CN112143790A - 基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用 - Google Patents

基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方法及其应用。本发明的方法包括：测量受试者组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；将所述测量值与对照值比较的步骤；判断m6A甲基化的差异化修饰与患唐氏综合征的风险的高低的关系。本发明可有效地用于唐氏综合征的筛查。

Description

基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估唐氏综合征风险的方 法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征风险的方法及其应用。
背景技术
唐氏综合征(Down Syndrome,DS)又称为21-三体综合征(OMIM#190685)，是由于21号染色体整体或部分发生额外的复制而引起的染色体非整倍体疾病，也是导致先天性智力障碍最常见的遗传性疾病之一。唐氏综合征患者有不同程度的认知障碍表型，表现为轻度、中度，甚至重度的智力障碍。尽管经过多年的研究，但其确切机制尚不完全清楚。
在全世界范围内，DS的发病率约为活产婴儿的1/1000～1/500。在我国，新生儿中的发病率约为1/800～1/600。中国出生缺陷防治报告(2012年)显示，我国每年新出生的唐氏综合征患者生命周期的总经济负担超过100亿元，危害严重。目前唐氏综合征的致病机制尚不十分清楚，有三种假说：基因剂量失衡假说(Dosage imbalance hypothesis)、放大的发育不稳定假说(Amplified developmental instability hypothesis)和关键区域假说。唐氏综合征不同组织中DNA甲基化程度升高，提示表观遗传因素在DS中也发挥重要的作用。唐氏综合征患者的智力障碍表型与额叶和海马的功能缺陷密切相关。唐氏综合征患者大脑皮层的神经解剖异常，大脑皮层神经元的移位引起的进行性神经元细胞的死亡，皮质神经元在突触接触区的长度异常以及突触密度的异常等与DS患者智力障碍的大脑功能异常密切相关。大脑中RNA的m6A修饰水平高，且在大脑发育和神经系统的功能中发挥重要作用，然而其在唐氏综合征大脑中的作用仍不清楚。
N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是腺嘌呤(A)的N6位置添加甲基的修饰，是高等生物各种RNA中最为普遍的修饰，具有动态性和可逆性。mRNA的m6A修饰广泛分布于基因转录区，影响转录、剪接、转运、储存和降解，参与调控各种生物过程。研究发现，胚胎脑组织中有高水平的m6A修饰，并随着大脑的发育过程持续升高。
m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，主要由“编码器(writer)”、“消码器(Eraser)”和“读码器(Reader)”组成。编码器即甲基转移酶，目前这个复合体成分主要有METTL3，METTL14，WTAP和KIAA1429等，其中METTL3和METTL14以二聚体的形式存在，两者协同作用对腺嘌呤位点进行甲基化修饰；而FTO和ALKBH5作为消码器，即去甲基转移酶，可以逆转甲基化，实现m6A修饰的动态平衡。通过RNA甲基化免疫共沉淀高通量测序技术(Methylated RNA Immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)检测和分析可以得到m6A修饰在全转录组范围内的分布特征。
大脑皮层是由神经干细胞(neural stem cell)和神经前体/祖细胞(neuralprogenitor cells)分化成的有序形成特定层次的多种类型神经元组成。胚胎小鼠皮质中相当于神经干细胞的放射状神经胶质细胞(radial glia cells，RGCs)，能够产生中间祖细胞(intermediate progenitor cells,IPCs)，进一步分化为皮质神经祖细胞(corticalneural progenitor cells,NPCs)，随后按顺序产生位于不同皮质层的神经元。最近的研究发现，m6A修饰引起神经干细胞、细胞周期、神经元分化相关mRNA的快速更新，以控制皮层神经动态发生过程中不同阶段转录组的组成。这种神经元谱系基因在神经干细胞中已经表达，但其表达在转录后被m6A修饰而抑制的提前转录分布模式(transcriptional pre-patterning)，对于维持正常的皮质神经发生至关重要。缺少m6A修饰会减弱这些mRNA的降解，影响NPC的分化和细胞周期的进程。
核受体相互作用蛋白NRIP1(Nuclear Receptor Interacting protein 1)，又称为RIP140(receptor-interacting protein 140)，是一种转录共抑制子，调节参与代谢的多种基因，包括核编码线粒体基因。Nrip1在正常小鼠脑发育过程中持续表达，主要表达在大脑皮质、海马等部位。Nrip1基因敲除小鼠表现出学习和长期记忆缺陷，提示其在认知功能中发挥作用。在DS胚胎来源的成纤维细胞中，NRIP1表达升高，线粒体功能主要调节基因PGC-1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma,coactivator 1alpha)表达降低，耗氧量和ATP含量下降，线粒体Ca2+负荷和ROS增加，导致线粒体功能障碍，而抑制NRIP1后，PGC-1α的表达和线粒体功能得到恢复。在DS中敲低NRIP1的表达，有助于该病的治疗。唐氏综合征胚胎大脑皮层中NRIP1的表达异常升高，然而其升高的程度无法用基因剂量效应解释，其在DS中表达升高的机制仍不十分清楚。
发明内容
为探索DS中NRIP1基因表达异常升高的原因以及敲低NRIP1对唐氏综合征的治疗作用，本发明通过系统比较DS与正常胚胎大脑皮层组织中RNA的m6A修饰，鉴定出DS大脑皮层组织中m6A差异修饰对NRIP1的调控后，进一步验证了m6A修饰对NRIP1的调控，并探索了其调控机制，至少基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征的方法，所述方法包括：
a.测量从所述采集的受试者组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患有唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。
在某些具体实施方案中，所述对照值为从与所述受试者的年龄相当的正常对象的组织样品获得的值。
在某些具体实施方案中，所述方法进一步包括使用体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或siRNA。
在某些具体实施方案中，所述组织样品为大脑皮层组织。
在某些具体实施方案中，所述m6A甲基化修饰的测量方法包括：提取所述组织RNA，片段化后，使用次氯酸钠和乙醇提取RNA，取1％的片段化RNA作为input对照，剩余片段化RNA与结合有磁珠的m6A抗体孵育，孵育后清洗磁珠，并将其溶于溶解缓冲液中，用次氯酸钠和乙醇提取上清RNA，构建文库，进行高通量测序，根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6A富集峰相关的转录本。
本发明的第二方面，提供一种用于对鉴定唐氏综合征有用的化合物的方法，所述方法包括：
a.测量样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平获得第一测量值的步骤；
b.测量施用试验化合物后样品中的所述NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平获得第二测量值的步骤；
c.比较第一测量值第二测量值的步骤，和
d.(i)如果第二测量值高于第一测量值，即所述试验化合物提高NRIP1 mRNA的m6A甲基化的修饰水平，则将所述试验化合物鉴定为对唐氏综合征有用；(ii)如果第二测量值等于或低于第一测量值，即所述试验化合物对NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平没有影响或具有降低作用，则将所述化合物鉴定为唐氏综合征不是有用的。
在某些具体实施方案中，所述用于鉴定对唐氏综合征有用的化合物的方法中，所述样品来源于试验动物的大脑皮层。
在某些具体实施方案中，所述用于鉴定对唐氏综合征有用的化合物的方法中，所述样品为体外培养的大脑皮层细胞。
本发明的第三方面，提供用于检测NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰的试剂在制备诊断唐氏综合征试剂盒中的用途。
在某些具体实施方案中，所述试剂包括针对NRIP1 mRNA的引物或探针。
本发明通过探索m6A甲基化修饰在DS大脑皮层的特征，并揭示了一种通过m6A甲基化修饰来减少mRNA衰减，引起NRIP1的过表达的新机制。揭示了DS潜在的分子机制以及与唐氏综合征治疗相关的新理论。
附图说明
图1为DS组织样本中m6A甲基化修饰及m6A差异修饰(其中图1中的A为检测流程图，B、C和D为m6A的分布区域可视化展示图；E、F为m6A富集峰相关的转录本的统计图；G为差异m6A修饰相关的转录本的GO分析结果)。
图2为DS大脑中差异表达基因及关联分析中重叠差异表达基因结果(其中图中A表示DS胎儿皮层中鉴定的差异表达基因统计图；B为差异表达的mRNA的GO分析结果；C为MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析统计结果；D为重叠的差异表达基因的GO分析结果)。
图3为DS中NRIP1 RNA和蛋白的表达结果(其中图中A和B分别表示qPCR和Westernblot检测结果)。
图4为过表达或敲低METTL3后，m6A修饰的NRIP1 RNA的水平，以及过表达或敲低METTL3后NRIP1蛋白的表达结果(其中图4中的A显示过表达METTL3后，NRIP1的m6A修饰水平升高；B显示敲低Mettl3后，Nrip1的m6A修饰水平降低；C显示Mettl3的siRNA在RNA水平显著敲低Mettl3的表达；D显示Mettl3的siRNA敲低Mettl3蛋白表达的同时，Nrip1蛋白的表达水平升高；E显示过表达METTL3后，NRIP1的蛋白表达水平降低)。
图5为过表达或敲低METTL3后，NRIP1 mRNA衰减实验结果(其中图A显示RNA水平上METTL3 siRNA对MRTTL3的抑制；B显示蛋白水平上METTL3 siRNA对MRTTL3的抑制；C显示METTL3 siRNA对MRTTL3敲低后，NRIP1的半衰期延长；D显示转染pCMV3-METTL3后，MRTTL3的蛋白表达水平升高；E显示过表达METTL3后，NRIP1的半衰期缩短)。
图6为验证METTL3调控NRIP1表达的荧光素酶实验，以及可以敲低NRIP1表达的siRNA(其中图中的A显示NRIP15’UTR插入psiCHECK2载体的示意图；B显示荧光素酶实验中，METTL3通过m6A对NRIP1对调控；C和D分别显示RNA和蛋白水平上，NRIP1 siRNA对NRIP1对抑制)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明提供一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰筛查唐氏综合征的方法，所述方法包括：
a.测量从所述受试者采集的组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。
本发明提供一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰筛查唐氏综合征的方法。其中，m6A甲基化修饰，本发明有时也称为“N6-甲基腺嘌呤”，是指腺嘌呤(A)的N6位置添加甲基的修饰。唐氏综合征，本文有时也称为21-三体综合征(DS)，是由于21号染色体整体或部分发生额外的复制而引起的染色体非整倍体疾病。核受体相互作用蛋白1(NRIP1)，本发明有时也称为受体相互作用蛋白140(RIP140)，是人的位于21号染色体上的NRIP1基因编码的蛋白。本发明中，唐氏综合征的NRIP1是作为m6A甲基化修饰的靶标，m6A甲基化修饰水平差异参与调控其表达水平的上调或下调。具体地。
本发明的步骤a为测量从所述受试者采集的组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤。
本发明中，首先确定m6A修饰在DS患者大脑发育中的作用，通过对DS胎儿和对照胎儿的大脑皮层组织提取RNA进行MeRIP-seq，对全转录组范围m6A甲基化修饰水平进行测定，并根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6A富集峰相关的转录本。
进行RNA提取的方式不作特别限定，可使用市售试剂盒，例如Invitrogen公司生产的PureLinkRNAMini Kit试剂盒进行提取。提取后的RNA在适于片段化的条件下进行片段化。优选地，首先使用片段化缓冲液在90℃-95℃条件下处理4-6分钟。进一步优选为在94℃条件下处理5分钟。再使用0.1-0.8M的EDTA进行片段化，优选为使用0.5M的EDTA进行片段化。
优选地，片段化后用3M次氯酸钠(pH 5.2)和100％乙醇提取RNA，并对片段大小进行鉴定。
本发明通过对DS组织样品和对照组织样品进行RNA-seq及生物信息学数据分析，鉴定在RNA水平和m6A水平上均发生显著变化的富集峰的分布。通过RNA-Seq在转录水平对样本组织整体转录活动进行检测，筛选出所述受试者组织和对照组中的差异表达。优选地，提取组织总RNA后，片段化后的mRNA片段大小为280-320bp。
本发明进一步包括通过MeRIP-qPCR和qPCR以分别验证MeRIP-seq和RNA-seq结果的步骤，其中包括mRNA的纯化和m6A富集。mRNA的纯化和m6A富集可使用市售试剂盒，例如使用Thermo公司生产的Dynabeads mRNA纯化试剂盒进行纯化以及使用NEB EpiMark m6A富集试剂盒进行m6A的富集。
为了进一步分析m6A对mRNA稳定性的影响，分别在体外构建的细胞系中，将所述细胞系的细胞接种后培养过夜，然后进行转染，过表达或敲低METTL3后，加入放线菌素D，并收集不同时间点的细胞，提取RNA并逆转录，qPCR检测目的基因NRIP1的表达，计算NRIP1的半衰期，进行mRNA衰减的测定。
本发明通过荧光素酶实验确定METTL3介导的NRIP1表达依赖于NRI P1 mRNA上的m6A修饰。优选地，其包括通过体外构建的细胞系进行验证的步骤，所述细胞系包含过表达质粒或siRNA。更优选地，所述细胞系为H EK293T细胞和HT22细胞系。进一步优选地，所述质粒包括野生型的NRI P1的5'UTR和突变型的NRIP1的5'UTR，其中在m6A模体中用T代替A。在具体实施方案中，所述质粒包括psiCHECK2-NRIP1-5'UTR-WT和psiCHE CK2-NRIP1-5'UTR-Mut。
优选地，所述siRNA为敲低m6A甲基化修饰相关基因得到的用于转染所述细胞系的siRNA。优选地，m6A甲基化修饰相关基因为METTL3。
进行m6A甲基化修饰依赖的方式调节NRIP1的表达的验证包括以下步骤：将细胞系的细胞接种后培养过夜，然后进行转染；将METTL3的过表达质粒或siRNA加入Opti-MEM无血清培养基中，吸打混匀形成第一混合液；将构建好的质粒加入Opti-MEM无血清培养基中，吸打混匀形成第二混合液；将第一混合液和第二混合液混匀，并加入Lipofectamin 2000，室温孵育后置于培养箱中培养，48h后裂解细胞，使用双荧光素酶检测试剂盒进行检测。
本发明中，当样品为用于获得基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰诊断唐氏综合征中的测量值时，此时的样品为组织样品，优选为离体组织样品。更优选地，离体组织样品为大脑皮层组织样品。当样品为用于获得鉴定对唐氏综合征有用的化合物的测量值时，此时的样品来源于体外培养的大脑皮层细胞。
实施例
本实施例为探究METTL3介导的m6A甲基化修饰在唐氏综合征患者大脑皮层中的变化以及对唐氏综合征大脑中表达异常的NRIP1的影响。
一、实验方法
1.MeRIP-seq：通过m6A特异性抗体对大脑皮层组织中具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，随后进行高通量测序，结合生物信息学分析，在转录组范围内对m6A修饰进行系统分析，具体方法如下：
利用PureLinkRNA Mini Kit(Invitrogen)提取组织RNA，并检测RNA的浓度、纯度和完整性。加入片段化缓冲液，94℃处理5min，加入0.5M E DTA，对RNA进行片段化。用3M的次氯酸钠(pH 5.2)和100％乙醇提取R NA，并对片段大小进行鉴定。取1％的片段化RNA作为input对照。剩余片段化RNA与结合Protein G磁珠的m6A抗体4℃孵育2h进行免疫共沉淀。清洗磁珠后，溶于100ul溶解缓冲液中，置于4℃摇晃1h，置于磁力架，吸取上清。用3M次氯酸钠(pH 5.2)和100％乙醇提取上清RNA，构建文库，进行Illumina Hiseq测序。
2.RNA-Seq：在转录水平对大脑皮层组织整体转录活动进行检测，筛选出两组组织中的差异表达，具体方法如下：
提取组织总RNA，并进行浓度、纯度和完整性的检测。通过Oligo(dT)磁珠富集带ployA尾的mRNA。加入片段化缓冲液，将mRNA随机断裂成300bp左右的小片段，在逆转录酶的作用下，加入六碱基随机引物(random hexamers)，以mRNA为模板反转录合成cDNA第一条链，随后合成第二条链，形成稳定的双链结构。加入End Repair Mix将粘性末端的双链cDNA补成平末端，随后在3’末端加上一“A”碱基，用于连接Y字形的接头。PCR扩增，对文库进行富集后，进行Illumina Hiseq测序。
3.MeRIP-qPCR：提取DS和对照胚胎大脑皮层组织的总RNA，利用Dy nabeads mRNA纯化试剂盒(Thermo)纯化mRNA。之后依据NEB EpiMark m6A富集试剂盒说明进行操作，主要步骤为：将Protein G磁珠和m6A抗体于4℃孵育2h后，加入1ug的mRNA于4℃继续孵育2h。用清洗缓冲液洗3次，溶于RLT缓冲液(Qiagen)中，加入清洗后的Dynabeads Myone S ilane磁珠(Life technologies)，70％的乙醇清洗2次后，将RNA溶解在DEP C水中。Nanodrop2000对所得RNA的浓度和纯度进行检测，反转录后进行qPCR检测。
4.mRNA半衰期的测定
生长状态良好的细胞接种于24孔板，培养箱中培养过夜，24h后进行转染，转染24h后每孔加入1ul的放线菌素D(5ug/ml)，并收集不同时间点的细胞，提取RNA并逆转录，qPCR检测目的基因NRIP1的表达，计算NRIP1的半衰期。
5.双荧光素酶活性实验
将生长状态良好的细胞接种于12孔板，培养箱中过夜，24h后进行转染，将METTL3的过表达质粒或siRNA加入75ul的Opti-MEM无血清培养基中，吹打混匀；将构建好的质粒psiCHECK2-NRIP1-5'UTR-WT或psiCHECK2-NRIP1-5'UTR-Mut加入75ul的Opti-MEM无血清培养基中，吹打混匀。混合以上两种液体，并加入1ul的Lipofectamin 2000，室温孵育5min，向每孔中加入混合液150ul，置于培养箱中培养。48h后裂解细胞，使用双荧光素酶检测试剂盒进行检测，化学发光仪测出各孔的肾素荧光和作为内对照的萤火虫荧光后，对各组数据进行归一化分析。
二、实验结果
通过MeRIP-seq检测，检测流程见图1A。如图1中的F所示，在DS大脑皮层中共鉴定出转录组范围的18378个m6A富集峰相关的转录本，且m6A的分布主要位于富含终止密码子和3'UTR的区域(图1中的B、C、D所示)。
将DS胎儿的m6A富集峰与二倍体对照胎儿脑组织进行比较。与对照组相比，在DS胎儿中共鉴定出3123个上调的m6A富集峰和3025个下调的m6A富集峰(图1中的E、F所示)。基因本体论(GO)分析结果见图1中的G所示，结果表明差异m6A修饰相关的转录本的功能富集在神经系统发育和神经细胞增殖等方面。
通过RNA-seq检测，和对照组相比，在DS胎儿皮层中鉴定出2310个差异表达的基因，包括1321个表达上调的基因和989个表达下调的基因(如图2中的A所示)。GO分析表明，差异表达的mRNA与神经系统发育、大脑发育以及染色体分离有关(如图2中的B所示)。对MeRIP-seq和RNA-seq数据进行联合分析，发现了113个重叠的差异表达基因(如图2中的C所示)。这些基因的GO分析主要分布在神经元分化的负调控和成神经细胞增殖的正调控等方面(如图2中的D所示)。
核受体相互作用蛋白1(NRIP1)，也称为受体相互作用蛋白140(RIP140)，是人的位于21号染色体上的NRIP1基因编码的蛋白。NRIP1是一种关键调控因子，可调节多种转录因子，包括雌激素受体的转录活性。NRIP1的过度表达与唐氏综合征、癌症、炎症、阿尔兹海默症等有关。如图3的A和B所示，通过qPCR和Western blot检测发现，与对照组相比，DS中NRIP1的表达上调。
如图4中的A和B所示，在HEK293T中过表达METTL3，m6A修饰的NRIP1升高；而在HT22细胞系中敲低Mettl3,m6A修饰的Nrip1降低。提示：NRIP1作为METTL3修饰的靶标。如图4中的D和E所示，在METTL3敲低的细胞系中，METTL3的缺失增加了NRIP1蛋白的丰度。此外，METTL3的过表达下调了NRIP1蛋白的丰度。
为了探索m6A对NRIP1表达的潜在调控机制，在HEK293T和HT22细胞系中，分别过表达和敲低METTL3后，测定NRIP1 mRNA的衰减速率。在用放线菌素D抑制转录后的不同时间点，检测NRIP1的mRNA水平。结果如图5所示，在敲低METTL3的细胞中，NRIP1 mRNA的衰减速率显著降低；而在表达METTL3的细胞中NRIP1 mRNA的衰减速率显著升高。因此，METTL3引起的NRIP1 mRNA的衰减变化，至少部分是由于METTL3介导的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰影响了NRIP1 mRNA转录本的稳定性。
如图6A所示，构建psiCHECK2-NRIP1-5'UTR-WT和psiCHECK2-NRI P1-5'UTR-Mut质粒后进行荧光素酶测定。如图6B所示，荧光素酶实验进一步证实METTL3通过m6A甲基化修饰依赖的方式调节NRIP1的表达。通过设计NRIP1的siRNA，敲低NRIP1的表达，序列分别为：NRIP1 siRNA 1:5’GCAGCAGTATTCTCGAGAA 3’；NRIP1 siRNA 2:5’GTGCTATGGTGTTGCATCA3’；NRIP1 siRNA 3:5’GAAGCGTGCTAACGATAAA 3’。如图6C、6D所示，通过qPCR和Western blot检测发现，与对照组相比，NR IP1的表达下调。为进一步在DS中敲低NRIP1的表达，开展对其治疗的研究，奠定了基础。
三、实验结论
我们探索了m6A甲基化修饰在DS大脑皮层的特征，并在DS患者大脑中揭示了一种通过m6A甲基化修饰来减少mRNA衰减，引起NRIP1的过表达的新机制。揭示了DS相关蛋白NRIP1的mRNA甲基化修饰水平降低的新分子机制。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (9)

1.一种基于NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰评估罹患唐氏综合征风险的方法，其特征在于，所述方法包括：
a.测量从受试者采集的组织样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平得到测量值的步骤；
b.将所述测量值与对照值比较的步骤；
c.当所述测量值低于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险高，当所述测量值等于或高于所述对照值时，将所述受试者诊断为患唐氏综合征的风险低。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照值为与所述受试者的年龄相当的正常对象的组织样品获得的值。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述m6A甲基化修饰是指METTL3介导的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织样品为大脑皮层组织。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述m6A甲基化修饰水平的测量方法包括：提取所述组织RNA，加入片段化缓冲液，在适于片段化的条件下加入EDTA进行片段化，使用次氯酸钠和乙醇提取片段化后的RNA，取1％的片段化RNA作为对照，剩余片段化RNA与结合有磁珠的m6A抗体孵育，孵育后清洗磁珠，溶于溶解缓冲液中，用次氯酸钠和乙醇提取上清RNA，构建文库，进行高通量测序，根据测序结果，在全转录组范围鉴定出m6A富集峰相关的转录本。
6.一种用于鉴定对唐氏综合征有用的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a.测量样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平获得第一测量值的步骤；
b.测量从试验化合物给药后样品中的NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平获得第二测量值的步骤；
c.比较第一测量值第二测量值的步骤，和
d.(i)如果所述第二测量值高于所述第一测量值，即所述试验化合物提高NRIP1 mRNA的m6A甲基化的修饰水平，则将所述试验化合物鉴定为对唐氏综合征有用；(ii)如果所述第二测量值等于或低于所述第一测量值，即所述试验化合物对NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰水平没有影响或具有降低作用，则将所述化合物鉴定为唐氏综合征不是有用的。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品为体外培养的HEK293T细胞系。
8.用于检测NRIP1 mRNA的m6A甲基化修饰的试剂在制备筛查唐氏综合征的试剂盒中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述试剂包括针对NRIP1mRNA的引物或探针。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113889184A (zh) * 2021-09-27 2022-01-04 中国矿业大学 一种融合基因组特征的m6A甲基化局部功能谱分解方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014152909A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. ALTERATION OF GENE EXPRESSION BY SYNTHETIC piRNAs AND BY ALTERATION OF piRNA FUNCTION
CN105018617A (zh) * 2015-07-20 2015-11-04 浙江大学 单个基因mRNA甲基化水平检测方法
WO2017081047A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 Lifecodexx Ag Detection of foetal chromosomal aneuploidies using dna regions that are differentially methylated between the foetus and the pregnant female
CN110484624A (zh) * 2019-08-28 2019-11-22 南京大学 一种基于外周血的胃癌生物标志物及其检测方法和应用
EP3594336A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-15 Université de Strasbourg Treatment of down syndrome
CN111261229A (zh) * 2020-01-17 2020-06-09 广州基迪奥生物科技有限公司 一种MeRIP-seq高通量测序数据的生物分析流程

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014152909A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Ibis Biosciences, Inc. ALTERATION OF GENE EXPRESSION BY SYNTHETIC piRNAs AND BY ALTERATION OF piRNA FUNCTION
CN105018617A (zh) * 2015-07-20 2015-11-04 浙江大学 单个基因mRNA甲基化水平检测方法
WO2017081047A1 (en) * 2015-11-10 2017-05-18 Lifecodexx Ag Detection of foetal chromosomal aneuploidies using dna regions that are differentially methylated between the foetus and the pregnant female
EP3594336A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-15 Université de Strasbourg Treatment of down syndrome
CN110484624A (zh) * 2019-08-28 2019-11-22 南京大学 一种基于外周血的胃癌生物标志物及其检测方法和应用
CN111261229A (zh) * 2020-01-17 2020-06-09 广州基迪奥生物科技有限公司 一种MeRIP-seq高通量测序数据的生物分析流程

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONELLA IZZO等: "NRIP1/RIP140 siRNA-mediated attenuation counteracts mitochondrial dysfunction in Down syndrome", 《HUM MOL GENET》 *
CHEN-XIN WANG等: "METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development", 《PLOS BIOL》 *
郁卫东等: "人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究", 《中国生物工程杂志》 *
郭敏军: "mRNA中m6A修饰在帕金森病发病机制中的作用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113889184A (zh) * 2021-09-27 2022-01-04 中国矿业大学 一种融合基因组特征的m6A甲基化局部功能谱分解方法
CN113889184B (zh) * 2021-09-27 2023-08-11 中国矿业大学 一种融合基因组特征的m6A甲基化局部功能谱分解方法

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