CN112154318A - 对流式细胞术数据进行快速再补偿以用于溢出再调节 - Google Patents

Abstract

在一个实施方式中，提供了一种在流式细胞术实验中执行快速补偿的方法。该方法包括以下步骤：通过使用多个单染色补偿对照来生成初始溢出矩阵；使样本穿过流式细胞仪；通过对穿过流式细胞仪的多个细胞的荧光进行测量来生成测量出的样本事件矢量；通过使用初始溢出矩阵和测量出的样本事件矢量来生成经补偿的样本事件矢量；通过对初始溢出矩阵进行精细调节来生成经调节的溢出矩阵；以及通过使用经调节的溢出矩阵和测量出的样本事件矢量来计算经再补偿的事件矢量。

Description

对流式细胞术数据进行快速再补偿以用于溢出再调节

相关申请的交叉引用

该非临时专利申请要求发明人Zhenyu Zhang于2018年5月21日提交的题为FASTRECOMPENSATION OF FLOW CYTOMETERY DATA FOR SPILLOVER READJUSTMENTS的美国(US)专利申请No.62/674,273的权益，其全部意图和目的通过引用并入于此。

该专利申请涉及发明人Ming Yan等人于2017年7月25日提交的题为COMPACTDETECTION MODULE FOR FLOW CYTOMETERS的美国(US)专利申请No.15/659,610，其出于所有意图和目的通过引用并入于此。该专利申请还涉及David Vrane等人于2017年4月26日提交的题为COMPACT MULTI-COLOR FLOW CYTOMETER的US专利申请No.15/498,397，其描述了可以使用实施方式的流式细胞仪(cytometer)，并且出于所有意图和目的通过引用并入于此。该专利申请还涉及发明人David Vrane于2017年11月19日提交的题为FLOW CYTOMETERYSYSTEM WITH STEPPER FLOW CONTROL VALVE的US专利申请No.15/817,277，其描述了流式细胞仪的射流(fluidic)系统，并且出于所有意图和目的通过引用并入于此。

技术领域

本发明的实施方式总体上涉及对流式细胞仪数据进行分析以确定微粒在样本中的计数。

背景技术

流式细胞仪通常具有由一个或更多个激光器照明的观察孔。来自所述一个或更多个激光器的激光轰击(strike)穿过该孔的各种荧光素标记的微粒。荧光素标记的微粒通常是样本中的用不同荧光素(fluorochrome)(荧光染料)标记的各种生物细胞，可以对所述细胞进行分析以获得关于该样本的可以推广到整体的信息。流式细胞仪中的一个或更多个光学检测器被用于感测由来自一个或更多个激光器的激光轰击的穿过该孔的荧光素标记的微粒发射的荧光(fluorescence)(荧光)。

在来自荧光素标记的微粒发射的荧光到达每个检测器之前，可以布置一个或更多个不同的滤光片。滤光片被布置在发射荧光路径中，使得每个检测器仅看到与荧光素的预期荧光相关联的特定带宽的光。即，任何给定滤光片的带宽都利用特定荧光染料的发射光谱中的峰值。这样，针对任何给定微粒，来自检测器的集总信号指示附着于微粒的一个或多个荧光素的类型。由检测器从所发射的荧光中检测到的信号允许对样本中的各种微粒进行快速且全面的细胞分类。

然而，发射光谱可能在染料之间交叠。这限制了可以通过单个激光器和检测器在给定微粒上同时检测的不同荧光素的数量。因为发射带宽通常在30纳米(nm)与60nm之间的波长范围内，所以常规流式细胞仪通常可以检测每条激光线不超过四个或五个荧光素。增加激光器的数量提供了有利但昂贵的方法来增加可以同时检测的荧光素的数量。

使对所发射的荧光的检测进一步复杂的事实是，用于给微粒着色的许多染料在不同于且大于典型30nm至60nm带宽范围的激光波长范围内被激发。这可能导致针对不同激光器的检测器之间的信号串扰。

现有流式细胞术(cytometry)荧光检测系统通过增加准直透镜焦距来限制发散。然而，根据所要求的最终图像尺寸，这导致更大直径的光束，其限制了检测器的数量，诸如限于六个检测器。在这些现有流式细胞术系统中，最终图像尺寸在将大尺寸光学成像(诸如800微米(μm))和宽带光(例如，波长为400nm-800nm)准直到直径小于3毫米(mm)的一组检测器中时受到光学像差约束。

在另一流式细胞术系统中，针对排成一行的一组检测器的检测器链中的每个检测器，利用球形微镜对入射光进行重新成像。重新成像避免了上述流式细胞术系统的发散准直光问题。然而，检测器的数量受到由来自球形微镜的反射引入的像差限制。由于图像尺寸沿检测器链增加，因此为了增加检测器链中排成一行的检测器通道数量，需要大面积检测器，从而导致体积庞大且昂贵的大型流式细胞仪。

光谱交叠的发射光谱的分辨率对于增加可检测荧光素的数量也是重要的。可以使用检测器阵列来基于跨多个波长的集总发射特征(signature)来识别荧光素，从而增加可检测荧光素的数量。本质上，通过衍射光栅或者棱镜将整个荧光信号色散到检测器阵列中。以这种方式，整个发射光谱跨多个检测器被离散化。可以使用光谱解卷积(解混)来计算已知单个荧光素光谱对总集总信号的贡献。然而，这种用于增加可检测荧光素数量的方法有两个主要限制。

色散部件/检测器阵列的连续线性特性不允许调节带宽以利用荧光素光谱的真实性质。因此，较宽带宽的识别有利于较长波长的荧光素，而忽视了具有压缩光谱的较短波长荧光素的细节。此外，来自其它激光器的散射光(若存在的话)不可避免地被检测器阵列收集。这种散射光损害了检测器要检测的荧光信号。

因此，需要在流式细胞仪中进一步改进以增加可检测荧光素的数量并且更好地分析样本中的荧光素标记的微粒。

发明内容

本发明的实施方式通过所附权利要求来概括。

附图说明

图1是流式细胞仪系统的检测模块的框图。

图2A是具有连续通道重新成像的图像阵列的示意图。

图2B是具有交替通道重新成像的1f图像阵列的示意图。

图3是紧凑检测模块的示意图，该模块包括用于模块化流式细胞仪系统的16通道1f图像阵列。

图4A是在光纤直径上的不同点处离开的荧光的放大图。

图4B是用于将光信号转换成电信号的检测器的放大图。

图5是1f图像阵列的一部分的放大图。

图6是具有16通道1f图像阵列和16个检测器通道的模块化流式细胞仪系统中的检测模块的视图。

图7A至图7C是模块化流式细胞仪系统中的检测模块的不同图解视图，该系统具有一对8通道1f图像阵列和一对8个检测器通道。

图8是具有球形微镜的1f图像阵列的立体图。

图9A至图9B是图8的1f图像阵列的截面图。

图10是具有凹矩形微镜的1f图像阵列的立体图。

图11是图10的1f图像阵列的一部分的顶侧视图。

图12是邻近成像块的安装块以及用于图6和图7A至图7C的检测器模块中的低成本薄外形检测器的立体图。

图13是模块化流式细胞术系统中的光学板组装件的俯视图。

图14是流式细胞仪系统的基本概念图。

图15是在流式细胞仪上执行实验的总体方法。

图16A是流式细胞仪利用单染色补偿对照来生成具有多个补偿水平的初始溢出矩阵(initial spillover matrix)或参考矩阵的校准过程的视图。

图16B是使样本穿过流式细胞仪从而产生因多染色细胞或微粒导致的具有交叠光谱曲线的混合样本事件矢量的视图。

图16C是对事件数据使用(由初始溢出矩阵和/或具有精细调节的初始参考矩阵确定的)逆矩阵以生成经补偿的样本事件矢量或经解混的样本事件矢量的处理的视图。

具体实施方式

在本实施方式的下列详细描述中，阐述了许多具体细节，以便提供彻底理解。然而，本领域技术人员显见的是，本实施方式可以在不需要这些具体细节的情况下来实践。在其它情况下，公知方法、过程、组件以及电路未被详细描述，以不使不必要地模糊本发明的实施方式的各个方面。

本发明的实施方式包括用于具有紧凑的高度复用检测模块的流式细胞仪的方法、装置以及系统。

一般概述

公开了一种具有针对荧光的紧凑检测模块的流式细胞仪，与现有流式细胞仪相比，其检测器数量增加并且在检测器处的图像尺寸最小。每个检测器模块由至少一个激光器馈送。多个激光器可以以紧凑方式由多个检测器阵列支持。当光被发射通过检测链时，通过仔细控制检测器阵列中的增量像差，可以增加检测器的数量。紧凑检测模块的紧凑尺寸通过微镜与滤光片之间的缩小距离以及仔细向下缩放来实现，从而沿着成像阵列中的微镜和滤光片的行或链最小化图像劣化。

通过使用具有多个单独检测器和滤光片带宽的可调节级数的光学系统，可以克服现有限制。该光学系统使光谱配置点集中，以最佳地分辨用于标记由流式细胞仪分析的微粒的长波长染料和短波长染料两者的光谱。来自被激发微粒的荧光通过具有高数值孔径(NA)的物镜被成像到多模光纤中。离开多模光纤的宽带荧光被准直，然后被耦合到(成像到)多个检测器中。离开多模光纤的宽带荧光的准直是一个挑战。

用于流式细胞仪的检测模块

图1示出了流式细胞仪的检测模块100的一部分的功能框图。高级流式细胞仪可以包括多个检测模块。检测模块100是波长解复用系统。检测模块100在图像阵列106中连续地反射和重新成像来自光纤102的荧光输出101A。图像阵列106是机械图像阵列，其包括通过机械安装悬浮在空中的多个反射镜112A-112E以及对应多个长通二向色滤光片110A-110E。通常，二向色滤光片是精密滤光片，其被用于使一波长范围的彩色光中的光选择性地通过，同时反射其它波长的彩色光。另选地，所述多个长通二向色滤光片110A-110E可以是带通滤光片。

图像阵列106能够反射地重新成像光纤光斑(spot)N次(其中，N大于2)，同时保持该光纤光斑在图像阵列末端的光学质量。重新成像是在诸如二向色滤光片110A-110E中的每个的表面处重新创建具有一些像差的原始图像(重新成像，reimage)的功能。检测模块100还包括多个检测器通道113A-113E，多个检测器通道分别包括多个物镜116A-116E以及相互光连通的多个检测器118A-118E。可选地，所述多个检测器通道113A-113E还可以分别包括多个带通滤光片114A-114E，以确保所述多个检测器检测到各个希望波长范围。

在图像阵列106中，入射到第一反射镜110A上的光101A被该反射镜反射成反射光103A。来自第一反射镜110A的反射光103A穿过空气并入射到第一长通二向色滤光片112A上。来自第一反射镜110A的光103A被长通二向色滤光片112A分成连续光部分101B和穿过或透射光部分105A。连续光部分101B穿过空气并入射到该系列反射镜中的下一个反射镜，即，反射镜110B。透射光部分105A耦合到第一检测器通道113A的第一带通滤光片114A中。透射光部分105A由带通滤光片114A净化，然后由物镜116A耦合到光学检测器118A中。对于图像阵列106中的每一级(检测器通道)重复该过程。

图像阵列106包括在每个长通二向色滤光片上重新成像五次的五级。仍然希望包括更多数量的检测器。然而，在经过超过5次的重新成像后，通过反射镜的光束失真可能累积到在最后二向色滤光片处的图像质量变得高度劣化的程度。为了使图像阵列106中的反射镜与二向色滤光片之间的之字形配置与更多数量的检测器一起适当地执行，希望最小化沿光路的图像劣化。

利用两种机制可以实现最小化检测模块中的图像劣化。如果图像阵列中的每个反射镜的弯曲度减小(例如，减小二分之一-弯曲度的一半)，则可以减少图像劣化。如果光束在图像阵列中被重新成像的次数减少(例如，减少一半-一半的次数)，则可以进一步减少图像劣化。

减小反射镜的弯曲角度可以减少所有类型的像差。由于像差随弯曲角度非线性地增加，因此从“快聚焦镜”切换到“慢聚焦镜”所获得的改善显著优于2X，从而允许保持通过更多反射的图像质量。通过减少光束在图像阵列中重新成像的次数，可以进一步改善入射在检测器链中的最后一个检测器上的图像质量。代替针对每个检测器通道在每个二向色滤光片上重新成像，入射光可以每隔一个二向色滤光片和检测器通道(例如，奇数检测器通道)重新成像。

现在参照图2A至图2B来描述图像阵列106A-106B，其通过利用具有不同曲率半径的微镜的透明块来提供图像质量的改善。通常，图像阵列由针对每个检测通道的微镜阵列和相对的带通和/或二向色滤光片阵列组成。在每一种情况下，在一侧上的微镜M(n)、M(n)'的串行链或行与在相反侧上的二向色滤光片D(n)的串行链或行之间的透明块的厚度L相同。然而，微镜M(n)和M(n)'的焦距在图2A至图2B的图像阵列106A-106B中不同。

图2B中的微镜M(n)'的焦距f是L，而图2A中的微镜M(n)的焦距f是L的一半。图像阵列106B中的微镜M(n)'的较大焦距减小了沿反射镜的串行链成像时的弯曲角度和像差。而且，图像阵列106B是1f图像阵列，其具有给定透明块的厚度L和微镜M(n)'的焦距，以使在奇数二向色滤光片(诸如，二向色滤光片D(3)、D(5)、D(7)直到D(n))上发生重新成像。

在图2A至图2B中，光斑A(1)到光斑A(n)分别是二向色滤光片D(1)到D(N)上的光斑尺寸(面积)。光斑A(0)是多模光纤的光纤孔径，荧光从该光纤孔径被输入到每个阵列106A-106B中。在图2A和图2B中，光纤孔径可以被认为是无限小的，以例示这两种设计的图像共轭特性。

图2A例示了具有多个微镜M(1)至M(n)和多个长通二向色滤光片D(1)至D(N)的图像阵列106A，其中N是大于一的整数值，表示检测器通道的数量。通过微镜M(1)的反射，聚焦在二向色滤光片D(1)上的光斑A(1)处的光通过微镜M(1)的反射被重新成像，以将光聚焦在二向色滤光片D(2)上的光斑A(2)处。微镜M(2)到M(N)中的每个沿着串行链或行重复这一过程。图像阵列106A是2f图像阵列。

图2B例示了针对具有多个微镜M(1)'至M(N)'和多个长通二向色滤光片D(1)至D(N)的图像阵列106B的1f设计。微镜M(1)'到M(N)'具有与微镜M(1)到M(N)的曲率半径不同的曲率半径。1f图像阵列106B在检测器(例如，图1中的检测器118A-118E)处提供超过2f图像阵列106A的图像质量改善。

1f图像阵列106B中的微镜M(1)'到M(N)'链被设计成通过望远镜光学器件的特性沿着该链中继图像。例如，通过微镜M(1)'和M(2)'的望远镜效应，聚焦在二向色滤光片D(1)上的光斑A(1)处的光被成像至二向色滤光片D(3)上的光斑A(3)。偶数光斑(光斑A(2))是准直空间中的中间光斑。

所述多个长通二向色滤光片D(1)至D(N)可以另选为通带或带通滤光片，或者包括组合在一起的二向色滤光片和带通滤光片两者，以确保有限波长范围的光穿过。二向色滤光片使用薄膜干涉原理，也可以被称为干涉滤光片。针对每个通道，调谐带通或通带滤光片以将不同的所选波长范围(通带)的光透过至每个检测器，并将其余的光波长反射回微镜阵列中的微镜。

为了提供紧凑检测器模块，图像阵列106B由实心透明材料形成，如参照图8和图10进一步说明的。用于1f图像阵列的透明成像块的实心透明材料可以是透明玻璃或透明塑料，例如，在透明材料中或上形成反射镜和二向色滤光片。

可以在相同厚度的实心透明材料、相同节距以及相同入射角的条件下，比较1f图像阵列106B的设计和2f图像阵列106A的设计。2f图像阵列106A和1f图像阵列106B中的相邻微镜之间的路径距离相似。在这种情况下，路径距离是考虑材料的折射率的物理距离，而不是常规路径长度。然而，2f图像阵列106A中的微镜的焦距比1f图像阵列106B中的微镜的焦距短(一半)。换句话说，由于微镜的不同曲率半径，1f图像阵列106B中的微镜的实际焦距是2f图像阵列106A中的微镜的焦距的两倍。较长的焦距会减小每次反射的弯曲度，这最小化微镜反射中引入的像差。因此，1f图像阵列106B中的像差相比2f图像阵列106A的像差得到改善。

在2f图像阵列系统106A中，光纤孔径A(0)被成像至二向色滤光片D(1)上的光斑A(1)。光斑A(2)处的图像是通过微镜M(1)反射的光斑A(1)的重新成像。继续通过阵列106A中的之字形光路，每个二向色滤光片D(n)处的每个光斑A(n)由下一个微镜M(n)成像至下一个二向色滤光片D(n+1)上的下一个光斑A(n+1)。在该配置中，光斑A(n)与微镜M(n)之间的路径距离是透明块的厚度L，该厚度L是微镜M(n)的焦距的2倍(两倍)。

在1f图像阵列系统106B中，来自光纤孔径A(0)的光通过输入通道成像至二向色滤光片D(1)上的光斑A(1)。在图像阵列系统106B中，可以认为从微镜M(1)'到微镜M(2)'的光路形成放大倍率为1的等效望远镜。在这种情况下，通过微镜M(1)'和M(2)'的望远镜，光斑A(1)被成像至光斑A(3)，其中，光斑A(2)是准直空间中的中间光斑。相邻的微镜M(3)'和M(4)'形成另一个望远镜，以将光斑A(3)重新成像至光斑A(5)。继续成像阵列106B中的之字形路径，奇数光斑A(1)、A(3)、A(5)、…、A(2n+1)全部彼此共轭，而偶数光斑A(2)、A(4)、A(6)、…、A(2n)是准直空间中的中间光斑。在该配置中，光斑A(n)与微镜M(n)'之间的路径距离是透明块的厚度L，该厚度L是微镜M(n)'的一倍焦距。

滤光片上的每个光斑由一束光线形成。光束的角度分布由输入多模光纤102的数值孔径(NA)和针对成像系统的成像阵列的输入通道确定。光斑A(1)处的光锥角与多模光纤102的数值孔径成比例。如果从光纤孔径A(0)到光斑A(1)的图像放大倍率m是1比m的比率(其中，m大于1)，那么光斑A(1)处的锥角比光纤孔径A(0)处的锥角小m分之一。

在图2A的2f图像阵列系统106A中，对于n的任何值来说，从任意光斑A(n)到相邻光斑A(n+1)的图像放大倍率等于1。在无视像差的情况下，对于所有检测器通道来说，图像阵列系统106A的二向色滤光片D(1)到D(n+1)处的光锥角是相同的。

现在参照图2B，二向色滤光片D(1)与微镜M(1)'之间的距离是L。如果在1f图像阵列106B中的通道总数N是偶数，则光斑A(1)通过微镜M(1)'-M(2)'(考虑1X望远镜)被成像至光斑A(3)，并且二向色滤光片D(2)上的光斑A(2)处于准直空间中。光斑A(2)处的准直光的一部分被二向色滤光片D(2)朝向微镜M(2)'反射。

因此，1f图像阵列106B在光斑A(1)、A(3)、…、A(2k-1)、…到A(N-1)处具有奇数检测器通道，而在光斑A(2)、A(4)、…、A(2k)、…到A(N)处具有偶数检测器通道，其中，1≤k≤(N/2)。由于光斑A(1)处于微镜M(1)'的前焦点，并且相邻微镜之间的路径距离是焦距的两倍，因此所有奇数光斑A(1)、A(3)、A(5)、…、A(2n+1)均是光纤孔径的图像(如图2B中由到奇数光斑的光线会聚所示)，而所有偶数光斑A(2)、A(4)、A(6)、…、A(2n)位于准直空间中(如图2B中由偶数光斑处的平行光线所示)。因此，如图5所示，奇数检测器通道的奇数光斑的锥角(奇数锥角CAO)与偶数检测器通道的偶数光斑的锥角(偶数锥角CAE)不同。

在1f图像阵列106B中，每个光学二向色滤光片D(1)到D(N)的中心波长和通带宽度彼此不同。设计每个光学二向色滤光片的中心波长和通带宽度，以优化染料荧光光谱的采样，从而更好地准确解混大量不同的染料。例如，假设光波长为400nm至800nm的荧光光谱和十六(16)通道检测模块，可以各自分析光波长为25nm的带宽。例如，第一检测器通道和第一个二向色滤光片D(1)可以带通和分析中心波长为412.5nm的400nm至425nm的光波长。基本上滤除400nm至425nm之外的波长，而不使其传输到第一检测器通道中的第一检测器上。第二检测器通道和第二个二向色滤光片D(2)可以带通和分析中心波长为437.5nm的425nm至450nm的光波长，并且针对每个检测器通道递增等等。最后一个或第十六检测器通道和第十六个二向色滤光片D(16)可以带通和分析中心波长为787.5nm的775nm至800nm的光波长。

1f图像阵列106B的特性允许初始光信号传播到比2f图像阵列106A更多数量的检测器中。1f图像阵列106B通过降低每个镜面反射中的弯曲度来减小离轴像差。然而，在奇数通道和偶数通道中的二向色滤光片处的奇数锥角CAO与偶数锥角CAE不同的情况下，需要确定从光纤孔径A(0)到二向色滤光片D(1)处的光斑A(1)的输入级中的最佳放大倍率m。对于给定的光纤数值孔径(NA)和孔径直径来说，从光纤孔径A(0)到二向色滤光片D(1)处的光斑A(1)的放大倍率m针对1f图像阵列106B中的奇数检测器通道和偶数检测器通道被优化。

从光谱分辨率的角度来看，随着入射光斑的锥角增大，二向色滤光片性能劣化。在1f图像阵列106B中，奇数通道中的光斑的锥角与偶数通道中的光斑的锥角不同。基本上，奇数通道中的锥角是由多模光纤的数值孔径(NA)和从光纤孔径A(0)到二向色滤光片D(1)处的光斑A(1)的放大倍率系数m确定的。与此相反，偶数通道的锥角是由奇数通道中光斑的光斑的直径确定的。

在输入通道中，假设从光纤处的孔径A(0)至二向色滤光片D(1)处的光斑A(1)的图像放大倍率是m。在偶数检测器通道(二向色滤光片D(2k))处，锥角与放大倍率m成比例。然而，在奇数检测器通道(二向色滤光片D(2k-1))中，锥角与放大倍率m成反比。从光纤孔径A(0)到光斑A(1)的较大放大倍率导致奇数检测器通道(二向色滤光片D(2k-1))处的锥角较小，但是偶数检测器通道(二向色滤光片D(2k))处的锥角较大。在具有NA＝0.12、孔径直径600μm、微镜(滤光片)节距5.5mm的多模光纤的一个示例实施方式中，推荐放大倍率m被建模为大约2。显然，可以利用不同输入确定其它放大倍率m，因此这里所公开的实施方式不限于2X放大倍率。在针对1f图像阵列106B呈现的示例中，数值孔径(NA)和重新成像的数量都减少了二分之一，从而与2f图像阵列106A相比，允许沿着相同长度的一行有至少四倍(4X)多的检测器。

图3、图4A至图4B以及图5例示了具有1f图像阵列106B的紧凑检测模块的模拟结果以及具有NA＝0.12、孔径直径600μm、微镜(滤光片)节距5.5m的光纤、以及推荐放大倍率2X的实施方式的示例输入值的图表。图3、图4A至图4B以及图5中所示的不同颜色的光线仅为清楚起见示出了不同位置处的光如何穿过检测器模块。

图3示出了光纤102的将荧光发射到检测系统中的一个端部。靠近光纤102的相反端(未示出)，可以使用具有高NA的集光物镜以从孔径中收集荧光并将其耦合到光纤的该相反端中。然后，光纤102收集来自物镜的光并将其引导至图3所示的端部。靠近图3所示的端部，该系统可以包括光纤数值孔径转换器，以将数值孔径降低到自由空间，以便将荧光发射至检测器阵列。

现在参照图3，紧凑检测模块300中的放大倍率m由输入级301实现。输入级301包括：准直透镜302、阻挡滤光片303以及聚焦透镜304。通过调节准直透镜302和聚焦透镜304的焦距比来实现放大倍率m。例如，为了将放大倍率设定成等于2(m＝2)，聚焦透镜304的焦距是准直透镜302的焦距的两倍。输入通道301可以被认为还包括在到达第一个二向色滤光片D(1)之前图像阵列106B中的透明块的输入部分(例如，楔形、块厚度，参见图8)。

准直透镜302接收从光纤102发射的光并使光准直。准直光穿过阻挡滤光片303并传输到聚焦透镜304。阻挡滤光片303被用于清除散射到光纤102的相反端附近的收集光学器件中的激光。与荧光素相关联的荧光光谱的光穿过阻挡滤光片303并进入聚焦透镜304。聚焦透镜304将该荧光光谱的光聚焦到图像阵列106B中的第一个二向色滤光片D(1)上，以在光斑A(1)处形成图像。光斑A(1)处的图像的尺寸(例如，直径和面积)比光纤处的孔径A(0)处的尺寸放大m倍。可以调节透镜302、304在光纤102的所述端部与图像阵列106B之间的位置。

紧凑检测模块300还包括与图像阵列106B连通的十六(16)通道1f图像阵列106B和十六(16)个检测器通道313A-313P(例如，参见图6)。在另选实施方式中，可以并行使用一对八(8)通道1f图像阵列(例如，参见图7A至图7C)以放宽每个紧凑图像阵列的成像要求。在流式细胞仪中，这些紧凑图像阵列中的超过一个(例如，三个)图像阵列可以用于将检测器通道的数量倍增为大于十六(例如，对于四十个检测通道来说，三乘十六，如参照图13描述的检测器模块所解释的)。

图像阵列106B由实心透明块材料形成。十六(16)通道1f图像阵列106B在透明块的一侧上包括十六(16)个二向色滤光片D(1)至D(16)，并且在相反侧上包括十五个反射镜M(1)到M(15)。该图像阵列不需要有反射镜跟随在最后一个检测器通道313P之后。此外，最后一个滤光片D(16)314可以不是二向色滤光片；相反，可以使用带通滤光片。在带通滤光片的情况下，入射光不需要进一步被反射至另一反射镜或滤光片。

阵列或检测器中的每个检测器通道313A-313P(统称为检测器通道313)包括聚焦透镜316和检测器318(图3中示出了一个实例)。检测器318封装在薄外形(TO)罐式封装320中，聚焦透镜316联接至或集成到该TO罐式封装。聚焦透镜316将穿过滤光片的荧光聚焦到检测器318的小面积尺寸上。

现在参照图4A，用于将从图像室捕获的荧光信号传输至检测器阵列的光纤102是多模光纤。光从光纤直径上的各个(如果不是全部)位置(举例来说，诸如位置X1至X5)离开多模光纤的端面。图3所示的处于输入通道中的透镜303、304将光聚焦在孔径A(0)内，直到第一个二向色滤光片D(1)上的光斑A(1)。因为从光斑A(0)至光斑A(1)存在两倍(2X)放大倍率，所以孔径A(0)处的光斑尺寸小于光斑A(1)处的光斑尺寸。从图4A中所示的孔径内的不同位置X1到X5发出的光线的不同颜色仅为了清楚起见，以示出不同位置处的光如何穿过检测器模块。如图4A所示，光轴402从光纤102的所述端部的圆形中心向外延伸。光以相对于光轴402的发射锥角(CA)404从光纤102的所述端部射出。

图3示出了图像阵列106B的模拟结果和如何通过反射镜和二向色滤光片的多次反射对来自光束中的不同位置的光交替地进行成像和准直。虽然这些结果示出了所有的光反射，但是在任何特定位置处的二向色滤光片D(n)是不同的，并且允许根据它们各自的通带传输光信号(仅在图3中的最后一个检测器通道313P中示出)。

现在，参照图3和图4B，在每个检测器通道313中，穿过二向色滤光片D(n)的希望波长范围的光信号可以通过透镜316被收集并且由小孔径光敏检测器318检测。在每个检测器通道中可以另选地或进一步使用另一带通滤光片314。二向色滤光片D(n)处的其它波长的光(若有的话)沿着微镜的链或行被反射至下一个微镜M(n)。该行或链的二向色滤光片D(n)将不同范围的光波长解复用到检测器通道313A-313P的链中。

图5的放大图示出了光束如何通过微镜和二向色滤光片的反射面交替成像和准直的模拟结果。在奇数编号的二向色滤光片(例如，图5所示的二向色滤光片D(7)、D(9)以及D(11))上，光斑是光纤孔径的图像。即，从光纤孔径发射的光被成像至奇数编号的二向色滤光片的每个滤光片表面。在偶数编号的二向色滤光片(例如，图5所示的二向色滤光片D(8)、D(10)以及D(12))上，偶数编号的光斑(图5所示的光斑A(8)、A(10)以及A(12))处于准直空间中，其中，从光纤孔径处的点发射的光线变为准直束。对于来自光纤孔径的不同点来说，每个偶数编号的二向色滤光片处的准直空间中的束方向略有不同。

在流式细胞仪中，可以使用一个或更多个线性16通道紧凑波长检测模块来检测与微粒相关联的光的荧光信号。另选地或者联合地，可以在流式细胞仪中使用一个或更多个双8通道紧凑波长检测模块来检测与微粒相关联的光的荧光信号。

图6和图7A至图7C例示了紧凑波长检测模块的实施方式，其具有图2B所示的1f图像阵列106B的功能。图6例示了线性16通道紧凑波长检测模块600。图7A至图7C例示了双8通道紧凑波长检测模块700。

现在参照图6，线性16通道紧凑波长检测模块600包括输入级(端头)601和安装至基部610的检测模块614。光通过光纤102耦合到输入级(端头)601中。输入级(端头)601包括安装至光具座的准直透镜602、长通滤光片603、净化光学阻挡器604以及聚焦透镜605。输入级(端头)601设定第一个二向色滤光片上的初始光斑尺寸图像A(1)的放大倍率m。

从输入级601开始，光被耦合到检测模块614中。输入级(端头)601的一端联接至透明光楔(wedge)607以接收来自聚焦透镜605的光。输入级(端头)601和检测模块614联接至流式细胞仪的底盘或基部610，以保持它们的对准。

检测模块614包括1f图像阵列608和检测器/透镜阵列611。图像阵列608是图2B和图5的图像阵列106B的实施方式。图像阵列608包括透明块680(例如，参见图8和图10的块806、1006)，所述透明块包括一侧的光楔607和十五个微镜612。在透明块680的相反侧，存在十六个二向色滤光片609。检测器/透镜阵列611(所述多个检测器313A-313P的实施方式)包括多个光电检测器D1到D16(例如，图3的检测器318)，每个光电检测器都具有透镜(例如，图3的透镜316)，以将解复用的光聚焦到光电检测器中。

由输入级601耦合到图像阵列608中的光被波长解复用到检测器/透镜阵列611的检测器D1到D16中。16通道检测模块分析波长的范围(例如，400nm至800nm波长)。

为了提供更好地适配测试平台的不同占地面积并且提供并行处理，线性16通道紧凑波长检测模块600可以代替地实现为双8通道紧凑波长检测模块。

现在参照图7A，示出了双检测模块700的俯视图，其具有一对8通道紧凑波长检测模块714、715。紧凑波长检测模块700包括与第一8通道检测模块714和第二8通道检测模块715连通的输入级(端头)701，所有这些模块都被安装成与基部710对准。第一8通道检测模块714解复用且并行地分析第一范围的波长(例如，650nm至800nm-红光波长)。第二8通道检测模块715解复用并且并行地分析第二范围的波长(例如，400nm至650nm-蓝光波长)。

从光纤102发射的光耦合到输入级(端头)701中。来自光纤102的光穿过准直透镜702进入长通二向色滤光片703。长通二向色滤光片703以45度角将处于激光激发波长(例如，小于400nm)的光反射至散射检测器(未示出)。侧向散射(SSC)光可以聚焦到具有类似于针对荧光所描述的球透镜的小孔径检测器上。处于荧光光谱(例如，400nm-800nm)的荧光穿过长通滤光片703并且进入第二净化滤光片704。净化滤光片704确保没有激发激光到达解复用检测模块714-715。

在净化滤光片704之后，通过长通滤光片705将荧光分离成长波长频带和短波长频带。长波长光(例如，红光-650nm至800nm)穿过长通滤光片705并被准直/聚焦透镜706聚焦到第一检测模块714中。光的穿过且被聚焦透镜706聚焦的长波长部分由第一检测模块714解复用。短波长光频带(例如，蓝光-400nm至650nm)由长通滤光片705以一角度反射回到准直/聚焦透镜713中。准直/聚焦透镜713将短波长频带的光聚焦到第二检测模块715中。由长通滤光片705反射的短波长部分由第二检测模块715解复用。另选地，滤光片705可以是短通滤光片，并且短波长光穿过该滤光片并由第一检测模块714解复用，而长波长光由该滤光片反射并由第二检测模块715解复用。

参照第一检测模块714，在成像到第一个二向色滤光片或带通滤光片709上之前，来自聚焦透镜706的光垂直进入12度楔面707，并且穿过图像阵列708的透明块(例如，图8的块806)。光穿过带通滤光片709并聚焦到检测器/透镜阵列711中的第一个小面积检测器D1上。由带通滤光片709拒绝的光被反射回到图像阵列中的多个微镜M(1)到M(7)中的第一微镜M(1)712上。第一微镜M(1)712使光准直并将光反射回到第二检测模块D2，依此类推，直到图像阵列708的透明块的微镜和检测模块的串行链末端。第二检测模块715与第一检测模块714类似地起作用。

反射前进通过图像阵列106B，如本文所述的第一检测模块714和第二检测模块715中的每个中的708、708'交替地将光聚焦和准直，连续较短的带通光通过二向色滤光片，分别进入奇数检测器通道和偶数检测器通道中的奇数检测器和偶数检测器118。因此，通过第一检测模块714和第二检测模块715中的每一个中的多个检测器解复用不同波长。

针对给定荧光事件，来自每个检测器(例如，图4B所示的检测器318、图6至图7中的透镜/检测器D1到D16)的信号被电子器件系统放大、数字化并同步，以提供输入荧光信号的光谱表示。通过最小化检测器和放大电路的联接长度，将检测电子器件集成到光学模块组装件中允许紧凑的设计和较低的噪声。图4B中所示的检测器318将光学信号(诸如输入荧光信号)转换成电信号。

图7B和图7C分别例示了具有一对8通道紧凑波长检测模块714、715的双检测模块700的右侧立体图和左侧立体图。每个检测模块714、715包括安装基部720和盖722，以封闭检测器阵列或链中的透镜/检测器711所安装至的安装块1200(参见图12)。安装基部720和盖722使透明块806、1006中的图像阵列708、708'的部件一起与每个检测器模块714、715中的检测器阵列对准。每个检测模块714、715的安装基部720通过多个紧固件联接至基部710。

输入级701包括光具座751，光具座751具有：用于容纳滤光片703-705的多个滤光片槽；用于容纳透镜702、706、713的多个透镜槽；以及一个或更多个光通道，光沿所述光通道反射并传播通过滤光片和透镜。光具座751联接至检测模块700的基部710，以保持与检测模块714-715的对准。

图13示出了模块化流式细胞术系统100中的光学板组装件1300的俯视图。光学板组装件1300包括具有三个半导体激光器1370A、1370B、1370C的激光器系统1370，三个半导体激光器1370A、1370B、1370C将激发(excitation)引导到流式细胞组装件1308中，其中，样本流体与样本微粒一起流动。激光器系统1370试图以共线方式将多个(例如，三个)激光束引导向流式细胞组装件1308。然而，所述多个激光束可以彼此略微偏移。激光器系统1370包括波长通常约为405纳米(nm)、488nm以及640nm的半导体激光器1370A、1370B、1370C。405nm半导体激光器的输出功率通常大于30毫瓦(mW)；488nm半导体激光器的输出功率通常大于20mW；并且640nm半导体激光器的输出功率通常大于20mW。控制器电子器件控制半导体激光器在恒定温度和恒定输出功率下工作。

光学系统在空间上操纵分别由半导体激光器1370A、1370B、1370C生成的光学激光束1371A、1371B、1371C。该光学系统包括透镜、棱镜以及转向镜，以将光学激光束聚焦到携带生物细胞(bio cell)的流体流上。聚焦的光学激光束尺寸通常横跨流动流聚焦达50微米(μm)-80μm，并且通常沿着在流式细胞组装件1308中流动的流聚焦达5μm-20μm。在图13中，该光学系统包括束整形器1330A-1330C，它们分别从半导体激光器1370A-1370C接收激光1371A、1371B、1371C。从束整形器1330A-1330C输出的激光分别耦合到反射镜1332A-1332C中，以将激光1399A、1399B、1399C引导朝向流式细胞组装件1308并且进入流式细胞组装件1308，以瞄准被荧光素染料染色的微粒(例如，生物细胞)。激光1399A、1399B、1399C彼此略微分开，但是通过反射镜1332A-1332C直接大致平行进入流式细胞组装件1308。

激光束1399A、1399B、1399C到达流式细胞组装件1308中的流动流中的生物细胞(微粒)。然后，激光束1399A、1399B、1399C被流动流中的细胞散射，从而使荧光素发荧光并产生荧光。前向散射二极管1314聚集轴上散射光。集光透镜1313会聚离轴散射光和荧光并将它们一起引导至分光镜1310。分光镜1310将离轴散射光聚焦到侧向散射二极管1315上。分光镜1310将荧光聚焦到至少一个光纤端头1316上。至少一个光纤组装件102朝向至少一个检测器模块600、700路由荧光。

为了利用不同荧光染料和激光波长对生物样本进行更详细分析，可以使用多个光纤端头1316、多个光纤组装件102、以及多个检测器模块600、700。三个光纤端头1316A、1316B、1316C可以平行安置以接收荧光，并且三个光纤组装件102A、102B、102C可以被用于将荧光引导至三个检测器模块600A、600B、600C或700A、700B、700C。

三个光纤端头1316A、1316B、1316C(以及三个光纤组装件102A、102B、102C)被启用，因为三个激光光束599A、599B、599C稍微偏移(例如，不精确地共线)。因此，三个光纤端头1316A、1316B、1316C可以分别从具有三个不同波长的三个激光束599A、599B、599C收集光束数据。然后，三个光纤组装件102A、102B、102C将光引导到三个不同的检测器模块(例如，三个不同的检测器模块600A、600B、600C或700A、700B、700C)。

另选地，模块化流式细胞术系统可以使用一个检测器模块600、700来收集光束数据。例如，三个光纤组装件102A、102B、102C可以将光引导到一个检测器模块600、700中，而不是三个不同的检测器模块。然后进行光束数据的分离作为数据处理操作，而不是利用三个不同的检测器模块来分离光束数据。从物理装置的角度来看，利用一个检测器模块可能不太复杂。然而，数据处理操作可能更复杂，因为光束数据的分离需要更多的数据操纵(例如，识别不同波长并且相应地分离光束数据)。

可以通过对前向和侧向散射数据的分析来对细胞几何特性进行分类。流体流中的细胞由具有400nm至900nm范围的可见波长的染料标记。在被激光器激发时，染料产生荧光，它们由光纤组装件102收集并且朝着检测器模块600、700路由。模块化流式细胞术系统经由检测器模块600、700中的紧凑半导体激光器、11.5X焦度的集光透镜1313、以及紧凑图像阵列针对光学板组装件保持相对小的尺寸。

集光透镜1313有助于检测器模块600、700的设计。集光透镜1313具有针对11.5X焦度的短焦距。集光透镜1313(物镜)具有面对荧光发射的约1.3的高数值孔径(NA)，以在宽入射角范围内捕获荧光发射中的更多光子。集光透镜1313面对收集光纤102具有约0.12的低NA，以在窄锥角上将荧光发射到光纤中。因此，集光透镜1313从一侧的高NA转换为相反侧的低NA，以支持检测器模块600、700的输入通道中的放大倍率m。

收集光纤组装件517的芯的直径在约400μm至800μm之间，并且对于大约600μm的芯直径，光纤NA约为0.12。光纤输出端部可以逐渐变细到介于大约100μm至300μm之间的芯直径，以用于控制到接收光电二极管上的成像尺寸。

收集光纤102的输入端部还可以包括透镜化光纤端部以增加收集NA，从而允许使用小于大约400μm的光纤芯直径。因为光纤102具有在流式细胞仪系统中的任何地方递送光的灵活性，所以使用光纤进行荧光收集使能够优化用于紧凑流式细胞仪系统的接收器组装件和电子器件的位置。

为了制造低成本的流式细胞仪，可以引入更低成本的组件。每个检测模块614、714、715中的图像阵列106B由实心透明材料形成，以提供可靠、低成本和紧凑的检测模块。而且，流式细胞仪使用低成本的现成薄外形(TO)罐式检测器。

现在参照图12，在透明块806、1006(参见图8至图11)附近示出了安装块1200，它们联接在一起以形成将通过安装基部720和盖722被安装至图7A至图7C所示的紧凑检测器模块700的基部710的1f图像阵列708、708'。安装块1200包括多个成角度弯曲开口1201，以容纳多个TO罐式透镜/检测器711。安装块1200与成像阵列708的透明块806、1006的对准以及成角度弯曲开口1201的角度使得从微镜712E反射的光可以被二向色滤光片709E带通滤光并耦合到透镜/检测器711E。

每个TO罐式透镜/检测器711包括联接在一起的聚焦透镜1211和低成本的TO罐式检测器1212。TO罐式检测器1212包括窗口顶部和TO罐式封装内部的半导体光电检测器1213。半导体光电检测器1213电联接至多个电引脚1214，所述电引脚1214延伸到TO罐式封装之外，流式细胞仪的其它电子器件电联接至所述电引脚。与图4B所示的检测器318类似，半导体光电检测器1213将光学信号(诸如输入的荧光信号)转换成至少一个电引脚1214上的电信号。

现在参照图8，示出了用于1f图像阵列106B、608、708、708'的实施方式的由实心透明材料800形成的透明块806的立体图。用于透明块806的实心透明材料800例如可以是透明玻璃或透明塑料。处于一行和串行链中的多个微镜810被形成在透明材料800的透明块806的一侧中或一侧上。处于一行和串行链中的多个二向色或带通滤光片812形成在透明材料800的透明块806的相反侧中或相反侧上。每个二向色或带通滤光片812被调谐至光的不同波长范围，以允许检测由荧光素发射的宽范围的荧光。在一个实施方式中，多个微镜810是凹球面镜。

由实心透明材料800形成的透明块806还包括12度楔面820，以接收来自聚焦透镜的光，诸如参照1f成像阵列708描述的。光垂直于楔面820的表面进入并被引导(转向)朝向第一个二向色或带通滤光片D(1)。光穿过透明块806到达第一个二向色或带通滤光片D(1)。

现在参照图10，示出了用于1f图像阵列106B、608、708、708'的另一实施方式的由实心透明材料800形成的透明块1006的立体图。用于透明块1006的实心透明材料800例如可以是透明玻璃或透明塑料。多个微镜1010是形成到透明材料的一侧中的凹矩形反射镜。多个二向色或带通滤光片1012形成到透明材料800的相反侧中或上。每个二向色或带通滤光片812被调谐至光的不同波长范围，以允许检测由荧光素发射的宽范围的荧光。

实心透明材料800还包括12度楔面820，以接收来自聚焦透镜的光，诸如参照图像阵列708描述的。光垂直于楔面820的表面进入并被引导(转向)朝向第一个二向色或带通滤光片D(1)。该光穿过该透明块到达第一个二向色或带通滤光片D(1)。

现在参照图9A，横截面图例示了透明块806的一侧上的球形微镜810与相反侧之间的距离(例如，厚度L)。在球形微镜810的中心处垂直于透明块的轴814延伸到透明块806的相反侧。图9B例示了在二向色或带通滤光片812的中心处垂直于透明块的轴815。轴815延伸到透明材料800的透明块806的相反侧。轴814和815彼此平行。

在实心透明材料800的球形透明微透镜形状上形成(例如，设置)反射材料811，以在透明块806的一侧形成各个球形微镜810。二向色或带通滤光片812在透明块806的相反侧联接至材料800。

图11类似地示出了在形成透明块1006的透明材料800的一侧上的凹矩形微镜1010与相反侧之间的距离和轴1014。图11还例示了在二向色或带通滤光片1012的中心点处垂直的轴1015。光轴1015延伸到由透明材料800形成的透明块1006的相反侧。光轴1014和1015彼此平行。

图11还示出了反射材料1011形成(例如，设置)在由透明材料800形成的实心透明块1006的弯曲透明矩形形状上，以形成矩形微镜1010。二向色或带通滤光片1012联接至实心透明块1006的相反侧。

流式细胞术应用中使用的荧光染料覆盖整个可见光和近红外波长范围。对于长波长荧光素来说，发射波长带宽通常较大。每个二向色或带通滤光片812可以使其检测器滤光片通带和中心波长被优化，以利用相同量的光谱采样来测量不同染料。而且，单独滤光片优化允许排除来自其它激光的激发波长。以这种方式，可以完全利用每个通道中的检测器来检测关注信号。结合由计算机的处理器执行的荧光光谱解混算法，单独和优化的通带检测提供了对大量的关注荧光染料的最终检测。

使用各种检测系统的方法

下面对在流式细胞仪中使用本文所公开的各种检测系统的方法进行描述。在使由激光激发的荧光素所产生的荧光发射出图中所示的光纤102的所述端部之前，不同波长的荧光由被激光激发的各种荧光素产生，这些荧光素标记流动通道中的样本中的不同微粒。所产生的荧光由靠近激光器相反端的集光透镜接收，如可以在图13看到的。使用转换器从捕获侧的第一数值孔径转换至小于第一数值孔径的第二数值孔径，以更好匹配光纤的数值孔径。然后，光纤将荧光引导朝向光纤的所述端部，以灵活地将其引导朝向紧凑检测模块600、700。

光纤102将荧光耦合到光纤的所述端部，从而将荧光从光纤中发射出。所发射的荧光具有由已被激光激发的不同荧光素产生的不同波长，所述不同的荧光素附着于样本流体中的不同微粒。

在输入通道中，从光纤的所述端部发射的光被透镜准直并聚焦朝向第一解复用成像阵列中的第一多个二向色滤光片中的第一个二向色滤光片。

进一步沿该输入通道，从光纤发射的用于激发不同荧光素的激光被阻挡装置阻挡，以免干扰检测荧光的波长。

进一步沿该输入通道，将来自光纤的一端部的图像尺寸放大至针对第一解复用成像阵列中的第一多个二向色滤光片中的处于一串行链或行中的第一个二向色滤光片的光斑尺寸。

在第一解复用成像阵列中，另选地，在所述第一多个二向色滤光片与一串行链或行第一多个微镜之间反射第一波长范围的荧光，以使荧光准直在奇数编号的二向色滤光片上，并且使荧光重新成像在偶数编号的二向色滤光片上。所述第一多个微镜的焦距和所述第一多个二向色滤光片与所述第一多个微镜之间间隔的距离提供沿着所述微镜链的望远镜效应，以使荧光准直在奇数编号的二向色滤光片上并且使该荧光重新成像在偶数编号的二向色滤光片上。

在该串行链或行第一多个二向色滤光片中，在各个二向色滤光片处对第一波长范围的荧光的不同波长范围进行带通，以解复用第一波长范围的荧光的波长谱。

与所述第一多个二向色滤光片的串行链或行相邻的是具有第一多个光检测器或光电检测器的多个检测器通道的串行链或行，如图3、图6以及图7A至图7C所示。每个检测器通道都具有透镜，以将不同波长范围的荧光聚焦到第一多个光检测器或光电检测器中。

多个光电检测器的该串行链或行检测与标记至微粒的各个荧光素相关联的第一波长范围中的每个不同波长范围中的荧光。所述多个光检测器将各自接收到的荧光转换成模拟电信号。然后，可以将每个模拟电信号通过模数(A/D)转换器从模拟电信号数字化/转换成数字电信号，然后进行分析和计数。

随着通过检测器将荧光转换成模拟电信号并数字化成数字电信号，然后可以使用具有处理器的计算机来对样本流体中的每种不同微粒的数量进行计数，如由David Vrane等人于2017年4月26日提交的题为COMPACT MULTI-COLOR FLOW CYTOMETER的申请No.15/498,397中所公开的，其通过引用并入于此。

第二和/或第三解复用成像阵列可以与第一解复用成像阵列并行使用。在这种情况下，该方法还包括将荧光分成用于第一解复用成像阵列的第一波长范围的荧光、用于第二解复用成像阵列的第二波长范围的荧光和/或用于第三解复用成像阵列的第三波长范围的荧光。如图13所示，第一光纤102A可以用于将荧光引导朝向第一解复用成像阵列。第二光纤102B可以用于将荧光引导朝向第二解复用成像阵列。第三光纤102B可以用于将荧光引导朝向第三解复用成像阵列。

这里描述的用于第一解复用成像阵列的步骤可以由第二和/或第三解复用成像阵列同时执行，因此可以分析不同的附加波长范围。为简短起见，重复的步骤不再被重复，但通过引用并入于此。

计算机系统概述

现在参照图14示出了流式细胞仪系统1400的基本概念图。流式细胞仪1400的各种实施方式可以是商业上可获的。流式细胞仪系统1400的五个主要子系统包括：激发光学系统1402、射流系统1404、发射光学系统1406、获取系统1408以及分析系统1410。通常，“系统”包括硬件装置、软件和/或它们的组合。

激发光学系统1402例如包括：激光装置1412、光学部件1414、光学部件1416以及光学部件1418。示例光学部件包括光学棱镜和光学透镜。激发光学系统1402照射光学询问区1420。射流系统1404承载流体样本1422通过光学询问区域1420。发射光学系统1406例如包括光学部件1430和光学检测器SSC、FL1、FL2、FL3、FL4以及FL5。发射光学系统1406收集从所经过的微粒发射或散射的光子。发射光学系统1406将这些光子聚焦到光学检测器SSC、FL1、FL2、FL3、FL4以及FL5上。光学检测器SSC是侧向散射通道。光学检测器FL1、FL2、FL3、FL4以及FL5是荧光检测器，其可以包括带通或长通长通滤光片，以检测特定荧光波长。各个光学检测器将光子转换为电脉冲，并将电脉冲发送至获取系统1408。获取系统1408处理并制备这些信号以在分析系统1410中进行分析。

本文所描述的图1至图13包括流式细胞仪1400的激发光学系统1402、发射光学系统1406以及获取系统1408的示例性部件。David Vrane于2017年11月19日提交的题为FLOWCYTOMETERY SYSTEM WITH STEPPER FLOW CONTROL VALVE的US专利申请No.15/817,277描述了射流系统1404的示例性部件，并且通过引用并入于此。

分析系统1410可以存储信号的数字表示，以便在由获取系统1408完成这些信号的获取之后进行分析。分析系统1410是计算机，该计算机包括显示装置、至少一个处理器、高速暂存存储器、以及可以半永久地存储更多数据(包括信号数据)和软件的一个或更多个存储装置。

分析系统的一个或多个存储装置可以存储分析软件，该分析软件具有可以由处理器执行以获得被分析的生物样本(或其它类型的样本，例如化学制品)的实验室结果的指令。分析系统1410和分析软件还可以被用于在使生物样本穿过流式细胞仪之前，在利用穿过流式细胞仪的对照微粒进行初始化时，利用补偿对照(control)来对流式细胞仪进行校准。分析软件具有由处理器执行的指令，该指令对所存储的由获取系统1408在利用穿过流式细胞仪的对照进行校准期间获取的信号数据进行分析。分析软件还具有由处理器执行的指令，该指令对所存储的在对在校准了流式细胞仪之后穿过该流式细胞仪的生物样本进行分析期间由获取系统1408获取的信号数据进行分析。

方法概述

现在参照图15以及图16A至图16C，描述利用快速补偿执行流式细胞术的方法1500的流程图。例如，图14的流式细胞术系统1400可以执行方法1500。流式细胞术允许对样本流体中的单个细胞或微粒进行快速多参数收集和数据的分析。

在图15所示的步骤1501中，流式细胞术系统启动流式细胞仪1604、1614并检查流式细胞仪的性能。流式细胞仪可以是常规流式细胞仪1604或者光谱流式细胞仪1614。常规流式细胞仪1604传统上使用反射镜、滤光片以及光电倍增管(PMT)来捕获或感测信号数据。光谱流式细胞仪1614基于类似原理，但是作为代替，通常使用多通道检测器(例如，电荷耦合器件(CCD))，该多通道检测器具有跨多个通道将光谱分散到检测器中的装置。

在步骤1505中，如图16A所示，该系统开始对流式细胞仪1604、1614进行校准。该系统使用一个或更多个单染色参考或补偿对照1602A-1602E(它们被统称为单染色参考或补偿对照1602)，这些对照一次一个穿过流式细胞仪1604、1614。所述一个或更多个单染色参考对照1602A-1602E根据标记到对照微粒的荧光素的相应各种自发光或冷光分别生成光谱曲线(spectral profile)或特征1606A-1606E。

在步骤1510中，在校准期间，该系统使用单染色补偿对照1602来生成常规流式细胞仪1604的初始溢出矩阵或者光谱流式细胞仪1614的初始参考矩阵。在执行多色流式细胞术时，该系统使用穿过流式细胞仪1604、1614的单染色样本1602来确定补偿水平，诸如图16A所示。微粒1602的单染色可以向流式细胞仪的荧光光检测器揭示荧光素的光谱曲线或特征1606A-1606E。这允许系统和/或用户补偿由于样本1610中包含的多染色细胞或微粒1612A-1612E而造成的来自该样本的荧光的光谱曲线的交叠(例如，参见图16B中的交叠1616)，如图16B所示。

补偿对照1602的染色必须与样本1610中的微粒1612A-1612E一样亮或更亮。抗体捕获珠粒可以代替细胞，并且如果所测量的荧光对于对照来说更亮，则一种荧光团结合抗体可以代替另一种。例外情况是组合染料，其不能被代替。来自不同供应商或不同批次的组合染料必须像单独染料一样进行处理，并且每种染料都应使用单独的单染色对照，因为这些染料中的每种染料的溢出量可能不同。同样，补偿算法应以阳性种群和阴性种群执行。无论各个单独补偿对照是否包含珠粒、实验中使用的细胞甚或不同细胞，该对照本身都必须包含具有相同水平的自荧光的微粒。补偿对照的整个集合可以包括珠粒或者细胞的单个样本，但是单独样本针对荧光团必须具有相同的载体微粒。而且，补偿对照使用与样本相同的荧光团。例如，绿色荧光蛋白(GFP)和异硫氰酸荧光素(FITC)都主要发射绿色光子，但是发射光谱却大不相同。因此，该系统无法将其中一个用于样本，而将另一个用于补偿对照。而且，该系统必须收集足够的事件以对溢出进行统计上显著的确定(例如，阳性种群和阴性种群都大约有5000个事件)。

在对常规流式细胞仪1604进行校准期间，该系统从一次一个穿过常规流式细胞仪的单染色参考对照1602获得初始溢出矩阵。在常规流式细胞仪1604中，使用一系列边缘滤光片和分光镜将荧光信号(例如，颜色)分离到离散的荧光带1606A-1606E。该系统利用光电倍增管(PMT)来检测(例如，测量)各个单独通道。理想地，荧光带应是完全离散的，但这是不现实的。在检测对照1602(以及样本1610)中的荧光信号期间，“溢出”可以发生在荧光带之间，诸如组合曲线1616所示。该系统利用溢出矩阵[S]定义荧光带之间的溢出(例如，图16B所示的组合曲线1616的离散带之间的溢出1618)。

另选地，在对光谱流式细胞仪1614进行校准期间，该系统从穿过光谱流式细胞仪的单染色参考对照1602获得初始参考矩阵。光谱流式细胞术是基于常规流式细胞术的技术，但是用光谱仪和多通道检测器(例如，电荷耦合器件(CCD))代替了常规流式细胞仪系统的传统反射镜、滤光片以及光电倍增管(PMT)。在光谱流式细胞仪中，侧向散射光和荧光直接或通过光纤被收集并耦合到光谱仪中，在光纤中，将整个光信号分散并且以高分辨率光谱显示在CCD或多通道检测器上。

在步骤1515中，参照图15和图16B，系统使样本1610穿过流式细胞仪1604、1614。该系统生成、获得和/或记录表示基于样本流体1610的光谱曲线1616的数据(例如，事件数据)。例如，检测流过流式细胞仪的样本流体中的荧光细胞。对荧光细胞的每次检测都是事件。可以根据测量出的样本事件矢量来定义事件数据。

在步骤1520中，该系统生成经补偿的样本事件矢量(用于常规流式细胞仪1604)或经解混的样本事件矢量(用于光谱流式细胞仪1614)，以对样本1610中的各种类型的细胞或微粒的数量进行计数，从而获得浓度的量度。通常，如图16C所示，对表示光谱曲线1616的事件数据使用逆矩阵1624(根据初始溢出矩阵和/或具有精细调节的初始参考矩阵确定的)，以生成表示被标记到样本1610中的各种细胞1612A-1612E的荧光素的各种自发光或冷光的单独光谱曲线或特征1606A-1606E的经补偿的样本事件矢量或经解混的样本事件矢量。

对于常规流式细胞仪1604，该系统根据初始溢出矩阵和测量出的样本事件矢量计算经补偿的事件矢量。对于光谱流式细胞仪1614，该系统根据初始参考矩阵和测量出的样本事件矢量计算经解混的样本事件矢量。

遗憾的是，初始溢出矩阵和参考矩阵往往不足以准确产生可靠的结果。因此，在步骤1525中，该系统执行快速补偿。对于常规流式细胞仪1604，该步骤包括补偿初始溢出矩阵的不准确性。对于光谱流式细胞仪1614，该步骤包括补偿初始参考矩阵的不准确性。

在步骤1527中，基于快速补偿，该系统以先前执行的更快方式生成经再补偿的样本事件矢量。然后，方法1500在步骤1530结束，但是对于其它样本，可以利用流式细胞仪针对相似的日期/时间校准/采样重复一个或更多个步骤。

从常规流式细胞仪的单染色对照获得溢出矩阵

因此，该系统可以包括常规流式细胞仪，以从单染色对照中生成或获得溢出矩阵。进一步讨论了通过使用常规流式细胞仪生成或获得溢出矩阵的步骤。

假设矩阵[S]是从单染色补偿对照获得的N×N维溢出矩阵，其中，N是荧光检测器的数量。示例补偿对照包括利用荧光素染色或着色的珠粒1602，诸如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、R-藻红蛋白(R-phycoerythrin，PE)、多甲藻黄素叶绿素蛋白复合物(Peridinin Chlorophyll Protein Complex，PerCP)、藻红蛋白和花青染料(phycoerythrin and cyanine dye，PE-Cy7)、别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，APC)、以及结合APC和花青染料的组合荧光素(APC-Cy7)。

假设矢量{U}是具有N个值的测量出的样本事件矢量，每个值皆来自检测补偿对照(例如、FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)的N个检测器中的一个。

假设矢量{V}是具有N个值的经补偿的样本事件矢量。测量出的样本事件矢量{U}等于溢出矩阵[S]乘以经补偿的样本事件矢量{V}。这可以利用与测量出的样本事件矢量{U}的以下矩阵关系来进行表示：

[S]{V}＝{U} 方程1

因此，利用逆溢出矩阵[S]^-1，可以从矩阵方程获得经补偿的样本事件矢量{V}：

{V}＝[S]^-1{U} 方程2

初始溢出矩阵[S]可以通过在各个检测器处测量各个单染色对照(例如，FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)来获得，以获得以下矩阵：

在方程3中的下标x、y中，x值表示检测器编号。在方程3中的下标x、y的中y值表示与单染色对照相关的列。

初始溢出矩阵[S]中的每一列(分离变量(SOV)矩阵)皆对应于一个单染色对照(例如，FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)。例如，第一列对应于FITC单染色对照。作为另一示例，第二列对应于PE单染色对照；对于穿行以校准流式细胞仪的每个染色对照，以此类推。初始溢出矩阵[S]中的每一行皆对应于给定检测器编号。例如，第一行对应于检测器1。第二行对应于检测器2，以此类推。

通常，所生成的初始溢出矩阵不够准确，以致无法准确分离光谱并识别细胞或微粒。因此，需要对初始溢出矩阵[S]的非对角元素值进行精细调节(例如，对初始溢出矩阵[S]进行精细调节，生成经调节的溢出矩阵[S]'及其关联的逆矩阵，经调节的补偿矩阵[C]’)。可以根据实验室技术人员/操作员的经验和判断进行精细调节。通常进行精细调节，以校正由在同一细胞或微粒上染色的荧光素的相互作用或由用于测量单染色和未染色对照的系统所造成的失真，或者由该相互作用和系统所造成的两种失真。

假设调节矩阵[D]是要对初始溢出矩阵[S]的非对角元素值进行的精细调节(例如，相加)。可以根据矩阵方程{V_R}＝[[S]+[D]]^-1{U}确定常规流式细胞仪的经再补偿的事件矢量{V_R}。

获得光谱流式细胞仪的经解混的事件列表数据

另选地，该系统可以包括光谱流式细胞仪1614以生成或获得经解混的事件列表数据。进一步讨论了通过使用光谱流式细胞仪生成或获得经解混的事件列表数据的步骤。

假设[R]是从单染色参考对照获得的光谱流式细胞仪的N×M初始参考矩阵，其中，N是检测器的数量，M是待测量的荧光素(例如，FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)的数量，其中，M始终小于N。

假设{U}是具有N个值的测量出的样本事件矢量，其中每个值皆来自N个检测器之一。

假设{V}是具有M个值(例如，荧光强度)的经解混的样本事件矢量，其中每个值皆是荧光素(例如，FITC、PE、PerCP、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)的经解混的值。

经解混的样本事件矢量{V}与经测量的样本事件矢量{U}具有以下矩阵关系：

[R]{V}＝{U}

由于经解混的样本事件矢量{V}中的变量M的数量小于测量出的样本事件矢量{U}中的变量N的数量(例如，经解混的样本事件矢量的维度小于测量出的样本均匀矢量的维度)，因此系统然后使用最小二乘算法来获得上述方程的解。

与常规流式细胞仪相比，经解混的事件矢量等效于经补偿的事件矢量。因此，经解混的事件列表数据的光谱溢出矩阵(例如，经解混的样本事件矢量)是如下单位矩阵[I]：

通常，经解混的事件列表数据不够精确，使得需要对单位光谱溢出进行精细调节(例如，进行精细调节以生成经调节的光谱溢出矩阵)。因此，光谱流式细胞仪的经再补偿的事件矢量的方程变为：{V_R}＝[[I]+[D]]^-1{V}，其中，[D]是在第i行和第j列分别具有精细调节δ_i,j的n×n增量矩阵，并且在不需要精细调节的情况下为零。例如，增量矩阵可以为

流式细胞术数据的快速补偿

因此，在流式细胞术(例如，常规和光谱)中，从细胞仪收集的流式细胞术标准(FCS)数据是线性原始列表数据。列表数据在被用于图表绘制和被用于样本中的细胞的统计分析之前需要进行补偿。该系统执行快速补偿以解决常规流式细胞仪的溢出矩阵和/或光谱流式细胞仪的经解混的事件列表数据中的准确度不足的问题。

列表数据的补偿基于系统从测量出的单染色补偿对照和/或精细调节输入获得的初始溢出矩阵。所获得的初始溢出矩阵通常不够准确。通过精细调节初始溢出矩阵中的值，可以进行精细调节，从而生成经调节的溢出矩阵。

每当精细调节溢出值时，溢出矩阵都需要倒置以获得补偿矩阵。然后，将补偿矩阵与每个列表数据事件矢量相乘以生成经补偿的列表数据(例如，经再补偿的事件矢量)。

例如，采取N个荧光参数的实验。为了补偿每个事件矢量，它需要N²次相乘加上N×(N-1)次相加来生成经补偿的事件矢量。计算复杂度约为N²(例如，O(N²))。

对于有限数量的荧光素参数且有限数量的事件的实验，补偿计算可能不是流式细胞仪数据分析的瓶颈。然而，如果实验包含大量荧光参数(例如，超过20个荧光参数)，并且具有大量事件(例如，200万个事件)，那么补偿计算可能极其耗时。结果是每当系统改变溢出值时，由于要处理大量计算，因此显示的图表和统计数据在计算机界面上的响应可能极其慢。

有利地，本系统执行快速补偿算法，该快速补偿算法在系统接收或执行用于流式细胞术数据分析的溢出矩阵的精细调节时，在不牺牲经补偿的列表数据的任何准确性的情况下，显著减少了计算量。例如，这种快速补偿算法仅需要(3N+1)次相乘/相除加上(N+1)次相加。这种快速补偿算法的复杂度约为N(例如，O(n))。因此，本系统可以显著改善所显示的图表和统计数据的响应度。

例如，考虑具有一百万个事件的20色实验。每当系统接收或执行溢出值的精细调节时，典型补偿算法都需要总共4亿次相乘加上3.99亿次相加。与此相反，本系统的快速补偿算法仅需要总共6000万次相乘加上2000万次相加。与典型的补偿算法相比，总的相乘和相加的节省分别为566％和1895％。

现在讨论当前快速补偿算法的推导。

假设矩阵[C]是补偿矩阵。根据矩阵方程[C]＝[S]^-1，补偿矩阵[C]是溢出矩阵[S]的逆。如果将补偿矩阵[C]与溢出矩阵[S]的逆相乘，则获取诸如矩阵方程[C][S]＝[I]中的单位矩阵。经补偿的事件矢量{V}可以通过将补偿矩阵[C]和未补偿的测量出的事件矢量{U}相乘(用矩阵方程{V}＝[C]{U}表示)来进行计算。

由于精细调节，因此该系统生成或计算经调节的溢出矩阵[S]'。假设初始溢出矩阵[S]中的一个元素的值发生了变化，例如，S_i,j’＝>S_i,j+δ_i,j，经精细调节的溢出矩阵[S]'可以根据矩阵方程[S]’＝[S]+[D]，由初始溢出矩阵[S]与增量矩阵[D]中的精细调节相加之和来表示，其中

是增量矩阵，其中，下标i和j分别表示第i行和第j列。经再补偿的事件矢量{V_R}可以通过将经精细调节的溢出矩阵[S]'的逆(经精细调节的补偿矩阵[C]’)与未补偿的测量出的事件矢量[U]一起相乘来进行计算，诸如矩阵方程{V_R}＝[[S]+[D]]^-1{U}所表示。增量矩阵[D]具有与初始溢出矩阵[S]相同的维度。增量矩阵[D]包括用于精细调节初始溢出矩阵[S]的增量值δ_i,j。

由于[S]+[D]＝[S]([I]+[C][D])，[[S]+[D]]^-1＝([I]+[C][D])^-1[C]，经再补偿的事件矢量{V_R}的方程可以重写为

{V_R}＝([I]+[C][D])^-1[C]{U}＝([I]+[C][D])^-1{V}

其中，([I]+[C][D])^-1是再补偿矩阵。

由于再补偿矩阵可以简化为

然后，可以将经再补偿的事件矢量的矩阵方程写为

通过与未补偿的测量出的事件矢量{U}的分量进行相加/相减以及相乘/相除来确定经重新补偿的矢量的每个分量，从而显著减少了计算的数量。因此，可以通过计算机的处理器使用所述快速补偿算法来更加快地计算出经再补偿的事件矢量{V_R}。

因此，使用所述快速补偿算法，可以利用流式细胞仪更快地分析细胞样本并且更有效地获得结果(例如，细胞计数、浓度、滴定)。代替研究人员或实验室技术员花费一天或更多天等待完成计算以获得生物样本(例如，血液或尿液)的实验室结果，可以通过使用所述快速补偿算法在数小时内获得生物样本的实验室结果。

结论

因此描述了这些实施方式。虽然已经具体描述了实施方式，但是它们不应该被解释为受这种实施方式的限制，而是根据下面的权利要求书来解释。

虽然已经对特定的示例性实施方式进行了描述并且在附图中进行了示出，但要明白的是，因为本领域普通技术人员可以想到各种其它修改例，所以这种实施方式仅仅是例示性的，而不限制本发明，并且这些实施方式不限于所示和描述的具体构造和布置。

流式细胞仪的某些功能可以用软件实现并由计算机或处理器执行，诸如分析由检测器检测到的电信号以对样本流体中的不同微粒进行计数。使用该软件的程序或代码段来执行为了执行这些功能所必需的任务。该程序或代码段可以存储在处理器可读介质中，或者通过传输介质或通信链路上的载波中所具体实施的计算机数据信号被发送。处理器可读介质可以包括可以存储信息的任何存储介质。处理器可读介质的示例包括：电子电路、半导体存储器装置、只读存储器(ROM)、闪速存储器、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、软盘、CD-ROM、光盘以及硬盘。代码段可以经由诸如因特网、内联网等的计算机网络下载至存储介质。

虽然本说明书包括许多具体细节，但这些不应被解释为对本公开的范围或可以要求保护的范围的限制，而相反应被解释为对本公开的特定实现所特有的特征的描述。本说明书中在分离实现的背景下描述的某些特征还可以在单一实现中组合实现。相反地，在单一实现的背景下描述的各种特征还可以在多个实现、单独地或者在子组合中实现。此外，尽管上面将特征描述为在某些组合中起作用，甚至最初同样要求保护，但来自要求保护的组合的一个或更多个特征在某些情况下可以从该组合去除，并且该要求保护的组合可以被指向子组合或子组合的变型例。因此，要求保护的发明仅通过所附的权利要求书来限制。

Claims (20)

1.一种利用常规流式细胞仪执行流式细胞术的方法，所述方法包括以下步骤：

通过使用多个单染色补偿对照来生成初始溢出矩阵；

使样本穿过所述流式细胞仪；

通过对穿过所述流式细胞仪的多个细胞的荧光进行测量来生成测量出的样本事件矢量；

通过使用所述初始溢出矩阵和所述测量出的样本事件矢量来生成经补偿的样本事件矢量；以及

通过对所述初始溢出矩阵进行精细调节来生成经调节的溢出矩阵。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

通过使用所述经调节的溢出矩阵和所述测量出的样本事件矢量来计算经再补偿的事件矢量。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述经补偿的样本事件矢量等于所述测量出的样本事件矢量线性地乘以所述初始溢出矩阵的逆。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，生成经调节的溢出矩阵的步骤包括：

将增量矩阵与所述初始溢出矩阵相加。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述增量矩阵包括用于对所述初始溢出矩阵进行精细调节的一个或更多个增量值，并且其中，所述增量矩阵具有与所述初始溢出矩阵相同的维度。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初始溢出矩阵包括N×N个维度，并且其中，N是所述单染色补偿对照的数量。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单染色补偿对照中的各个单染色补偿对照包括以下中的一者：异硫氰酸荧光素(FITC)；R-藻红蛋白(PE)；多甲藻黄素叶绿素蛋白复合物(PerCP)；PE-Cy7；别藻蓝蛋白(APC)；或APC-Cy7。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述测量出的样本事件矢量包括N个值，并且其中，所述经补偿的样本事件矢量具有N个值。

9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述经再补偿的事件矢量等于所述初始溢出矩阵与增量矩阵之和的逆乘以所述测量出的样本事件矢量。

10.一种利用光谱流式细胞仪执行流式细胞术的方法，所述方法包括以下步骤：

通过使用多个单染色补偿对照来生成参考矩阵；

使样本穿过所述流式细胞仪；

通过对穿过所述流式细胞仪的多个细胞的荧光进行测量来生成测量出的样本事件矢量；

通过使用所述参考矩阵和所述测量出的样本事件矢量来生成经解混的样本事件矢量；以及

通过对光谱溢出矩阵进行精细调节来生成经调节的光谱溢出矩阵。

11.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

通过使用所述经调节的光谱溢出矩阵和所述测量出的样本事件矢量来计算经再补偿的事件矢量。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述经解混的样本事件矢量等于所述测量出的样本事件矢量线性地乘以所述参考矩阵。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述经解混的样本事件矢量中的变量的数量少于所述测量出的样本事件矢量中的变量的数量。

14.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

对所述经解混的样本事件矢量进行求解的步骤包括：对所述测量出的样本事件矢量和所述参考矩阵使用最小二乘算法。

15.根据权利要求10所述的方法，其中，用于所述经解混的样本事件矢量的初始光谱溢出矩阵是单位矩阵。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，生成经调节的光谱溢出矩阵的步骤包括：

将增量矩阵与所述初始光谱溢出矩阵相加。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述增量矩阵包括用于对所述初始光谱溢出矩阵进行精细调节的一个或更多个增量值，并且其中，所述增量矩阵具有与所述初始光谱溢出矩阵相同的维度。

18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述初始光谱溢出矩阵包括N×N个维度，并且其中，N是所述单染色补偿对照的数量。

19.根据权利要求10所述的方法，其中，所述测量出的样本事件矢量包括N个值，并且其中，所述经解混的样本事件矢量具有N个值。

20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述经再补偿的样本事件矢量等于所述初始光谱溢出矩阵与所述增量矩阵之和的逆乘以所述测量出的样本事件矢量。

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