CN112113942A - 一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术 - Google Patents

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邓盛元
康凯
马科锋
李斌
李大力
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Abstract

本发明公开了一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,通过在低雷诺数的微流体之间构建化学梯度场,观测受体分子向配体的自发定向迁移距离;将统计所得受体位移与配体浓度、配位数等缔合反应信息关联,提取分子间相互作用的解离常数。不同于传统均相体系中的结合力测量,流动的多相扩散系统能更精确地描绘微观分子反应的瞬态时空,也更接近统计热力学的理想系综模型,因此更具指征有效性。本发明适用于多受体/配体对的组合分析,能通过量子化的趋化阶跃现象更加全面、综合且高效地揭示各级稳定常数、及其与反应计量学之间的定量联系。

Description

一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术
技术领域
本发明属于物化分析技术领域,尤其涉及一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术。
背景技术
化学趋向性原本是指机动性生物组织靠近或远离更高浓度特殊刺激过程的净平移。反之,当化学梯度不存在时,闲置的细菌、微生物等细胞级马达的运动将类似布朗扩散般随机行走。本质上,诱导化学趋向的引诱因子和排斥剂的位置信息,是由跨膜蛋白受体体系所感知的。由于均相环境中分子物种之间的反应也经历扩散-相互作用模式,该复杂的生物识别机器集合体在直觉上唤起了科学家们进行模型简化并类比的思维意识。既而衍生出了一个基本的论题,即非生命物体,尤其是单个分子,能否呈现出一种可以预测地、甚至是其固有的化学趋向行为?然而,该自发定向运动性或许普遍存在,但在系综水平,却因教科书中经验而经典的碰撞理论描述和反应动力学近似处理,而被长期遮掩,变得相当隐晦。诸如振荡反应等奇特现象的发现表明,上述两套解释途径难以全面反映反应中能量交换的动态效果,且适得其反地,将分子间的化学趋向行为按速率常数显著地约简为概括性的描述。因此,化学趋向性的一般性机理的确立及其本性的揭示被人为地长期隐藏了;相关针对性的、但尚未开发的应用也就无从谈起,比如药物输运、样品预富集、纳米孔测序、纳米结构形成和水渗透等,这些受限于传统被动扩散,却在药物、健康产业和地质化学领域极其重要的传质过程。
最近,通过精细时空视角下对经典Michaelis-Menten模型的重温,酶的正化学趋向和反(逆)化学趋向现象在可操控的微流控平台上得到了全面的展示。为了合理地理解这些现象级的运动,科研人员提出了若干假设,包括来自催化剂和底物之间有倾向性的相互作用所产生的瞬间差分应力,构型改变过程中的动量传递,等等;但是,考虑到催化吸热或放热会导致随机扩散程度的提升,催化转化对蛋白质自驱动机动性的本征贡献与否及其程度依然令人费解。鉴于此,拆解催化途径以鉴别分子化学趋向性的精确来源就显得极其重要。另一方面,大分子趋化的推动力侧重于由配体结合和体积排除两方面构成,因为这两种情形,根据Kirkwood-Buff理论,都破坏了包围着的离子型共溶质的化学势。然而,相似的现象-仿聚合物胶体颗粒的扩散泳输运,其在概念上一般认为与“化学趋向性”是等价的,却产生了彼此不一的结论:
研究发现有限的Debye屏蔽层厚度也会对之施加深刻影响。尽管各自在表观上被迥异的亲和力所统摄,这些变化多样的运动连续统都在最小尺度被能量传导过程所供能,正如生命活体那样。从力学化学的角度,只有生物分子残基与其周边在界面上的短程牵引力方能级联凝聚成一股连贯的力量,这意味着在根本上,是微小分子水平的相互作用铺垫了化学趋向位移的基石。
然而,实际研究发现,通过在平面静电场内牺牲一定的运动自由度,阴离子会向季铵盐阳离子构成的人造焓“视界”(Event Horizon)自发汇聚,该现象已被开发用于加速底物的捕获。此外,染料分子在固定聚合物薄膜上的吸附也已被宣称为一个包含憎水性质引导的化学趋向过程。因此可以推测,这些特异的迁移倾向性其实传递了一些共通点:即毋须降秩,趋化活动实质在以简单化合反应平衡为主导的体相小分子中流行。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,包括观测平台、流场配置、计量方法和分析流程;
所述的观测平台包括光学成像系统和其搭载的微流控芯片;
所述的流场配置包括受体、配体在不同溶液中的浓度和不同溶液的粘度,不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序和不同溶液的跨层流浓度梯度;
所述的计量方法包括物理参数的定义、图像统计算法以及数值拟合原理。
进一步地,所述的光学成像系统包括倒置显微镜、sCMOS相机和LED光源;LED光源发出的入射光通过倒置显微镜的荧光激发块经物镜聚焦于微流控芯片底部,sCMOS相机定时拍摄成像照片。
进一步地,所述的受体为天然酶辅基的卟啉化合物;所述受体为金属卟啉衍生物和类似物;所述受体包括ZnTSPP和FeTSPP。
进一步地,所述的配体为组氨酸类似物;所述配体为有机胺;所述配体包括咪唑、1-甲基咪唑、吡啶、4-胺基吡啶和对二氮杂苯。
进一步地,受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液由受体、配体、受体和配体溶解在缓冲液中得到;所述缓冲液为PBS缓冲液或磷酸盐缓冲溶液。
进一步地,所述的微流控芯片包括Ψ型纹样的PDMS微通道,设有3个入口、1个合流点、1个反应室和1个出口。
进一步地,所述的配体溶液浓度范围为0至100mM;受体溶液浓度小于受体与特定配体的解离平衡常数的0.01倍;受体溶液和配体溶液在25℃的动力学粘度与空白缓冲液的相对相差不超过10%;所述受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液均符合层流的雷诺数要求。所述受体配体混合溶液中配体浓度范围为0~100mM,受体浓度小于受体与特定配体的解离平衡常数的0.01倍。
进一步地,所述不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序为从左至右,包括“配体/受体/缓冲液”和“缓冲液/受体配体混合溶液/缓冲液”两种配置方案。
进一步地,所述的跨层流浓度梯度由反应室的几何尺寸、体积流速、溶质扩散系数共同决定,各参数范围是:反应室的宽为234~360μm、高为50~150μm、长为0.5~4cm,体积流速为10~100μL/h,溶质扩散系数为(3.9~15.5)×10-6cm2·s-1。所述的物理参数包括受体的横向化学趋向位移、配体的浓度和配体的配位数。所述的图像统计算法用于统计出受体向特定浓度配体的趋化位移值,依次包括光强采集、背景扣除、组间平均、归一化、第一累积量力矩和第二累积量方差计算和与对照组做差。所述的数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程,包括单位点结合和多位点分步结合两种非线性拟合模型。
进一步地,所述分析流程包括以下步骤:
步骤1:配制受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液和缓冲液;
步骤2:先用缓冲液润洗微通道,再按不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序的配置方案,将不同溶液通入微流控芯片的指定入口;
步骤3:打开LED光源,激发受体产生光致发光,经物镜传递至sCMOS相机,周期性地捕捉已达扩散稳态的受体在接近出口处的荧光图像,将其通过图像采集卡传输到计算机上经软件采用所述图像统计算法处理分析横向光强分布。
本发明的有益效果如下:
(1)不同于传统均相体系中的结合力测量,流动的多相扩散系统能更精确地描绘微观分子反应的瞬态时空,也更接近统计热力学的理想系综模型,因此更具指征有效性。
(2)适用于多受体/配体对的组合分析,相比静态分析,能通过量子化的趋化阶跃现象更加全面、综合且高效地揭示各级稳定常数、及其与反应计量学之间的定量联系。
(3)该技术原理可推广至大分子亲合分析、活性评价、有效成分分离、膜过程评价,以及受体(配体)的筛分优选等应用,并有助于分辨反应的能量特征,比如倾熵反应或倾焓反应。
附图说明
图1为受体分子向其配体的趋化运动示意图;受体和配体都沿对方的梯度向上迁移;ZnTSPP的化学趋向位移δμ作为咪唑浓度的函数可以被用于提取平衡解离常数;
图2为10μM ZnTSPP在不同浓度咪唑存在情况下的归一化荧光强度分布(A),其中箭头指代随配体浓度的增加,分布向左平移;(B)为五种不同N配体的峰位移:(i)咪唑、(ii)1-甲基咪唑、(iii)吡啶、(iv)4-氨基吡啶,和(v)吡嗪,实线代表对方程(1)的最佳拟合;(C)为各配体的分子结构;
图3为10μM ZnTSPP在不同浓度的四种配体存在下的归一化荧光强度分布:(A)1-甲基咪唑、(B)吡啶、(C)4-氨基吡啶,和(D)吡嗪;
图4为FeTSPP与双吡啶配体分步结合的示意图;
图5为双配位诱导受体化学趋向运动的模型图;
图6为以咪唑浓度为函数的ZnTSPP和FeTSPP化学趋向平移;
图7为以吡啶浓度为函数的ZnTSPP和FeTSPP化学趋向平移;
图8为受体聚集实施例的显微采样图与光强分布,其中(A)是对照组(ZnTSPP/ZnTSPP/ZnTSPP),(B)是观测组(ZnTSPP/ZnTSPP+imidazole/ZnTSPP),它们分别取样于中列和右列快照所示的上部与下部ROI中(故意曝光过度以凸显反应室内的流体);
图9为ZnTSPP和咪唑复合物系综的受体聚焦:(A)不同浓度配体对应的荧光强度分布,箭头指示随配体浓度增加的收敛趋势;(B)对应的ZnTSPP量化位移与咪唑含量之间的数据,和Langmuir等温吸附型拟合;(C)按咪唑浓度从低到高顺序合并的显微成像照片;
图10为10μM ZnTSPP在浓度从0到400μM按倍稀释的咪唑存在下的分光光度滴定;曲线a和b分别是100M咪唑和空白缓冲液(10mM pH9.0 PBS)的UV-Vis吸收光谱;
图11是图10中在最大吸收波长(λab=422nm)处的吸光率差异所拟合成的朗缪尔等温线(回归系数R2=0.994)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步详述。
本发明设计了一个紧凑的系统,主要由既为受体也是报告基的荧光活性卟啉,间四(4-苯磺酸)卟吩锌(zinc(II)meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphine,简称ZnTSPP),和一系列非特异性杂环胺配体两部分组成;通过在低雷诺数的微流体之间构建化学梯度场,观测受体分子向配体的自发定向迁移距离;考虑到它们之间较松弛的轴向配位,在定制的微流反应器中实时可视化该自发结合所导致的化学趋向行为,如图1所示;继而开展显微观测,以揭示配体含量与探针拖移之间的定量关系,对其统计分析,将统计所得受体位移与配体浓度、配位数等缔合反应信息关联,提取分子间相互作用的解离常数KD(dissociationconstant)。
本发明一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,包括观测平台、流场配置、计量方法和分析流程;
本发明中,所述的观测平台包括光学成像系统和其搭载的微流控芯片。
作为优选,所述的光学成像系统包括倒置显微镜、sCMOS相机和LED光源;其中,LED光源发出的入射光通过倒置显微镜的荧光激发块经物镜聚焦于微流控芯片底部,sCMOS相机定时拍摄特定位置的成像照片,一般选在合流点与接近出口的跨流层扩散稳态处。所述的微流控芯片包括Ψ型或Y型纹样的PDMS微通道,设有2~3个入口、1个合流点、1个反应室和1个出口。
本发明中,所述的流场配置包括受体、配体溶液的浓度和粘度,不同溶液流进PDMS微通道入口的顺序以及跨层流的浓度梯度。其中,所述的受体为天然酶辅基的卟啉类化合物,包括以锌、铁、铜、锰、钴、钌等金属为中心的卟啉及其衍生物和类似物;所述的配体为组氨酸残基及其类似物,包括咪唑、1-甲基咪唑、吡啶、4-胺基吡啶、对二氮杂苯(吡嗪)等各种脂肪胺和芳香杂环胺;所述的受体和配体都溶解在PBS缓冲液或磷酸盐缓冲溶液中,配体浓度范围为0至100mM,受体浓度小于受体与特定配体解离平衡常数KD的0.01倍;所述的溶液粘度指室温下各种溶液的动力学粘度,须与空白缓冲液接近,雷诺数在3.6左右(符合层流的雷诺数要求Re<2000);所述的溶液流入方式按微通道入口从左至右的顺序安排,分为“配体/受体/缓冲液”和“缓冲液/受体+配体/缓冲液”两种配置方案;所述“配体/受体/缓冲液”表示将配体溶液、受体溶液、缓冲液依次从左至右流入微通道入口;所述“缓冲液/受体+配体/缓冲液”表示将缓冲液、受体溶液和配体溶液的混合物、缓冲液依次从左至右流入微通道入口;所述的层流浓度梯度由反应室的几何尺寸、体积流速(或层流线速度)、溶质扩散系数共同决定,参数范围:宽234~360μm、高50μm、长0.5~4cm、体积流速50μL/h、溶质扩散系数(3.9~15.5)×10-6cm2·s-1
本发明中,所述的计量方法包括物理参数的定义、图像统计算法以及数值拟合原理。其中,所述的物理参数包括受体的横向化学趋向位移、配体的浓度和配体的配位数。所述的图像统计算法用于统计受体向特定浓度配体的趋化位移值,依次包括光强采集、背景扣除、组间平均、归一化、第一累积量(力矩)和第二累积量(方差)计算与对照组做差等若干主要步骤。所述的数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程,包括单位点结合和多位点分步结合两种非线性拟合模型。
本发明的具体实施方式中,所述的Ψ型微流控芯片设有3个微通道入口、1个入口合流点、1个反应室和1个微通道出口,其分析流程包括以下步骤:
步骤1,采用缓冲液配制受体溶液、配体溶液和受体与配体的混合溶液;
步骤2,先用缓冲溶液充分润洗微通道,再分别按“配体/受体/缓冲液”和“缓冲液/受体+配体/缓冲液”两种入口配置,将不同溶液通入微流控芯片的指定入口;
步骤3,打开LED光源,激发受体产生光致发光,经物镜传递至sCMOS相机,周期性地捕捉已达扩散稳态的受体在接近出口处的荧光图像,将其通过图像采集卡传输到计算机上经软件处理分析横向光强分布。
根据Einstein-Stokes方程,物质的扩散速率一般与其尺寸成反比,故该技术适用于观测分子量较小的受体,向更小配体的主动迁徙。首先,构建受体-配体二元可逆体系,并进行一定程度的约简,比如待测流体的雷诺数须足够小,以确保无湍流、涡流、对流等复杂流形;其次,流层间不应存在离子或pH的梯度,以求更加贴近生物流体的真实环境;再次,考虑到卟啉类化合物在自然界中的广泛分布(叶绿素、血红蛋白、细胞色素P450、维生素B12等的辅基),下述实施例都取材于以卟啉为中心的仿生系统。
图1为受体分子向其配体的趋化运动示意图。下述实施例中,在搭载了微流控芯片的光学成像系统中,以ZnTSPP和FeTSPP为受体,观测其在若干种有机胺类配体(咪唑、1-甲基咪唑、吡啶、4-胺基吡啶、吡嗪)的浓度梯度场中的定向迁移。
下述实施例中,所述的微流控芯片采用本领域常规方法制备。聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane,简称PDMS)芯片的制作流程为:将所需体积的单体(Sylgard 184Silicone elastomer kit,Dow Corning)与高弹性交联剂以10:1质量比搅拌混合,再在真空干燥器内脱气消泡2h。随后,将溶液倒在硅晶原片的微通道模板上,并在70℃烤箱内老化12h。从模板上揭下固化了的PDMS块体,用不锈钢针头作打孔器给各通道的出入口穿孔。然后,PDMS和一片洁净的盖玻片被放置于PDC-32G等离子清洗仪/消毒器内,加高压45s。手指稍微用力将PDMS轻压在预处理好的盖玻片上,使二者无缝粘合,并在100℃退火5min。采用的显微成像用盖玻片经过以下预处理:将盖玻片置于陶瓷支架上(宽22×长40×厚0.15mm,Fisherbrand,Fisher Scientific)在接近沸腾的7X清洁剂(MP Biomedicals LLC.)与超纯水(≥18MΩ)的混合溶液中浸泡清洗2h。然后,玻璃片用超纯水充分冲洗并用N2吹干表面,随后置于530℃马弗炉中退火6h。
下述实施例中,采用的的光学成像平台主要是倒置显微镜(Nikon Eclipse Ti2-U)。来自发光二极管(Light-Emitting Diode,即LED)光源的入射光通过绿色荧光激发块(λex=590nm)、经10X物镜(数值孔径:0.25,Ph1 DL∞/-,起焦距离:10.5)聚焦于PDMS芯片底部。用Nikon sCMOS相机(≥1600万真实物理像素输出,36mm×23.9mm(1.7英寸)大靶面科研级CMOS芯片,最大传输速度≥45帧/秒,QE值≥77%)捕捉通道的荧光成像,并用NISElements软件(Advance版本)的Timelapse模块实时拍摄。具体参数:曝光间隔30s、周期20min、曝光时长250ms。记录的图像通过图像采集卡传输到计算机上处理分析,具体分析方法如下:选择感兴趣区域(Region of Interest,简称ROI)的荧光强度,扣除背景并取平均值;再以通道宽度为函数自变量,用OriginPro 8.5软件做归一化处理。为了绘制微通道内流形,所有图像以16位RGB的“伪彩”(pseudocolor)渲染,标定对比度的下限2000、上限13000,取代灰度图(grayscale)。
实施例1
本实施例提供一种测量ZnTSPP受若干配体梯度影响而发生集体迁徙型(Collective Migration)化学趋向运动的技术,并用于分析受体与配体之间的结合力,具体步骤如下:
步骤1:配制10mM pH7.4的PBS溶液,并用该溶液分别配制受体溶液A:10μM ZnTSPP溶液,和一系列配体包括咪唑(imidazole)、1-甲基咪唑(1-methylimidazole)、吡啶(pyridine)、4-胺基吡啶(4-aminopyridine)、吡嗪(pyrazine)的溶液B,溶液B的浓度从10- 6M到1M。
步骤2:用缓冲溶液充分润洗微通道。
步骤3:按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作PBS/ZnTSPP/PBS,当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内如图2A中相对虚线对称分布的光强,作为对照组。
步骤4:如图2A所示,按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作imidazole/ZnTSPP/PBS,当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强;逐次提高配体的浓度从10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.1直至1M,将受体在不同配体浓度梯度下的荧光强度分布汇总。
步骤5:如图3所示,按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作(A)1-methylimidazole/ZnTSPP/PBS、(B)pyridine/ZnTSPP/PBS、(C)4-amino-pyridine/ZnTSPP/PBS和(D)pyrazine/ZnTSPP/PBS,当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强;逐次提高配体的浓度从10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.1直至1M,将受体在不同配体浓度梯度下的荧光强度分布分别汇总。
步骤6:按照下述推导,确立衡量趋化移动的指标,并予以计算:
将实验条件表示为α。该指标具体指代受体和配体的总浓度。在实验中,一股混合溶液沿z方向流经微流控装置。定义横向位置为x,其特指以通道内壁为起点的距离,且范围在0≤x≤L的区间内,L是通道宽度。总荧光强度,
Figure BDA0002689248130000071
继而以x的函数,在微通道宽度方向上以z为中心、宽度为dz的细分小块内测量。我们定义
Figure BDA0002689248130000072
为所观测到的强度最小值:
Figure BDA0002689248130000073
定义归一化的强度,Iα(x):
Figure BDA0002689248130000074
Figure BDA0002689248130000075
这一定义同时具备物理(“质量守恒”)意义与统计(“可比性”)意义,其优点显而易见,即Iα(x)可以作为归一化的几率分布处理;特别提示,Iα(x)有长度的倒数单位。
进一步地,在特定情况下,Iα(x)可以直接与荧光素的数密度关联。考虑两个前提条件:
I.所测强度与荧光基团强度线性相关,根据
Figure BDA0002689248130000081
这里,bα是背景信号,ρα(x)是位置x处的数密度,而kα是来自每个发光体对信号的贡献。留意kα和bα与x独立,但可能随实验条件变化。
II.所测强度的最小值为背景噪声提供了良好估算:
Figure BDA0002689248130000082
或等价为
Figure BDA0002689248130000083
如果前述两个前提满足,那么
Figure BDA0002689248130000084
而且
Figure BDA0002689248130000085
其中
Figure BDA0002689248130000086
是贡献所测得荧光分子总数,也就是处于z的宽度为dz的小块。再者
Figure BDA0002689248130000087
如此Iα(x)dx就是在dx间隙内有关x的发光体份数。
Iα(x)既以恰当地归一化,“化学趋向位移”就可使用标准度量加以表征,并分析其几率密度。具体表达如下:
Figure BDA0002689248130000088
该式称为第一力矩或第一累积数,特指荧光分子的平均位置。
通过比较两个不同实验的Iα(x)来定义“化学趋向移动”。两个实验都包括相同的受体浓度,但其中一个实验包含配体(α=L,ligand),而另一个是不含配体的对照组(α=C,control)。这样化学趋向移动可被量化表示为:
Figure BDA0002689248130000089
注意δμ<0,如果移动是向着在“左”泳道的配体。δμ的绝对值,|δμ|,会让该“集体迁徙”算法不依赖于泳道的左右布局。
步骤6:如图2B所示,将各配体浓度诱导ZnTSPP发生化学趋向运动所得的数据点,用下述朗缪尔等温吸附函数(Langmuir Isotherm)拟合:
Figure BDA0002689248130000091
其中,δμ是ZnTSPP在不同配体梯度中相对对照组的趋化位移量,B对应非常高配体浓度时的最大化学趋向平移(即幅度),KD是配体-受体复合物生成的平衡解离常数,cligand是配体浓度。各配体对应的非线性拟合曲线中的B和KD值汇总于表1。
表1:ZnTSPP受体与含N配体之间结合的B与KD测算值
Figure BDA0002689248130000092
由于配体结构的不同,导致配位数的差异,使ZnTSPP向4-amino-pyridine和pyrazine趋化移动的δμ是其向imidazole、1-methylimidazole和pyridine的2倍左右;以两个ZnTSPP受体对1个哌嗪配体之结合计量比的轴向配位复合物的典型结构如下:
Figure BDA0002689248130000093
实施例2
本实施例提供一种分析多种受体在同一配体梯度中发生“集体迁徙”式化学趋向运动的技术,用于比较不同受体/配体对之间的缔合性质,具体步骤如下:
步骤1:配制10mM pH7.4的PBS溶液,并用该溶液分别配制两种受体溶液A:10μMZnTSPP溶液与FeTSPP溶液,和两种配体溶液B:imidazole和pyridine,溶液B的浓度皆从10- 6M到1M。
步骤2:用缓冲溶液充分润洗微通道。
步骤3:按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作PBS/ZnTSPP/PBS和PBS/FeTSPP/PBS,当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强,作为对照组。
步骤4:按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作imidazole/ZnTSPP/PBS、imidazole/FeTSPP/PBS、pyridine/ZnTSPP/PBS和pyridine/FeTSPP/PBS。当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强;逐次提高配体的浓度从10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.1直至1M,将受体在不同配体浓度梯度下的荧光强度分布汇总。
步骤5:如图6所示,按照公式10分别计算ZnTSPP和FeTSPP两种受体在imidazole配体各梯度中的趋化移动,再用公式11拟合得到ZnTSPP与imidazole之间的B和KD,以及FeTSPP与imidazole之间的B1、B2和KD1、KD2;同理,如图7所示,按照公式10分别计算ZnTSPP和FeTSPP两种受体在pyridine配体各梯度中的趋化移动δμ,再用公式11拟合得到ZnTSPP与pyridine之间的B和KD,以及FeTSPP与pyridine之间的B1、B2和KD1、KD2。各配体对应的非线性拟合曲线中的B和KD值汇总于表2。
表2:ZnTSPP和FeTSPP受体与咪唑和吡啶配体之间结合的B与KD测算值
Figure BDA0002689248130000101
步骤6:如图4所示,比较不同受体相对同种配体趋化的δμ。对于可容纳更多配体的受体而言
Figure BDA0002689248130000102
以反映按步趋化的倍化阶跃(B1=B2=…=Bn或B1+B2+…+Bn=nB1=nB2=…=nBn),一般常量分析难以描绘出如图5所示的多价成键过程中的多重过渡图景。这也取决于相邻的KD(n)、KD(n+1)在数量级上的差距,但量子化特性(Bm+n=Bm+Bn和Bm/m=Bn/n)依然存在。
实施例3
本实施例提供一种适用于观测较大受体,如蛋白质、细胞膜受体等,向小分子配体趋化的分析模式,用于清晰呈现并分析大受体与小配体之间的结合力,具体步骤如下:
步骤1:配制10mM pH7.4的PBS溶液,并用该溶液分别配制受体溶液A:10μM ZnTSPP溶液,和受体/配体混合溶液B:ZnTSPP+imidazole,溶液B中ZnTSPP的浓度为10μM、而imidazole的浓度从10-6M到1M。
步骤2:先后用缓冲溶液和溶液A充分润洗微通道。
步骤3:如图8所示,按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作ZnTSPP/ZnTSPP/ZnTSPP,当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强,作为空白对照组。
步骤4:如图9所示,按微通道的3个入口从左至右的顺序分别通入如下溶液,该配置记作ZnTSPP/ZnTSPP+imidazole/ZnTSPP。当合流点的荧光分布稳定时,记录出口附近采样区内的光强;逐次提高配体的浓度从10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.1直至1M,将受体在不同配体浓度梯度下的荧光强度分布汇总。
步骤5:如图9A所示,鉴于所观察的分布已不再是平移变化,而是加宽/缩窄的“受体集中”模式,此时δμ=0;由公式10出发,改用如下度量公式:
Figure BDA0002689248130000111
Figure BDA0002689248130000112
称之为第二累积数(即方差)。它的根,σα,是标准偏差,用于表征分布的宽窄。于是
Figure BDA0002689248130000113
δσ被用于计算趋化位移量。用公式11拟合得到ZnTSPP与imidazole之间的B和KD,KD=(89.2±16.4)μM,与由实施例1所得表1中的值接近,说明“受体迁徙”与“受体聚焦”这两种测量方案在结合力分析上是等价的。
步骤6:如图10所示,用标准的分光光度滴定法检验上述各实施例的分析结果,锌卟啉与N配体之间的结合常数,KD,可基于平衡态的紫外-可见吸光度与浓度的关系来测定:
Figure BDA0002689248130000114
其中,ΔA是纯ZnTSPP溶液与含不同量配体的彼此吸光率的差别,而cligand是配体浓度。在Shimadzu UV-3600光谱系统中完成滴定操作,用其配备的软件UVProbe 2.6记录数据。如图11所示,通过公式15拟合ΔA与cligand的关系,KD值估测为74.4±6.2μM。这说明本发明涉及的趋化分析技术与其他方法的检测结果有着合理的一致。

Claims (10)

1.一种基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,包括观测平台、流场配置、计量方法和分析流程;
所述的观测平台包括光学成像系统和其搭载的微流控芯片;
所述的流场配置包括受体、配体在不同溶液中的浓度和不同溶液的粘度,不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序和不同溶液的跨层流浓度梯度;
所述的计量方法包括物理参数的定义、图像统计算法以及数值拟合原理。
2.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的光学成像系统包括倒置显微镜、sCMOS相机和LED光源;LED光源发出的入射光通过倒置显微镜的荧光激发块经物镜聚焦于微流控芯片底部,sCMOS相机定时拍摄成像照片。
3.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的受体为天然酶辅基的卟啉化合物;所述受体为金属卟啉衍生物和类似物;所述受体包括ZnTSPP和FeTSPP。
4.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的配体为组氨酸类似物;所述配体为有机胺;所述配体包括咪唑、1-甲基咪唑、吡啶、4-胺基吡啶和对二氮杂苯。
5.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液由受体、配体、受体和配体溶解在缓冲液中得到;所述缓冲液为PBS缓冲液或磷酸盐缓冲溶液。
6.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的微流控芯片包括Ψ型纹样的PDMS微通道,设有3个入口、1个合流点、1个反应室和1个出口。
7.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的配体溶液浓度范围为0至100mM;受体溶液浓度小于受体与特定配体的解离平衡常数的0.01倍;受体溶液和配体溶液在25℃的动力学粘度与空白缓冲液的相对相差不超过10%;所述受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液均符合层流的雷诺数要求。所述受体配体混合溶液中配体浓度范围为0~100mM,受体浓度小于受体与特定配体的解离平衡常数的0.01倍。
8.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序为从左至右,包括“配体/受体/缓冲液”和“缓冲液/受体配体混合溶液/缓冲液”两种配置方案。
9.根据权利要求1所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述的跨层流浓度梯度由反应室的几何尺寸、体积流速、溶质扩散系数共同决定,各参数范围是:反应室的宽为234~360μm、高为50~150μm、长为0.5~4cm,体积流速为10~100μL/h,溶质扩散系数为(3.9~15.5)×10-6cm2·s-1。所述的物理参数包括受体的横向化学趋向位移、配体的浓度和配体的配位数。所述的图像统计算法用于统计出受体向特定浓度配体的趋化位移值,依次包括光强采集、背景扣除、组间平均、归一化、第一累积量力矩和第二累积量方差计算和与对照组做差。所述的数值拟合原理是Langmuir等温吸附方程,包括单位点结合和多位点分步结合两种非线性拟合模型。
10.根据权利要求1至9任一项所述基于分子化学趋向位移的亲合力分析技术,其特征在于,所述分析流程包括以下步骤:
步骤1:配制受体溶液、配体溶液、受体配体混合溶液和缓冲液;
步骤2:先用缓冲液润洗微通道,再按不同溶液流进微流控芯片的微通道入口的顺序的配置方案,将不同溶液通入微流控芯片的指定入口;
步骤3:打开LED光源,激发受体产生光致发光,经物镜传递至sCMOS相机,周期性地捕捉已达扩散稳态的受体在接近出口处的荧光图像,将其通过图像采集卡传输到计算机上经软件采用所述图像统计算法处理分析横向光强分布。
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