CN112121231B - 一种人工血小板 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工血小板，包括微粒载体和直接或通过交联剂负载于该微粒载体表面的第一识别分子和第二识别分子，其中第一识别分子用以识别并将人工血小板粘附于因受损伤而导致血管内皮细胞脱落而暴露的基底膜，第二识别分子用以识别循环中的细胞和/或血小板并与该细胞和/或血小板结合，形成细胞和/或血小板‑人工血小板‑基底膜复合物，并进一步聚集成团形成止血栓。本发明能够维护血管壁的完整性，可用于血管破裂后的出血、止血以及重症炎症后的血小板消耗导致的出血。

Description

一种人工血小板
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人工血小板。
背景技术
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质。巨核细胞虽然在骨髓的造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。因血管创伤而失血时，血小板在生理止血过程中的功能活动大致可以分为两个阶段：第一阶段主要是创伤发生后，血小板迅速黏附于创伤处，并聚集成团，形成较松软的止血栓子；第二阶段主要是促进血凝并形成坚实的止血栓子。
血小板因能运动和变形，故用一般方法观察时表现为多形态。血小板结构复杂，简言之，由外向内为3层结构，即由外膜、单元膜及膜下微丝结构组成的外围为第1层；第2层为凝胶层，电镜下见到与周围平行的微丝及微管构造；第3层为微器官层，有线粒体、致密小体、残核等结构。血小板的表面糖衣能吸附血浆蛋白和凝血因子III，血小板颗粒内含有与凝血有关的物质。
炎症状态下，存在大量炎症介质从血管周围或血管内部对血管进行破坏损伤。引起内皮细胞脱落导致血管或微血管内膜完整性破坏，这引起大量渗出血管内液体导致水肿或缺血再灌注损伤。目前，治疗此类疾病，通过炎症药物抑制炎症。此外，当各种原因引起血管破裂继而导致小血管或大血管出血，大血管出血通过外科手术结扎血管，或介入术栓塞止血；现实中存在其他不明原因引起的出血，比如，消化道出血等内脏出血，无论通过药物、外科手术、介入，疗效有限，甚至找不到出血点，原因错综复杂，且这种出血死亡率高，诊断耗时长，给临床医生和患者造成极大困扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工血小板。
本发明的技术方案如下：
一种人工血小板，包括微粒载体和直接或通过交联剂负载于该微粒载体的表面的第一识别分子和第二识别分子，其中第一识别分子用以识别并将人工血小板粘附于因受损伤而导致血管内皮细胞脱落而暴露的基底膜，第二识别分子用以识别循环中的各种细胞和/或血小板并与其结合，形成“细胞和/或血小板-人工血小板-基底膜复合物”，使其聚集成团形成止血栓。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一识别分子可识别血管内皮基底膜的标记物并将人工血小板粘附于所述基底膜，该第一识别分子包括I、II、III、IV、V型胶原蛋白、CD140、CD106、CD331-CD334、含有RGD结构(精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成的短肽)的合成多肽、含有RGD结构的细胞黏附蛋白或多肽、蛋白聚糖以及氨基聚糖，该蛋白包括层黏连蛋白、内联蛋白、弹性蛋白、血管性血友病因子、玻璃连接蛋白、纤维粘连蛋白、血纤维蛋白原、免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族、黏蛋白样血管地址素、钙黏蛋白家族、基底膜蛋白(bamin)、接触蛋白(ND)、VE钙粘蛋白家族和巢蛋白(entactin)中的至少一种。
进一步优选的，所述整合素家族包括β1组～β88组。具体地，包括LFA-1、LFA-2、LFA-3、ICAM-1、ICAM-2和补体受体。
进一步优选的，所述选择素家族包括L-选择素(白细胞-选择素)、P-选择素(血小板-选择素)和E-选择素(内皮细胞-选择素)。具体地，包括CD62L、CD62P和CD63E。
进一步优选的，所述免疫球蛋白超家族包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)及其Fc段受体。具体地，包括CD2、CD4、CD8、CD11a-CD11c、CD15、CD18、CD22、CD28、CD29、CD31、CD49a-CD49f、CD54、CD58、CD62、CTLA-4、ICOS、VCAM-1、LFA-1、CD80和CD86。
具体地，钙粘蛋白家族包括分布在P-钙粘着蛋白和N-钙粘着蛋白。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二识别分子包括可吸引循环中细胞和/或血小板及其表面识别分子中的至少一种。
进一步优选的，循环中的细胞包括了造血干细胞和祖细胞(HSC、MPP、CMP、MEP、LMPP、MLP、BNK、GMP)，红细胞、B淋巴细胞(Pro-B、Pre-B、Immature B、Regulatory B、
Figure BDA0002690463460000021
B、MemoryB、Plamsa)，NK细胞(CLP、NKP、Cytotoxicity NK、Cytokin NK)，T淋巴细胞(CD4T、CD8T)，单核细胞(hMDP、cMOP、Pre-monocyte、Classical monocyte、Intermedinatemonocyte、non-Classical monocyte)，嗜中性粒细胞(Pro-myelocyte、Myelocyte、Meta-myelocyte、Mature-neutrophil)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。
进一步优选的，所述造血干细胞和祖细胞表面识别分子包括Oct-4、SSEAs、TRA1-60、TRA1-81、碱性磷酸酶、Rex1、Fgf4、Sox2、SH2(CD105、内皮糖蛋白)、SH3(CD166，白细胞活化黏附分子)、CD29、CD34、CD36、CD38、CD44、CD90、CD117、CD133、CD135、CD150、CD184、CD243、ABCG2、AKP、KDR、Sca-1、STRO-1、Nestin、PSA-NCAM和p75 Neurotrophin R中的至少一种。
进一步优选的，所述红细胞表面识别分子包括CD2，LFA-2中的至少一种。
进一步优选的，所述B淋巴细胞表面识别分子包括CD19、CD20、CD22，CD32、CD40、CD80、B细胞抗原受体、B细胞有丝分裂原受体中的至少一种。
进一步优选的，所述T淋巴细胞表面识别分子包括TCR-CD3复合物，CD4和CD8、CD28，共刺激分子，丝裂原受体中的至少一种。
进一步优选的，所述NK细胞表面识别分子包括CD3-、CD16+、CD56+中的至少一种。
进一步优选的，所述可吸引单核细胞的分子包括CD4、CD45+、CD14+、CD114+、CD11a、CD11b、CD91+和CD16+中的至少一种。
进一步优选的，所述可吸引嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细和嗜酸性粒细胞的分子包括CD45+、CD11b、CD15+、CD24+、CD114+和CD182+中的至少一种。
进一步优选的，所述血小板表面的识别分子包括PF1-11的至少一种。
在本发明的一个优选实施方案中，所述微粒载体的材质包括甲壳素或其衍生物、壳聚糖或其衍生物、透明质酸或其衍生物、海藻酸或海藻酸盐或其衍生物、明胶、胶原、多肽、蛋白质、多糖或单糖、淀粉或其衍生物、肝糖或其衍生物、菊粉或其衍生物、聚氨基酸、多聚磷酸酯、巴西橡胶、杜仲胶或其衍生物、阿拉伯树脂或其衍生物、琼脂、褐藻胶或其衍生物、纤维素或其衍生物、聚氨酯或其衍生物、聚四氟乙烯、膨化聚四氟乙烯、聚己内酯或其衍生物、聚乳酸或其衍生物、聚乙二醇或其衍生物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸或其衍生物、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物-聚乙二醇、聚己内酯三醇、聚己内酯二醇、聚(乙二醇)-bLock-聚(ε-己内酯)甲醚、聚乙烯醇、聚丙烯酸或其衍生物、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚N-取代丙烯酰胺、聚甲醛、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚苯乙烯；四纶：锦纶、涤纶、腈纶和维纶；四胶：丁苯橡胶、顺丁橡胶、异戊橡胶、乙丙橡胶、聚碳酸、聚碳酸酯、聚四氢呋喃、聚季铵盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚(1，4-丁二醇丁二酸)酯、芳香聚酯、聚硅氧烷及其衍生物、磷氮化合物、硫氮化合物、金属配位聚合物(例如聚氯化磷氮的PtCL2配合物[NP(NHCH3)2]4·PtCL2)、聚氧化乙烯、线性脂肪族聚酯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙酯共聚物、聚醚胺、聚丙二醇、乙烯-醋酸乙烯共聚物、PAMAM共聚物、酚醛树脂、环氧树脂、不饱和聚酯树脂中的至少一种。
本发明的有益效果是：本发明识别暴露的血管基底膜并与之结合，同时吸附循环中的细胞和/或血小板，起到凝血和抗炎的效果，从而维护血管壁的完整性，可用于血管破裂后的出血、止血以及重症炎症后的血小板消耗导致的出血。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的人工血小板的扫描电镜照片。
图2为本发明实施例1制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图3为本发明实施例2制得的明胶-壳聚糖复合微粒的扫描电镜照片。
图4为本发明实施例2制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图5为本发明实施例3制得的人工血小板液体制剂。
图6为本发明实施例3制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图7为本发明实施例4制得的微粒的扫描电镜照片。
图8为本发明实施例4制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图9为本发明实施例5制得的多孔PCL-COOH微粒的扫描电镜照片。
图10为本发明实施例5制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图11为本发明实施例6制得的人工血小板的扫描电镜照片。
图12为本发明实施例6制得的人工血小板对于小鼠尾静脉止血的结果。
图13为本发明实施例7制得的微粒的粒径图。
图14为本发明实施例7制得的微粒的电位检测图。
图15为本发明实施例7制得的人工血小板的对于小鼠尾静脉止血的结果。
图16为本发明实施例8制得的人工血小板的对于兔子肝脾止血的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：
PEG-PLGA复合微粒的制备：采用外压式SPG膜乳化装置结合W/O/W复乳溶剂挥发法制备微粒。PEG-PLGA复合微粒的制备工艺(5mL体系)：①称取CD34抗体60mg，1g聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)(50∶50)共聚物(PLGA-PEG：28000-2000)，120mg EDC溶于1mL去离子水中，再于50KHz下超声30min，4000rpm离心10min，得到结合CD34抗体的共聚物，CD34的包封利用率为92％，负载率为5.5％，冷冻干燥；②称取IV型胶原蛋白60mg，再加入海藻酸钠和F68的混合溶液作为内水相(1mL，每mL内水相中含有1mg海藻酸钠和0.5mg F68)；将上述共聚物溶解于二氯甲烷中作为油相(4mL)，在冰浴条件下高速匀浆制成初乳。再将初乳作为分散相转移至SPG膜乳化器的储罐内，在30kPa的氮气压力的作用下透过SPG膜(膜孔径为1μm)的膜孔进入溶有4wt％CaCl2和10wt％聚乙烯醇的连续相中，从而形成复乳。0-4℃条件下低速搅拌3h使微粒固化完全，离心收集，纯化水洗涤3次后冷冻干燥即得人工血小板，大小大部分集中在30-50μm。
微粒蛋白负载量和包封率的测定：精密称取微粒约10mg，加入0.1moL/L NaOH-2％SDS溶液5.0mL。置于37℃恒温水浴摇床内匀速振摇48h使微粒裂解，13000rpm离心5min后，取上清液采用BCA法测定蛋白含量。同法处理空白微粒的裂解液作为背景校正。负载量和包封率分别按以下公式计算：负载量(％)＝(微粒中含蛋白量/微粒的总质量)×100％，包封率(％)＝(实际负载量/理论负载量×100％。其包封率为94.81％，负载量为10.53％。
扫描电子电镜(SEM)：将人工血小板及其切片样品均匀分散在贴有导电胶的载样台，置于真空条件下，喷上金粉。利用冷场扫描电子显微镜在电子束强度为10kV的条件下观察人工血小板的表面形态(如图1所示)。
小鼠的尾部止血时间
首先各取3只30g的健康小白鼠，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部1cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg的本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为181.9±16.49s，比control组的412.6±26.22s短，具有显著性差异(如图2所示)。
实施例2：
取液体石蜡为油相，其中加入乳化剂span-80，搅拌，按照水油比1∶6将水相(10wt％明胶-壳聚糖混合乙酸水溶液，明胶壳聚糖的质量比为9∶1，乙酸溶液的浓度为1％)溶液缓慢逐滴加入油相中，保持温度(40℃)和搅拌速度(1000rmp)，乳化形成稳定的W/O型乳液后，迅速改为冰浴，当温度降至3-5℃时加入0.7％(v/v)的交联剂甲醛溶液(购自Sigma，F8775-25ML)，固化交联30min；所得产品离心，然后用水和乙醇交替洗涤3-5次，干燥得如图3所示的明胶-壳聚糖复合微粒。
将5mg上述明胶-壳聚糖复合微粒重悬于PBS(pH7.4)中，充分混匀，加入2mg的偶联剂EDC(EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，调pH＝5.6，在室温下搅拌1h，8500×g离心10min，除去溶液中未反应的EDC获得沉淀，沉淀重悬在1mL PBS中，加入0.5mg/mL的CD14+和0.5mg/mL的FITC标记的CD28因子，于37℃孵育过夜，离心除去溶液中未结合的CD14+和CD28因子，沉淀重悬于1mL的PBS中，4℃保存即得负载CD14+及CD28因子的人工血小板。采用测定荧光强度，得到包封率为(62±5)％，负载量为(20±3)％。
小鼠的尾部止血时间：首先取6只25g的健康ICR小鼠(空白微粒组、载CD14+及CD28微粒组和对照组各2只)，把小鼠进行异氟烷麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部1cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg的本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录载CD14+及CD28微粒组凝血时间为111.6±4.2s，空白微粒组凝血时间为224.8±9.5，比control组的399.4±19.3s短，具有显著性差异(如下表1和图4所示)。
表1
1 2 3 4 5 X±SD
对照组 335 387 426 449 398 399.4±19.3
空白微粒组 230 240 212 247 195 224.8±9.5
载CD14+/CD28微粒组 120 106 98 115 119 111.6±4.2
实施例3：
将脂相600mg(卵磷脂∶胆固醇∶Tween80＝19∶10∶1)溶于5mL无水乙醚中，形成有机相。取PBS缓冲液(pH7.4)1mL注入到有机相中，水浴超声5min，形成稳定的W/O型乳剂，置于旋转蒸发仪上减压除去乙醇得到黏稠的胶状溶液，加入含ICAM-1因子(负载FITC，便于之后检测含量)50mg的PBS缓冲液(pH7.4)8mL，继续减压蒸发得到载有ICAM-1的脂质体。
将1g甘露聚糖溶解于无水二甲基甲酰胺(DMF)中，0.1g棕榈酰氯溶解于含1mL吡啶的无水二甲基甲酰胺中，两者于60℃下混合，并持续搅拌6h。在剧烈搅拌下，将产物缓慢倒入100mL无水乙醇中，获得的沉淀为棕榈酰甘露聚糖，用50mL无水乙醇和25mL无水乙醚洗涤沉淀，精制，于50℃真空干燥1h得白色粉末状产物。将合成产物棕榈酰甘露聚糖通过EDC与CD45+结合(100mg结合20mgCD45+)。
将载有ICAM-1的棕榈酰甘露糖结合到载有CD45+的脂质体上，即将疏水性的棕榈酰基插入到脂质体磷脂膜中，ICAM-1识别血管基底膜，携带脂质体靶向至血管基底膜。室温下，60r/min磁力搅拌，将制备好的载有CD45+的脂质体以1/1的体积比加入到一定浓度的棕榈酰甘露聚糖溶液(PBS，pH7.4)中，继续搅拌10min，40℃条件下孵育4h，即得载有两种蛋白的脂质微粒，即人工血小板(如图5所示)。未结合的棕榈酰氯和游离的蛋白以10000g离心30min除去。得到ICAM-1负载率为(18.6±5)％、CD45+的负载率为(17.3±5)％。
小鼠的尾部止血时间：首先取6只30g的健康小白鼠(实验组和对照组各3只)，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部1cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg的本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为109.6±10.18s，比control组的353.2±17.85s短，具有显著性差异(如图6所示)。
实施例4：
可降解的高分子化合物微粒：
PLA-PEG-PLA共聚物(MW：20000)，货号：659630，sigma。CD4溶液3mL(含CD4因子500ug)加入到含有90mg PLA-PEG-PLA和50ug 6-香豆素的三氯甲烷溶液300uL中，进行涡旋乳化，形成最初的乳化液。上述的乳化液加入到12mL 5％w/v的PVA水溶液中，进一步乳化形成水包油包水乳液，并在功率55kw超声波下冰浴超声10～30min形成稳定乳液，该乳化液进行磁力搅拌过夜，以除去有机物三氯甲烷，过夜后于4℃离心，留取沉淀，用乙醇和水洗涤，真空冷冻干燥24h，得到微粒，大小50％集中在10-50μm。扫描电镜图见图7。精确称取5mg微粒，加入碳化二亚胺盐酸盐(EDC)50mM，层粘连蛋白500ug的水溶液200uL，于37℃孵育24h.用10L蒸馏水对活化的共聚物进行透析，并向溶液中加入层粘连蛋白。反应混合液在冷室保存1天，然后用蒸馏水透析。用冷冻干燥法分离出负载有CD4和层粘连蛋白的微粒。即得负载CD4因子、层粘连蛋白的人工血小板，负载量分别为(22.1±2)％，(19.3±3)％。
小鼠的尾部止血时间：首先取8只30g的健康小白鼠(实验组和对照组各4只)，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部4cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg负载本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为106.2±14.40s，比control组的449.9±36.84s短，具有显著性差异(如图8所示)。
实施例5：
一、细胞黏附肽RGD-(NH2)的制备
RGDS和RGDS-NH2的合成(参考文献：蔡雨.化学-酶法合成细胞粘附位点RGDS前体四肽Bz-RGDS-NH_2[D].吉林大学，2006.以下RGD多肽片段的合成均采自此文献。)RGD-(NH2)的合成：
溶剂的处理和配制
乙醇的干燥处理：500mL乙醇加入25g氧化钙，放置1小时，减压蒸馏，得到干燥后的乙醇，水含量≤0.05％。乙酸乙酯的干燥处理：500mL乙酸乙酯加入50g硫酸镁，放置1小时，过滤除去干燥剂，减压蒸馏，得到干燥后的乙酸乙酯，水含量≤0.05％。
溶解1.5g硫酸铜，(CuSO4·5H2O)和6.0g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)于500mL水中，在搅拌下加入300mL 10％氢氧化钠溶液，用水稀释到1L。此试剂可长期保存。
2、RGDS-NH2的化学法合成
将12g L-天冬氨酸悬浮于20mL 27％氢氧化钠溶液和20mL乙酸乙酯中，在冰浴条件下，将7.5mL氯乙酰氯和27％氢氧化钠同时逐滴加入上述溶液中，滴加过程中保持pH在11-12范围内。滴加完毕，继续搅拌30分钟。加盐酸调节PH至2.0。用乙酸乙酯抽提三次，合并抽提液，无水硫酸钠干燥2h，减压除去乙酸乙酯，得到氯乙酰化天冬氨酸白色固体。
称量氯乙酰化天冬氨酸4.2g，加入4mL乙酸酐，于42℃磁力搅拌3h后，补加0.5mL乙酸酐，继续搅拌3h。待反应混合物冷却后过滤，用100mL石油醚∶乙醚(1∶4)混合物洗涤三次，得到白色粉末状氯乙酰化天冬氨酸甲酯。
将3g氯乙酰化天冬氨酸甲酯溶解30mL 28％的氨水中，于冰浴条件下磁力搅拌48h，减压除去未反应的氨气，得到粗产品，Sephadex G-10色谱柱分离纯化后，冻干得到白色固体RGDS-NH2。
肽合成产品的分离纯化：
上述白色固体RGDS-NH2均采用Sephadex G-10分子筛凝胶柱层析。柱料：SephadexG-10，层析柱：16×1000mm，洗脱液：蒸馏水，检测波长：220nm，流速：0.1mL/min，取100gSephadex G-10干柱料，加500mL蒸馏水浸泡过夜，减压除气泡后装柱。洗脱液平衡过夜。待分离液体0.6mL上样层析。收集产品峰，冻干得产物。
二、多孔PCL微粒的制备：
①PCL-COOH的制备
1g的聚己内酯溶于20mL的1，4-环氧己烷，并与37度磁力搅拌。接下来，加入1g 6-氨基-1己醇，通入氮气反应8h。得到的产物用正己烷沉淀两次获得。再用甲醇、乙醇、两遍去离子水清洗，37℃真空干燥24h。
1g的PCL-OH和1.14g的琥珀酰酐(SA)室温下溶解于20mL的1，4二氧己烷，然后，加入0.4g的K2CO3和0.35g的4-dimethylaminopyridine(4-二甲基氨基吡啶)。混合物在70-80℃下搅拌反应120min。反应完成后，不溶性碳酸盐副产品通过过滤除去，所得溶液用0.2g/mL的醋酸溶液清洗。产物用去离子水沉淀两次除去没有完全反应的SA和DMAP。最后，产品用大量的去离子水和乙醇清洗，37℃减压干燥24h产出PCL-COOH。
②静电纺丝制备多孔微粒
该电喷雾装置由装有注射器的数字注射泵、高压发生器和接地集电极组成。在室温下，PCL-COOH共聚物在三氯甲烷中溶解至少5h，生成均匀稳定的3wt％溶液。在电喷涂过程中，将溶液放入10mL的注射器中，通过注射泵将溶液连续推到一个内径0.5mm弯曲成直角的不锈钢喷嘴上，喷嘴与高压发电机相连。共聚物溶液的流速分别为1mL/h。采用直流高压发生器在喷嘴和接地集电极之间提供12.5kV的电位差。喷嘴与收集器之间的喷洒距离保持在15厘米。采用平板铝箔(15-20cm2)覆盖的旋转圆筒收集器作为收集器。采用电喷雾沉积法制备多孔PCL-COOH微粒(如图9所示)。
三、负载RGD-(NH2)、CD44的PCL-COOH复合微粒制备
将RGD-(NH2)溶于蒸馏水中(约0.1mg/mL)，取250uL，加入上述多孔PCL-COOH微粒800mg，反应2h；加入HO-PEG5K-NHS(average Mn 5,000)，再加入200uL PBS(含有CD4450mg)并不断搅拌，中性偏酸的环境下(pH＝6)反应6h。取出微粒，依次用水、丙酮、水洗涤，检测负载率分别为22.5％和18.9％，真空干燥48h，密封保存备用，即得。
四、小鼠的尾部止血时间
首先取6只25g左右的健康小白鼠(实验组和对照组各3只)，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部1cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为92.90±11.81s，比control组的426.9±34.37s短，具有显著性差异(如图10所示)。
实施例6：
一、合成含RGD多肽的重组丝蛋白
制备方法参考文献：王明启，吴娟红，沈凯，蔡玉荣，姚菊明。含RGD多肽的重组丝蛋白的设计与合成[J]。丝绸，2009(02)：30-33。
利用基因工程方法将含短肽RGD的氨基酸序列连接到桑蚕丝素蛋白中，设计并合成了具有[TS(GAGAGS)5GAGYTGRGDSPAGYGAGVGAS]n(SEQ ID NO.01)一级结构的重组桑蚕丝素-RGD融合蛋白(简称SiLk-RGD)。
需要的试剂：质粒pET-30a(+)、pUC118、菌株EcoLi DH5α及BL21购自Novagen；SpeI，NheI，BamH I和Hind III等限制性内切酶，DNA Marker及蛋白Marker，MiniBESTPLasmid Purification Kit，Agorose GeL DNA Purification Kit。通过①pUC118-Linker质粒的构建；②pUC118-Linker/siLk-RGD克隆载体的构建，③pET30a(+)/siLk-RGD表达载体的构建；④重组蛋白的诱导表达；⑤重组蛋白的分离纯化可以有效地获得重组目的蛋白SiLk-RGD。
二、多孔的PLGA-H微粒的制备
采用优化的乳化溶剂蒸发技术制备
①1.25mL 0.05％(W/V)NH4CO3水溶液加入到4mL含6.25％(w/v)二氯甲烷溶液的PLGA的乳液，进行乳化。
②最初的乳液随后加入到大量的0.1％(w/v)的PVA水溶液去形成二次乳化。
③室温下，不断搅拌上一步的双乳化溶液4h，就可得到多孔的PLGA微粒。
④多孔的PLGA-H微粒：基于PLGA微粒的水化制得。具体来说，PLGA微粒在室温下被浸没与过量的0.1M NaOH溶液30min，然后用去离子水清洗至少5次，以除去过量的NaOH，即得多孔的PLGA-H微粒。
三、负载Silk-RGD和免疫球蛋白G
连接有RGD短肽的丝素蛋白与PLGA-H微粒结合，短肽羧酸一端与氢化的PLGA微粒反应，形成缩水反应，Silk-RGD负载量为79.69％。然后负载免疫球蛋白G，在室温下，复合溶液总体积设置5mL，其中NaCl溶液(0.1moL/L，pH 3.5)与负载SiLk-RGD的PLGA微粒溶液(1.5w/v％，pH 3.5)，此外包含1mL的免疫球蛋白G溶液(25mg/mL，pH 3.5)和用以固定总体积的去离子水(pH 3.5)，添加顺序为负载SiLk-RGD的PLGA-H微粒溶液、去离子水、NaCl溶液、免疫球蛋白G溶液，于磁力搅拌器上搅拌吸附12小时以形成载蛋白微粒，即得如图11所示的人工血小板。计算免疫球蛋白G的负载量为29.94％。
四、小鼠的尾部止血时间
首先取6只30g的健康小白鼠(实验组和对照组各3只)，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部1cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg的本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为96.23±12.30s，比control组的400.2±45.94s短，统计学上具显著性差异(如图12所示)。
实施例7：
两亲性淀粉自组装载体材料自组装胶束粒负载含RGD多肽的层粘连蛋白
生物合成含RGD多肽的层粘连蛋白，参考实施例5。
以淀粉和脂肪酸(月桂酸和硬脂酸)为原料制备两亲性淀粉自组装载体材料。采用碳二亚胺类催化酯化的方法，取淀粉在85℃下充分溶解于DMSO中，以摩尔比0.05∶1的脂肪酸：淀粉比例在反应体系中加入相应质量的脂肪酸，脂肪酸完全溶解后将反应混合物温度降至30℃，随后加入相应比例的DIC试剂，对脂肪酸分子中的羧基活化15min，随后加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)，反应24h。反应结束后用500Da透析袋透析处理除去未反应的反应试剂。干燥，粉碎之后得到不同取代度和侧链长的的两亲性淀粉基自组装载体材料。
将50mg上述制备的淀粉样品溶解到10mL水溶液中，配制成浓度为5mg/mL的两亲性淀粉自组装载体材料溶液(其中的微粒的粒径图见图13，电位检测图见图14)。在85℃水浴中处理30min，冷却至室温后置于4℃冰箱中，经稀释至适当浓度后用于负载活性多肽和蛋白。
选择0.1mg/mL的上述两亲性淀粉自组装载体材料样品溶液，85℃水浴中处理30min，冷却至室温，加入RGD多肽，样品经超声处理10min，在室温下持续搅拌预定时间24h，测定，即得人工血小板，其对RGD多肽装载的包封率80.11％、装载量为74.4％。
小鼠的尾部止血时间：首先取10只30g的健康小白鼠(实验组和对照组各5只)，把小白鼠放进麻醉机里麻醉，待其麻醉完成之后，取出并将其固定在手术台上，接入麻醉呼吸机。用酒精把小鼠的尾巴进行消毒，在距离尾巴根部4cm的地方用手术刀切断，尾部截面开始流血，粘上5mg本实施例制得的人工血小板，直到挤压尾部不再有血液流出为止，记录凝血时间为115.6±4.632s，比control组的413.0±21.39s短，具有显著性差异(如图15所示)。
实施例8：
将1.2g壳聚糖、1.2g海藻酸钠和0.4gIV型胶原蛋白用65mL 1.5％的醋酸溶解成胶状液，在此胶液中加入4g吐温80和5g橄榄油，搅拌均匀，将此白色糊状物滴加到480mL含26g司盘80的石油醚中，于室温900rpm搅拌1h，使之成为稳定的乳化体系；在该乳化体系中加入16mL的4mol/L氯化钙溶液，继续在该条件下搅拌1h；离心，倾去上清液，用50％酒精洗至液体表面无漂浮油斑，冷冻干燥即得空白微粒。将100mg CD34溶于200μL去离子水中，100mgEDC加入其中，倾入500mg空白微粒中，交联剂EDC搅拌均匀后再冷冻干燥后即得载CD34的复合微粒，即人工血小板。
动物处理：健康新西兰大白兔15只，随机分为空白组、空白微粒组、本实施例制得的人工血小板和速效止血粉(明胶止血海绵颗粒)组。所有大白兔用0.5％戊巴比妥钠耳静脉注射麻醉，仰卧固定于手术台上，备皮，标准的正中开腹，逐层进入腹腔，游离、暴露肝脏，在每叶肝脏的前端剪去约1.5cm×0.5cm的肝组织，造成活动出血创面，分别用已精确称重的止血材料敷压伤口，直至出血停止，记录出血时间。手术中，使用已精确称重的绵球收集术中所出的血液，术后与止血材料一同称重，计算术中总的出血量。待肝脏完全止血后，游离、暴露脾脏，将脾脏前端剪去约0.5cm的组织，分别用已精确称重的止血材料敷压伤口，直至出血停止，记录出血时间。称重，计算术中总的出血量。肝脏止血和脾脏止血模型中，载CD34的微粒与空白微粒间均有显著性差异，且与明胶止血微粒有显著性差异。结果见下表2和图16。
表2
Figure BDA0002690463460000121
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (6)

1.一种人工血小板，其特征在于：包括微粒载体和直接或通过交联剂负载于该微粒载体表面的第一识别分子和第二识别分子，其中第一识别分子用以识别并将人工血小板粘附于因受损伤而导致血管内皮细胞脱落而暴露的基底膜，第二识别分子用以识别循环中的细胞并与该细胞结合，形成细胞-人工血小板-基底膜复合物，并进一步聚集成团形成止血栓；
上述第一识别分子可识别血管内皮基底膜的标记物并将人工血小板粘附于所述基底膜，该第一识别分子包括I、II、III、IV、V型胶原蛋白、CD140、CD106、CD331-CD334、含有RGD结构的合成多肽、含有RGD结构的细胞黏附蛋白或其多肽、蛋白聚糖以及氨基聚糖，该蛋白包括层黏连蛋白、内联蛋白、弹性蛋白、血管性血友病因子、玻璃连接蛋白、纤维粘连蛋白、血纤维蛋白原、免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族、黏蛋白样血管地址素、钙黏蛋白家族、基底膜蛋白、接触蛋白、VE钙粘蛋白家族和巢蛋白中的至少一种；
上述第二识别分子包括可吸引循环中的造血干细胞、祖细胞、红细胞、B淋巴细胞、NK细胞、T淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的表面识别分子。
2.如权利要求1所述的一种人工血小板，其特征在于：所述整合素家族包括β1组-β88组。
3.如权利要求1所述的一种人工血小板，其特征在于：所述选择素家族包括L-选择素、P-选择素和E-选择素。
4.如权利要求1所述的一种人工血小板，其特征在于：所述免疫球蛋白超家族包括免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E及其Fc段受体。
5. 如权利要求1所述的一种人工血小板，其特征在于：所述可吸引造血干细胞及祖细胞的表面识别分子包括Oct-4、SSEAs、TRA1-60、TRA1-81、碱性磷酸酶、Rex1、Fgf4、Sox2、SH2、SH3、CD29、CD34、CD36、CD38、CD44、CD90、CD117、CD133、CD135、CD150、CD184、CD243、ABCG2、AKP、KDR、Sca-1、STRO-1、Nestin、PSA-NCAM和p75 Neurotrophin R中的至少一种；
所述可吸引红细胞的表面识别分子包括CD2，LFA-2中的至少一种；
所述可吸引B淋巴细胞的表面识别分子包括CD19、CD20、CD22，CD32、CD40、CD80、B细胞抗原受体、B细胞有丝分裂原受体中的至少一种；
所述可吸引T淋巴细胞的表面识别分子包括TCR-CD3复合物，CD4和CD8、CD28，共刺激分子，丝裂原受体中的至少一种；
所述可吸引NK细胞的表面识别分子包括CD3-、CD16+、CD56+中的至少一种；
所述可吸引单核细胞的表面识别分子包括CD4、CD45+、CD14+、CD114+、CD11a、 CD11b、CD91+和CD16+中的至少一种；
所述可吸引嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细和嗜酸性粒细胞的表面分子包括CD45+、CD11b、CD15+、CD24+、CD114+和CD182+中的至少一种。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的一种人工血小板，其特征在于：所述微粒载体的材质包括甲壳素或其衍生物、透明质酸或其衍生物、海藻酸或其衍生物、明胶、胶原、多肽、蛋白质、淀粉或其衍生物、肝糖或其衍生物、菊粉或其衍生物、聚氨基酸、多聚磷酸酯、巴西橡胶、杜仲胶或其衍生物、阿拉伯树脂或其衍生物、琼脂、纤维素或其衍生物、聚氨酯或其衍生物、聚四氟乙烯、聚己内酯或其衍生物、聚乳酸或其衍生物、聚乙二醇或其衍生物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚羟基乙酸或其衍生物、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物-聚乙二醇、聚（乙二醇）-bLock-聚（ε-己内酯）甲醚、聚乙烯醇、聚丙烯酸或其衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲醛、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚苯乙烯；锦纶、涤纶、腈纶、维纶、丁苯橡胶、顺丁橡胶、异戊橡胶、乙丙橡胶、聚碳酸、聚碳酸酯、聚四氢呋喃、聚季铵盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯、聚（1,4-丁二醇丁二酸）酯、芳香聚酯、聚硅氧烷或其衍生物、磷氮化合物、硫氮化合物、金属配位聚合物、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙酯共聚物、聚醚胺、聚丙二醇、乙烯-醋酸乙烯共聚物、PAMAM共聚物、酚醛树脂、环氧树脂中的至少一种。
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