CN112114133A - 一种用于多重生化检测的微粒排列方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于多重生化检测的微粒排列方法,具体包括微流控芯片以及至少N种不同大小的免疫微粒复合物,N为大于2的整数,通过将混合有N种不同大小免疫微粒复合物的溶液以50‑300μL/min的流速从微流控芯片的流体进口注入其楔形内腔内,在流体作用下使N种不同大小的免疫微粒复合物分别自然的排列在微流控芯片内腔中。本发明简单易操作,检测结果准确灵敏无光学干扰,芯片不易堵塞,可以实现多重编码,广泛用于临床诊断、生化分析、药物筛选等领域的蛋白质、核酸、病原菌等生化标志物的检测,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于多重生化检测的微粒排列方法。该发明能够广泛用于临床诊断、生化分析、药物筛选等领域的蛋白质、核酸、病原菌等生化标志物的检测。
背景技术
多重生化检测有助于生物医学研究和临床疾病快速高效诊断,具有十分重要的意义。在生物医学研究中,很多疾病的发展过程都有多种生化检测指标的协同参与,因此需要从一个样本中同时进行多指标生化标志物的检测和含量分析。比如癌症标志物筛查,术前八项(HBV/HCV/HIV/TP等),以及呼吸道感染病原体(流感、肺支、腺病毒)等。受限于多重生化检测方法对检测传感器的灵敏度和抗干扰能力的极高要求,以及当前国内外多重编码技术极高的技术壁垒,多重生化检测的临床化和产业化发展仍然充满了挑战。
微流控芯片技术为多重生化检测技术提供了一种新的思路。如中国专利《一种基于微球的微流控生物芯片》,公开号CN1595149A,公开日2005年3月16日。这种芯片以阶梯状的微通道作为坝,用以实现不同尺寸微球的固定,随后在这些固定的微球上面进行杂交,最终实现多重目标物的同时检测。这种芯片的缺点是微球固定在台阶边界,非常容易导致微通道的堵塞;尤其是在多重生化检测中,所使用的微球种类越多,流体通道被堵塞的可能性越大,从而可能影响杂交效率,导致检测方法的灵敏度降低。再者,在光学检测中,台阶芯片在台阶处的结构变化会导致光学检测的过程中出现折射、阴影等光学干扰,使得后期检测的过程对光强度的精确计算产生偏差。最后,微流控芯片内微球对检测目标物的检测需要保证两者的充分接触,因此先固定微球再进行杂交的多重生化检测方法容易导致检测效率低、出现假阳性等问题。基于以上,此类微流控生物芯片技术需要改进。
针对目前多重生化检测领域中对微粒排列方式的不足以及技术需求,本领域的技术人员试图发展一种基于微流控芯片的多重微粒排列方法,使其用于多重生化检测,该方法的发明在生物医学研究和临床诊断等领域具有广阔的发展前景。
发明内容
针对上述存在的问题,本发明的目的在于提供一种基于微流控芯片的多重微粒排列方法,为了实现上述目的,本发明的技术解决方案为:一种用于多重生化检测的微粒排列方法,具体包括微流控芯片以及至少N种不同大小的免疫微粒复合物,N为大于2的整数,所述微流控芯片呈楔形状,将混合有N种不同大小免疫微粒复合物的溶液以50-300μL/min的流速从微流控芯片的流体进口注入其楔形内腔内,液体由微流控芯片底部的流体出口流出;在液体流动作用下,N种不同大小的免疫微粒复合物分别自然的排列在微流控芯片内腔中。
所述免疫微粒复合物的粒径为1~50μm,不同免疫微粒复合物之间的尺寸差异大于0.5μm。
所述的微流控芯片由透明基底和透明盖片组合而成,透明基底和透明盖片之间利用封装的方式形成流体通道,其夹角α为0.01-0.045°,其中透明盖片右上部设有流体进口,透明基底左下部设有流体出口。
由于采用了以上技术方案,本发明通过调整微流控芯片盖片和基片之间的夹角变化,结合流体流动对N种不同大小免疫微粒复合物进行了排列,大大简化了多重生化检测的检测过程,降低了检测方法的技术壁垒。本发明原理简单、操作方便,可以实现多种微小尺寸差异微粒的分选和富集,从而提高了多重生化检测的检测效率和检测通量。本方法相比于现有的基于微流控芯片的多重检测方法而言,不易产生微粒堆积堵塞,也很好的解决了台阶式微流控芯片的光学检测干扰等问题。本发明保证了N种不同大小的微粒能方便且准确的排列在微流控芯片中,实现了更加简单和精准的多重生化检测,能很好的应用于临床诊断、生化分析、药物筛选等领域的蛋白质、核酸、病原菌等生化标志物的检测,具有广阔的应用前景
附图说明
图1为微流控芯片的结构示意图。
图2为排列有三种免疫微粒复合物的微流控芯片示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。见附图。
一种用于多重生化检测的微粒排列方法,具体包括微流控芯片以及至少N种不同大小的免疫微粒复合物6,N为大于2的整数。所述微流控生物芯片的夹角大小与所使用的N种微粒的尺寸配套使用。具体操作为:将混合有N种不同大小免疫微粒复合物的溶液以100-300μL/min的流速从微流控芯片的流体进口3注入其楔形内腔5内,液体由微流控芯片底部的流体出口4流出;在液体流动作用下,N种不同大小的免疫微粒复合物分别自然的排列在微流控芯片内腔5中。
所述微流控芯片呈楔形状,宽度约为25mm,长度约为75mm,其材质是玻璃、石英,或者PMMA等透明硬质聚合材料。该微流控芯片由透明基底1和透明盖片2以0.01-0.1°的夹角,通过石蜡封装或者聚合物粘黏的方式组合形成流体通道,其中透明盖片2右上部设有流体进口3,透明基底1左下部设有流体出口4。
所述N种不同大小的免疫微粒复合物是指N种不同大小的修饰了靶向捕获分子的微粒和N种目标物以及N种对应的标记分子相结合后形成的免疫复合物,其粒径范围为1~50μm,不同免疫微粒复合物之间的尺寸差异大于0.5μm。其中,不同大小的微粒的材质是玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅等硬质材料,其形状可以是球形、立方体形、四面体、锥体等;每种尺寸的免疫微粒复合物有多个,结合同种目标物,目标物的种类包括但不限于抗体、核酸、多肽等。
本发明所适用的多重生化检测的目标物包括但不限于细胞因子、肿瘤标记物、各种病源微生物、过敏原、细胞等;适用的样本包括血清样本、血浆样本、尿液、唾液、细胞或组织裂解液等多种生物样本。
实施例1:
一种用于三种细胞因子的多重生化检测的微粒排列方法。在本实施例中,微流控芯片采用玻璃材质的盖片和基片制备,玻璃盖片和基片之间的夹角为0.01度,配套使用的N种免疫微粒复合物中,N=3,微粒成球形,具体为:尺寸为1μm的捕获有细胞因子IL-10的免疫微粒复合物,尺寸为1.5μm的捕获有细胞因子IFN-γ的免疫微粒复合物以及尺寸为2μm的捕获有细胞因子TNF-α的免疫微粒复合物。具体包括以下步骤:
(1)角度为0.01度的微流控芯片的制备:分别在距离盖片和基片边缘16mm和5.5mm处打孔,然后将盖片洗净后在其上表面粘附一层掩膜,通过激光刻蚀将盖片的一端约16mm的部位暴露出来,然后在盖片上旋涂一层厚度为10μm的PDMS预聚物。待预聚物烘干后,将掩膜除去并组合盖片和基片,然后在其边缘涂上PDMS并烘干,即得本实施例所使用的微流控芯片。
(2)基于微粒的多重生化检测:分别将如抗IL-10,IFN-γ,TNF-α抗体修饰到尺寸为1,1.5,2μm的微球上形成特异性的免疫检测微球,将样本溶液注入到免疫检测微球溶液中,并加入修饰有针对IL-10,IFN-γ,TNF-α靶向分子的荧光探针进行孵育,形成3种免疫微粒复合物;
(3)免疫微粒复合物的排列:将反应后的含有3种免疫微粒复合物的全部溶液以100μL/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,液体从微流控芯片的出口流出,在液体流动的作用下,3种不同大小的免疫微球复合物分别自然的排列的微流控芯片的内腔中;
(4)免疫微粒复合物的清洗:将缓冲液PBS以100μL/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,使多重生化检测反应过程中多余未反应的反应物和杂志从免疫微粒复合物的表面洗脱,并从微流控芯片的出口处排出;
(5)免疫微粒复合物的检测:通过3种免疫微粒复合物排列在芯片内腔的位置对所测目标物的种类进行识别,通过免疫微粒复合物所处位置的表面荧光强度对所测目标物的浓度进行定量分析。
实验效果分析:
实验结果表明,微流控芯片的内腔高度在0.8~10μm之间连续变化,相邻尺寸差异为0.5μm的两种免疫微粒复合物形成的条带之间的水平间距为2.9mm。由此可见,本方法可以很好的对微小尺寸差异的微粒进行准确的排列,即使微粒之间的尺寸差异仅有0.5μm也可以很好的分离,这种微小差异的微粒分离效果是很多分选技术难以实现的,说明本方法在多重生化检测中具有突出的优势。实验结果显示微粒在流体通道内部没有明显的堆积,光学检测也无杂散光干扰,相比于台阶式微流控芯片的尺寸编码方法,优势显著。
实施例2:
一种用于八种大尺寸微粒的排列方法。在本实施例中,微流控芯片采用玻璃材质的盖片和基片制备,玻璃盖片和基片之间的夹角为0.1°。配套使用的N种尺寸的微粒,N=8,微粒成球形,具体为:尺寸为15μm的微球,尺寸为20μm的微球,尺寸为25μm的微球,尺寸为30μm的微球,尺寸为35μm的微球,尺寸为40μm的微球,尺寸为45μm的微球,以及尺寸为50μm的微球。具体包括以下步骤:
(1)角度为0.1度的微流控芯片的制备:分别在距离盖片和基片边缘40mm和0.6mm处打孔,然后将盖片洗净后在其上表面粘附一层掩膜,通过激光刻蚀将盖片的一端约40mm的部位暴露出来,然后在盖片上旋涂一层厚度为60μm的PDMS预聚物。待预聚物烘干后,将掩膜除去并组合盖片和基片,然后在其边缘涂上PDMS并烘干,即得本实施例所使用的微流控芯片。
(2)五种较大尺寸微球的排列:将含有8种微球的全部溶液以300μL/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,液体从微流控芯片的出口流出,在液体流动的作用下,8种不同大小的微球分别自然的排列的微流控芯片的内腔中;
(3)五种较大尺寸微球的清洗:将缓冲液PBS以300μL/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,使多余的杂质被洗脱并从微流控芯片的出口处排出;
(4)五种较大尺寸微球的检测:通过8种微球排列在芯片内腔的位置对所测目标物的种类进行识别,分析8种微球排列在芯片内腔中的位置和距离。
实验效果分析:
实验结果表明,微流控芯片的内腔高度在10~60μm之间连续变化,相邻尺寸差异为10μm的微球形成的条带之间的水平间距为5.8mm,且每种微球之间的间距基本保持一致;其中15μm微球与20μm微球之间的水平间接约为2.9mm。在本实施例中,较大尺寸的微球可以通过本方法有效均匀的分离开。本实施例共使用了8种较大尺寸的微球,各尺寸微球可以均匀的分离开而且芯片内腔内并无堵塞现象,保证了多重生化检测的顺利开展。
实施例3:
一种用于三种病毒的多重生化检测的微粒排列方法。在本实施例中,微流控芯片采用玻璃材质的盖片和基片制备,玻璃盖片和基片之间的夹角为0.02度,配套使用的N种免疫微粒复合物中,N=3,微粒成球形,具体为:尺寸为7μm的捕获有甲型流感病毒的免疫微粒复合物,尺寸为9.5μm的捕获有乙型流感病毒的免疫微粒复合物以及尺寸为10.5μm的捕获有合胞病毒的免疫微粒复合物。具体包括以下步骤:
(1)角度为0.02度的微流控芯片的制备:分别在距离盖片和基片边缘15mm和8.6mm处打孔,然后将盖片洗净后在其上表面粘附一层掩膜,通过激光刻蚀将盖片的一端约15mm的部位暴露出来,然后在盖片上旋涂一层厚度为20μm的PDMS预聚物。待预聚物烘干后,将掩膜除去并组合盖片和基片,然后在其边缘涂上PDMS并烘干,即得本实施例配套所需的微流控生物芯片。
(2)基于微粒的多重生化检测:分别将抗甲型流感、乙型流感、合胞病毒抗体修饰到尺寸为7,9.5,10.5μm的微粒上形成特异性的免疫检测微粒,将样本溶液注入到免疫检测微粒溶液中,并加入修饰有针对甲型流感、乙型流感、合胞病毒靶向分子的荧光探针进行孵育形成3种免疫微粒复合物;
(3)免疫微粒复合物的排列:将反应后的含有3种免疫微粒复合物的全部溶液以100μl/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,液体从微流控芯片的出口流出,在液体流动的作用下,3种不同大小的免疫微粒复合物分别自然的排列的微流控芯片的内腔中;
(4)免疫微粒复合物的清洗:将缓冲液PBS以100μL/min的流速注入微流控芯片的楔形内腔内,使多重生化检测反应过程中多余未反应的反应物和杂质从免疫微粒复合物的表面洗脱,并从微流控芯片的出口处排出;
(5)免疫微粒复合物的检测:通过3种免疫微粒复合物排列在芯片内腔的位置对所测目标物的种类进行识别,通过免疫微粒复合物所处位置的表面荧光强度对所测目标物的浓度进行定量分析。
实验效果分析:
实验结果表明相邻尺寸差异为1μm的两种微粒在配套的微流控芯片中的水平方向间距为2.9mm。不同尺寸的微粒之间存在较大间隙,不易互相干扰和重叠,能有效用于多重生化检测指标的同步快速检测。
本实验能实现不同尺寸免疫微粒复合物的同时快速分离和定位,即使微球尺寸差异仅有0.5μm。且本方法操作简单,通道不易堵塞,检测过程无光学干扰,重复性好,稳定度高。
本实验所使用的微流控芯片制作过程简单,重复性好,芯片角度灵活可调,可以批量生产,成本较低。
本实验所表现的编码方式简单易懂,仅需要结合微流控芯片以及N种不同尺寸免疫微粒复合物即可,无需昂贵的检测设备和材料制作工艺,技术壁垒低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于多重生化检测的微粒排列方法,具体包括微流控芯片以及至少N种不同大小的免疫微粒复合物(6),N为大于2的整数,其特征在于:所述微流控芯片呈楔形状,将混合有N种不同大小免疫微粒复合物的溶液以50-300μL/min的流速从微流控芯片的流体进口(3)注入其楔形内腔(5)内,液体由微流控芯片底部的流体出口(4)流出;在液体流动作用下,N种不同大小的免疫微粒复合物分别自然的排列在微流控芯片内腔(5)中。
2.根据权利要求1所述的一种用于多重生化检测的微粒排列方法,其特征在于:所述免疫微粒复合物的粒径为0.5~100μm,不同免疫微粒复合物之间的尺寸差异大于0.5μm。
3.根据权利要求1所述的一种用于多重生化检测的微粒排列方法,其特征在于:所述的微流控芯片由透明基底(1)和透明盖片(2)组合而成,透明基底(1)和透明盖片(2)之间利用封装的方式形成流体通道,其夹角α为0.01-0.045°,其中透明盖片(2)右上部设有流体进口(3),透明基底(1)左下部设有流体出口(4)。
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