定实施方案，该病毒感染是流感病毒感染，诸如甲型流感病毒感染、乙型流感病毒感染或丙型流感病毒感染。根据特定实施方案，该病毒感染是甲型流感病毒感染。
根据特定实施方案，该药剂是METTL3、METTL14和WTAP中的至少一种的抑制剂。根据特定实施方案，该抑制剂是结合METTL3、METTL14或WTAP基因中的一者或多者的核酸，诸如寡核苷酸，或减少或防止METTL3、METTL14或WTAP表达的反义核酸。根据特定实施方案，该抑制剂是结合METTL3、METTL14或WTAP并抑制它们的活性的小分子、肽、抗体、碳水化合物或脂质。根据特定实施方案，该抑制剂是阻断或降低所述蛋白质中的一种或多种与N6-甲基转移酶复合物的共有序列RRm6ACH之间的结合的核酸抑制剂，其中R独立地为鸟苷或腺苷，C为胞苷，并且H独立地为腺苷、胞苷或尿苷。
根据特定方面，该核酸抑制剂是结合并在空间上抑制METTL3的RNA寡核苷酸。根据特定实施方案，该核酸抑制剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，n为2至6的整数，并且寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。根据特定实施方案，(RRACH)部分彼此相邻，并且在它们之间没有其他核苷酸。根据特定实施方案，所公开的核酸抑制剂是包含GGACA、GGACC、GGACU、GAACA、GAACC、GAACU、AGACA、AGACC、AGACU、GGm6ACA、GGm6ACC、GGm6ACU、GAm6ACA、GAm6ACC、GAm6ACU、AGm6ACA、AGm6ACC和AGm6ACU中的一者或多者，或它们的组合诸如GGACAGGACCGGACU GAACA、GAACCGAACU AGACAAGACC、(GGACA)2(AGACU)2、GAACU(AGACA)3AGACC等的RNA寡核苷酸。根据特定实施方案，该RNA寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，并且任选地，该RNA寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
优选地，对该寡核苷酸中的一个或多个核苷进行修饰以增加该寡核苷酸的稳定性。根据特定方面，使用本领域已知的化学方法，通过一种或多种修饰来稳定该RNA寡核苷酸。示例性的核苷酸修饰包括糖和/或磷酸骨架修饰的核糖核苷酸。例如，天然RNA的磷酸二酯连键可经修饰为包含氮杂原子或硫杂原子中的至少一种。在示例性的主链修饰的核糖核苷酸中，连接至相邻核糖核苷酸的磷酸二酯基团中的至少一个被经修饰的基团诸如硫代磷酸酯基团、氨基磷酸酯或硫代氨基磷酸酯置换。在示例性的糖修饰的核糖核苷酸中，糖的2'OH基团被选自以下的基团置换：H、R、OR、OROR、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON，其中每个R独立地为C1-C2烷基、卤代烷基、烯基或炔基，并且卤素为F、Cl、Br或I。在特定实施方案中，糖的2'OH基团被氟置换。在特定实施方案中，糖的2'OH基团被氟置换—2'氟修饰。在特定实施方案中，在具有腺嘌呤碱基的核苷中糖的2'OH基团被氟置换—2'-氟-腺苷修饰。
在实施方案中，本公开的寡核苷酸中的一个或多个腺苷经2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基、2'-O-乙基或2'-O-甲氧基乙基修饰。2'-糖取代基可处于阿拉伯糖基(上)位置或核糖基(下)位置。
其他修饰可包括但不限于2'-氨基和/或2'-硫代修饰。特定的修饰包括2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'-氟-鸟苷、2'-氨基-胞苷、2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。
糖修饰的核糖核苷酸也可已在糖的其他位置诸如5'-位置进行修饰。另外的示例性修饰包括5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖胸腺嘧啶核苷、2-氨基嘌呤、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和5-氟-尿苷。另外的经修饰的残基包括肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和三氮唑核苷(ribavirin)。应当理解，可在同一分子内组合多于一种的化学修饰。还应当理解，RNA寡核苷酸中的任何一个或多个核苷都可被修饰。
根据特定方面，RNA寡核苷酸中的一个或多个核苷通过2'-氟-腺苷修饰来修饰。在一个实施方案中，多核苷酸序列为(GG/i2FA/CU)n，其中i2FA表示2'-氟-腺苷，并且n为2-6。根据特定方面，寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ IDNO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
根据特定实施方案，本公开的寡核苷酸可经由接头缀合至靶向部分。根据特定实施方案，该靶向部分增加缀合的寡核苷酸的稳定性和/或引导缀合的寡核苷酸的递送。
如本文所用，术语“接头”是指将核苷酸连接到靶向部分的化学部分，并且术语“可裂解接头”是指在需要时可以裂解以从核苷酸去除加强部分而基本上不改变其所附接的核苷酸或核酸分子的接头。裂解可以例如通过酸处理或碱处理，通过连键的氧化或还原，通过光处理(光漂白)来实现，这取决于键的性质。接头可以是，例如单共价键、经取代或未取代的烷基、经取代或未取代的杂烷基、聚乙二醇(PEG)接头或一个、两个或三个脱碱基和/或核糖醇基团。
如本文所用，术语“靶向部分”是指适于稳定其缀合的寡核苷酸和/或引导其缀合的寡核苷酸递送至靶细胞的任何部分。根据特定实施方案，靶向部分是脂质部分。如本文所用，“脂质部分”是指包含亲脂性结构的部分。当附接到高度亲水性分子诸如核酸上时，脂质部分，诸如胆固醇、生育酚或其他脂肪酸，可显著地增强血浆蛋白结合，并因此增加亲水性分子的循环半衰期。
根据特定实施方案，靶向部分结合至所感兴趣的特定靶细胞类型上存在的受体。靶向部分有助于使寡核苷酸靶向所需的靶位点。一种靶向部分可改善递送的方式是通过受体介导的内吞活性。该摄取机制涉及结合到膜受体的寡核苷酸经由膜结构的侵入或通过递送系统与细胞膜的融合而移动到膜包裹的区域内部，并且它是在特异性配体与受体结合后经由细胞表面或膜受体的活化而引发的。许多受体介导的内吞系统是已知的并且已有研究，包括识别糖诸如半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸，肽和蛋白质诸如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白，维生素B12、胰岛素和表皮生长因子(EGF)的那些。
根据特定方面，与抗病毒活性剂，诸如抗流感药物、抗HIV药物或抗寨卡病毒药物组合，向受治疗者施用有效量的所公开的核酸抑制剂。根据特定方面，与抗流感药物，诸如扎那米韦或奥司他韦组合，向受治疗者施用有效量的所公开的核酸抑制剂。根据其他特定方面，与免疫调节剂或抗炎药物组合，向受治疗者施用有效量的所公开的核酸抑制剂。根据特定方面，与免疫调节剂，诸如TLR7或TLR9的激动剂组合，向受治疗者施用有效量的所公开的核酸抑制剂。
所公开的核酸抑制剂可在单剂量时间表或作为多剂量时间表施用，在该多剂量时间表中，在包括1-10个独立剂量的初步疗程之后是在后续时间间隔给予的其他剂量，例如在1-4天、数周或数月给予第二剂量，并且如果需要，在几天、几周或几个月后给予后续剂量。
寡核苷酸、药物组合物和试剂盒
在一个实施方案中，(RRACH)n的多核苷酸序列为(GG/i2FA/CU)n，其中i2FA表示2'-氟-腺苷，并且n为2-6。在实施方案中，核酸抑制剂是由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成的寡核苷酸，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
鉴于本公开，所公开的核酸抑制剂诸如RNA寡核苷酸可以使用本领域已知的方法制备。例如，所公开的RNA寡核苷酸可用固相合成来制备，参见例如“Oligonucleotidesynthesis,apractical approach”,M.J.Gait编辑,IRL Press,1984；“Oligonucleotidesand Analogues,A Practical Approach”,F.Eckstein编辑,IRL Press,1991(例如第1章：Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis，第2章：Oligoribonucleotide synthesis,第4章：Phosphorothioate oligonucleotides，第5章：Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates)。其他特别有用的合成方法、试剂、封端基团和反应条件描述于Martin,P.,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1992,48,2223-2311以及Beaucage,S.L.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,1993,49,6123-6194，或其中引用的参考文献。某些所公开的寡核苷酸及其单体也可商购获得。
在一个总的方面，本公开涉及一种药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成的核酸抑制剂，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
根据特定实施方案，本文所述的组合物被配制成适于施用于受治疗者的预期途径。例如，本文所述的组合物可被配制成适于静脉内、皮下或肌内注射施用。根据优选的实施方案，本文所述的组合物被配制成适于静脉内或皮下施用。
根据另一个总的方面，本专利申请涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本公开的药剂(诸如核酸抑制剂)和另一种活性成分(诸如抗病毒活性剂)。在本专利申请的一个实施方案中，该药物组合物包含抗流感药物、抗HIV药物、抗寨卡病毒药物、免疫刺激剂或免疫调节剂与包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸的组合，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。在一个实施方案中，寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。根据特定方面，药物组合物中的抗流感药物包括神经氨酸酶抑制剂，诸如扎那米韦或奥司他韦。在一个实施方案中，RNA寡核苷酸具有5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列，该多核苷酸序列任选地具有一个或多个经修饰的核苷，并且优选地由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
在另一个总的方面，本公开涉及一种产生包含药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)的药物组合物的方法，该方法包括将药剂或核酸抑制剂与药学上可接受的载体组合以获得药物组合物。
在另一个总的方面，本公开涉及一种在有需要的受治疗者中治疗疾病的方法，该方法包括向受治疗者施用本公开的药物组合物，其中该疾病是刺激免疫应答将会有益的疾病。根据特定方面，该疾病是病毒感染或疾病、障碍或病症，诸如流感病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、HIV、鼻病毒、HCV和HBV感染。
在一个总的方面，本公开涉及一种试剂盒，该试剂盒包含药剂(诸如所公开的核酸抑制剂)和另一种活性成分(诸如抗病毒活性剂)，其中所公开的核酸抑制剂和其它活性成分存在于同一组合物或不同组合物中。在一个实施方案中，该药剂或核酸抑制剂有效降低m6A RNA甲基化水平。在本专利申请的一个实施方案中，该试剂盒包含抗流感药物、抗HIV药物、抗寨卡病毒药物、免疫刺激剂或免疫调节剂及包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，n为2至6的整数，并且寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。根据特定方面，该试剂盒包含抗流感药物和RNA寡核苷酸，该抗流感药物为神经氨酸酶抑制剂，其优选地选自扎那米韦和奥司他韦，该RNA寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，其任选地具有一个或多个经修饰的核苷，并且优选地由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ IDNO:2)组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
本专利申请中所有引用的参考文献的内容(包括参考文献、公布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)在此明确地以引用方式并入。
实施方案
本发明还提供了以下非限制性实施方案。
实施方案1是一种降低用药物治疗的受治疗者的耐药性的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平，从而降低所述受治疗者的耐药性。
实施方案2是根据实施方案1所述的方法，其中所述药剂是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
实施方案3是根据实施方案1或2所述的方法，其中所述药剂是核酸、小分子或多肽，诸如抗体或其抗原结合片段。
实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
实施方案5是根据实施方案4所述的方法，其中所述多核苷酸序列是(GGACU)n，其中n为2至6的整数。
实施方案6是根据实施方案4或5所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，所述多核苷酸序列任选地含有一个或多个核苷修饰。
实施方案7是根据实施方案4至6中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
实施方案8是根据实施方案7所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷具有2'-氟修饰，优选地，所述寡核苷酸中的一个或多个腺苷残基具有2'-氟修饰。
实施方案9是根据实施方案6至8中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案10是根据实施方案4至9中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经由接头缀合至靶向部分。
实施方案11是根据实施方案4至10中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经静脉内或皮下施用。
实施方案12是根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中将所述有效量的药剂与所述药物组合施用于所述受治疗者。
实施方案13是根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述药物是抗病毒药物。
实施方案14是根据实施方案13所述的方法，其中所述抗病毒药物是抗流感药物。
实施方案15是根据实施方案14所述的方法，其中所述抗流感药物是神经氨酸酶抑制剂。
实施方案16是根据实施方案15所述的方法，其中所述神经氨酸酶抑制剂是扎那米韦或奥司他韦。
实施方案17是一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平，从而在所述受治疗者中刺激免疫应答。
实施方案18是根据实施方案17所述的方法，其中所述药剂是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
实施方案19是根据实施方案17或18所述的方法，其中所述药剂是核酸、小分子或多肽，诸如抗体或其抗原结合片段。
实施方案20是根据实施方案17至19中任一项所述的方法，其中所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
实施方案21是根据实施方案20所述的方法，其中所述多核苷酸序列是(GGACU)n，其中n为2至6的整数。
实施方案22是根据实施方案21所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，所述多核苷酸序列任选地含有一个或多个核苷修饰。
实施方案23是根据实施方案20至22中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
实施方案24是根据实施方案23所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷具有2'-氟修饰，优选地，所述寡核苷酸中的一个或多个腺苷残基具有2'-氟修饰。
实施方案25是根据实施方案22至24中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案26是根据实施方案20至25中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经由接头缀合至靶向部分。
实施方案27是根据实施方案20至26中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸经静脉内或皮下施用。
实施方案28是根据实施方案18至27中任一项所述的方法，其中将所述有效量的药剂与药物，优选地抗病毒药物、抗炎药物或免疫调节剂组合施用于所述受治疗者。
实施方案29是一种RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案30是根据实施方案29所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸经由接头缀合至靶向部分。
实施方案31是一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据实施方案29或30所述的寡核苷酸。
实施方案32是一种药物组合物，所述药物组合物包含药物，诸如抗病毒活性剂，优选地抗流感药物，更优选地神经氨酸酶抑制剂，诸如扎那米韦或奥司他韦，以及降低受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化水平的药剂，优选地所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，更优选地所述药剂是由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成的RNA寡核苷酸，所述寡核苷酸任选地含有一个或多个核苷酸修饰，并且最优选地所述药剂是由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成的RNA寡核苷酸，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案33是一种在有需要的受治疗者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据实施方案31或32所述的药物组合物，其中所述疾病是刺激免疫应答将会有益的疾病。
实施方案34是一种试剂盒，所述试剂盒包含药物，诸如抗病毒活性剂，优选地抗流感药物，以及降低受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化水平的药剂，优选地所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，更优选地所述药剂是由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ IDNO:1)的多核苷酸序列组成的RNA寡核苷酸，所述寡核苷酸任选地含有一个或多个核苷酸修饰，并且最优选地所述药剂是由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQID NO:2)组成的RNA寡核苷酸，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案35是根据实施方案34所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸和所述抗病毒活性剂存在于同一组合物中。
实施方案36是根据实施方案34所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸和所述抗病毒活性剂存在于不同组合物中。
实施方案37是根据实施方案34至36中任一项所述的试剂盒，其中所述抗病毒活性剂是神经氨酸酶抑制剂。
实施方案38是根据实施方案37所述的试剂盒，其中所述神经氨酸酶抑制剂是扎那米韦或奥司他韦。
实施例39是一种预防或治疗已施用药物的受治疗者的耐药性的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的核酸抑制剂。
实施方案40是根据实施方案39所述的方法，其中所述核酸抑制剂是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
实施方案41是根据实施方案39或40所述的方法，其中所述核酸抑制剂是寡核苷酸。
实施方案42是根据实施方案41所述的方法，其中所述寡核苷酸是RNA寡核苷酸。
实施方案43是根据实施方案41或42所述的方法，其中所述寡核苷酸是空间阻断剂。
实施方案44是根据实施方案41至43中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含(RRACH)n的多核苷酸序列，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
实施方案45是根据实施方案44所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，所述多核苷酸序列任选地含有一个或多个核苷修饰。
实施方案46是根据实施方案44或45所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
实施方案47是根据实施方案45或46所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷具有2'-氟修饰，优选地，所述寡核苷酸中的一个或多个腺苷残基具有2'-氟修饰。
实施方案48是根据实施方案45至47中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施方案49是根据实施方案39至48中任一项所述的方法，其中所述药物是抗病毒药物。
实施方案50是根据实施方案49所述的方法，其中所述抗病毒药物是抗流感药物。
实施方案51是根据实施方案50所述的方法，其中所述抗流感药物是神经氨酸酶抑制剂。
实施方案52是根据实施方案51所述的方法，其中所述神经氨酸酶抑制剂是扎那米韦或奥司他韦。
实施方案53是一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的核酸抑制剂。
实施方案54是根据实施方案53所述的方法，其中所述核酸抑制剂是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
实施方案55是根据实施方案53或54所述的方法，其中所述核酸抑制剂是寡核苷酸。
实施方案56是根据实施方案55所述的方法，其中所述寡核苷酸是RNA寡核苷酸。
实施方案57是根据实施方案55或56所述的方法，其中所述寡核苷酸是空间阻断剂。
实施方案58是根据实施方案55至57中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含(RRACH)n的多核苷酸序列，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
实施方案59是根据实施方案58所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，所述多核苷酸序列任选地含有一个或多个核苷修饰。
实施方案60是根据实施方案58或59所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
实施方案61是根据实施方案59或60所述的方法，其中所述寡核苷酸中的一个或多个核苷具有2'-氟修饰，优选地，所述寡核苷酸中的一个或多个腺苷残基具有2'-氟修饰。
实施方案62是根据实施方案59至61中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
实施例
本公开的以下实施例旨在进一步说明本公开的性质。应当理解，以下实施例不限制本公开，并且本公开的范围由所附权利要求书确定。
除非另外指明，以下实施例中使用的实验方法均为常规方法。除非另外指明，以下实施方案中使用的试剂均购自普通试剂供应商。
实施例1
材料和方法
细胞RNA、病毒RNA提取和m6A定量
在感染后7天从MDCK上清液中收集病毒，以2500rpm离心10分钟，并且使用Qiagen病毒RNA提取试剂盒(目录号52904，Qiagen)提取RNA。使用nanodrop(赛默飞世尔)测量RNA浓度。使用2000ng的总RNA m6A定量试剂盒(目录号AB185912，Abcam)测量总m6A水平。为了提取细胞RNA，移除上清液，用冰冷的PBS洗涤细胞一次，并使用RNA提取试剂盒(目录号74104，Qiagen)根据制造商的说明书提取RNA。
EC50测定
使用96孔格式测定EC50。将最高浓度(取决于每种药物的EC50)在深孔板中连续稀释，稀释度为1/3。在添加药物后，将细胞温育24小时，然后添加病毒。将病毒与细胞一起温育72小时或120小时，并使用发光法细胞滴度计(cell titer glow)(目录号G7570，Promega)测定细胞活力，或者使用munana测定法(目录号4457091，Thermo Fisher)根据制造商的方案测定病毒水平。
转染
使用lipofectamine 2000转染MDCK细胞。简言之，每个孔使用Lipofectamine2000(目录号11668010，Thermo Fisher)转染100nM的寡核苷酸(对照RNA：5’GGGCUGGGCUGGGCUGGGCU 3’(SEQ ID NO:3)；目标RNA：5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ IDNO:1)；稳定RNA：5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2))，并且在温育24小时后，将培养基更换为含有10％FBS的DMEM。通过IDT合成寡核苷酸。
免疫沉淀测定和蛋白质印迹分析
使用5'-生物素标记的寡核苷酸进行免疫沉淀。简言之，使用补充有蛋白酶抑制剂(目录号78438，Thermo Fisher)的NP40裂解缓冲液(目录号FNN0021，Thermo Fisher)裂解20x10^6个293T细胞，将裂解物在4℃下离心10分钟，并分离上清液。使用BCA测定法(目录号23227，Thermo Fisher)根据制造商的方案测量总蛋白质浓度。将100μg总裂解物与补充有蛋白酶和RNA酶抑制剂的100nM生物素化寡核苷酸(目录号N8080119，Thermo Fisher)在摇臂上于4℃温育1小时，然后添加30μL链霉抗生物素蛋白包被的珠粒(目录号11206D，ThermoFisher)并且再温育2小时。将珠粒用冰冷的NP40裂解缓冲液洗涤3次，并且将珠粒用SDS样品缓冲液在100℃下煮沸10分钟。
实施例2
在耐扎那米韦的甲型流感病毒的情况下病毒RNA甲基化增加
为了产生耐药性甲型流感病毒，使IVA在MDCK细胞中连续传代。将5x10^6个MDCK细胞(目录号CCl34，ATCC)接种于6孔板中。用IVA/PC病毒以一定MOI感染细胞并且从2nM的IC50开始，用扎那米韦(目录号SML0492，Sigma)处理细胞。目视检查细胞，并且在观察到显著的细胞病变效应后，用递增剂量的扎那米韦进行下一传代。每次传代剂量增加2倍，直到大约415nM为止(图1)。为了评价野生型和耐药型IVA和IVB病毒中m6A甲基化的可能变化，提取病毒RNA并在m6A特异性ELISA中测量m6A，如上所述。在每种病毒中，都检测到总m6A的显著增加(图2)，表明m6A在获得性耐药性中的作用。
实施例3
RNA甲基化调节剂改变耐药性
已证实，使用3-去氮杂腺苷(3DZA)改变RNA甲基化抑制了耐药性IVA的产生(Scholtissek和Müller,Archives ofVirology,1991)。基于这一信息，测试了RNA调节剂在调节耐药性方面的作用。使用3DZA(25uM)抑制总细胞m6A，使用MA(50uM)增加总细胞m6A(Fustin等人,Cell,2013,Huang等人,Nucleic Acids Research,2014)。如图5所示，通过用MA处理来增加m6ARNA甲基化水平加强了病毒对扎那米韦的抗性。
接下来，在3DZA或MA的存在下用扎那米韦进行抗性传代。将5×10^6个MDCK细胞(目录号CCl34，ATCC)接种于6孔板中。将细胞用50μM 3DZA(目录号D8296，Sigma)或100μMMA(目录号M4531，Sigma)处理。24小时后，将培养基更换为含0.3％FBS 10％PS和1:5000TPCK胰蛋白酶的MEM(目录号T1426，Sigma)，并且将每个孔用IVA/PC病毒以不同MOI感染并用不同浓度的扎那米韦(目录号SML0492，Sigma)处理。目视检查细胞，并且在观察到显著的细胞病变效应后，用递增剂量的扎那米韦进行下一传代。使用m6A ELISA测量m6A的水平。如图5所示，用MA(1.68uM)时观察到IC50增加，用3DZA(0.0618uM)时观察到IC50降低。
在用3DZA和MA处理MDCK细胞后测量病毒RNA中的总m6A水平。如图3所示，观察到经MA处理的细胞中m6A增加而经3DZA处理的细胞中m6A减少，这表明靶向宿主甲基转移酶也改变了病毒RNA中的m6A水平。已经证实耐扎那米韦的甲型流感病毒携带有直接引起抗性的突变。
实施例4
用寡核苷酸空间阻断剂靶向METTL3
由于使用RNA甲基化调节剂MA和3DZA时观察到耐药性的变化，因此设计了由4个GGACU重复序列组成的可竞争性抑制METTL3活性的寡核苷酸抑制剂(图6)。
为了确定对m6A的抑制作用，用100nM的对照寡核苷酸、目标寡核苷酸或稳定的寡核苷酸转染MDCK和293细胞。转染后72小时测定m6A的水平。在用稳定寡核苷酸转染的MDCK和293细胞中分别观察到80％或50％的m6A水平抑制作用(图7)。
使用RNA下拉测定法，将3'-生物素标记的寡核苷酸在293总细胞裂解物中温育，测试目标序列是否结合METTL3。如图6所示，根据本公开实施方案的RNA寡核苷酸可在体内结合METTL3，但不结合METTL14。
实施例5
用寡核苷酸空间阻断剂靶向宿主METTL3会抑制扎那米韦抗性
METTL3的有效结合以及对宿主m6A的抑制作用表明，根据本公开实施方案的RNA寡核苷酸可以充当METTL3的空间阻断剂，并且可以用作抗病毒活性剂(诸如扎那米韦)的佐剂以抑制耐药性。为了测试这一点，单独地或与扎那米韦组合用目标寡核苷酸或稳定的寡核苷酸(图9)处理MDCK细胞，并且在10轮选择后测定EC50水平。如图9所示，观察到与对照相比，用目标寡核苷酸或稳定的寡核苷酸预处理的细胞的耐药性降低(加扰：337nM相对于目标寡核苷酸：8nM和稳定的寡核苷酸：70nM)。此外，观察到相应病毒RNA中的m6A甲基化伴随减少(图8)，表明这些变化是由于病毒RNA m6A水平的变化引起的。
尽管本发明结合其具体实施方案进行了详细描述，但对于本领域的普通技术人员来说将显而易见的是，可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行各种变化和修改。
Claims (40)
1.一种降低有需要的受治疗者的耐药性的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，优选地寡核苷酸，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平，从而降低所述受治疗者的耐药性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂，优选地所述寡核苷酸，是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述RNA寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中将所述有效量的药剂与抗流感药物组合施用于所述受治疗者。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗流感药物是神经氨酸酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述神经氨酸酶抑制剂选自扎那米韦和奥司他韦。
9.一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，优选地寡核苷酸，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平，从而在所述受治疗者中刺激免疫应答。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂，优选地所述寡核苷酸，是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的RNA寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数，任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述RNA寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成，任选地，所述寡核苷酸中的一个或多个核苷是经修饰的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
14.一种RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和根据权利要求14所述的寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，所述药物组合物还包含抗病毒活性剂，优选地抗流感药物。
17.一种在有需要的受治疗者中治疗疾病的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用根据权利要求15或16所述的药物组合物，其中所述疾病是刺激免疫应答将会有益的疾病。
18.一种试剂盒，所述试剂盒包含抗病毒活性剂和根据权利要求14所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸和所述抗病毒活性剂存在于同一组合物或不同组合物中。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述抗病毒活性剂是抗流感药物，所述抗流感药物是神经氨酸酶抑制剂。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述神经氨酸酶抑制剂选自扎那米韦和奥司他韦。
21.一种预防或治疗已施用药物的受治疗者的耐药性的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，优选地寡核苷酸，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述药剂，优选地所述寡核苷酸，是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述药剂是寡核苷酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸是RNA寡核苷酸。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸是空间阻断剂。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸包含(RRACH)n的多核苷酸序列，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸中的至少一个核苷是经修饰的。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸含有2'氟修饰。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸是腺苷。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
32.根据权利要求21所述的方法，其中所述药物是抗病毒剂。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述抗病毒剂是抗流感剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗流感剂是神经氨酸酶抑制剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述神经氨酸酶抑制剂选自扎那米韦和奥司他韦。
36.一种在有需要的受治疗者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述受治疗者施用有效量的药剂，优选地寡核苷酸，所述药剂降低所述受治疗者中的N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化的水平。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述药剂，优选地所述寡核苷酸，是甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和威尔姆氏瘤1相关蛋白(WTAP)中的至少一种的抑制剂。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述药剂是包含(RRACH)n的多核苷酸序列的寡核苷酸，其中至少一个R独立地为鸟苷，并且另一个R独立地为鸟苷或腺苷，A为甲基化或未甲基化的腺苷，C为胞苷，H独立地为腺苷、胞苷或尿苷，并且n为2至6的整数。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GGACUGGACUGGACUGGACU 3’(SEQ ID NO:1)的多核苷酸序列组成。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述寡核苷酸由5’GG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CUGG/i2FA/CU 3’(SEQ ID NO:2)的多核苷酸序列组成，其中i2FA表示2'-氟-腺苷。
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