CN112107686B - 乙氧基荧光素乙酯在肝癌细胞中的靶向作用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乙氧基荧光素乙酯在肝癌、胃癌中的靶向用途。具体地，本发明提供了一种式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物的用途，用于制备用于靶向肿瘤细胞中的靶向剂。本发明的乙氧基荧光素乙酯可以对肿瘤细胞进行特异性识别，可以作为肿瘤的高选择性靶向工具，在诊治疾病上，将具有广泛的潜在使用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及乙氧基荧光素乙酯在肝癌细胞中的靶向作用。
背景技术
目前恶性肿瘤是威胁人类生命的最为重要的原因之一，而在年龄较轻中的人群中，更是第一位的致死原因，虽然近百年的抗癌研究取得了一些成绩，但根本性问题没有得到解决，主要原因是目前使用的化疗，放疗等疗法都缺乏定向，靶向，精准的杀伤能力。
因此，本领域迫切需要开发一种特异性识别肿瘤细胞的靶向工具。
发明内容
本发明的目的就是提供一种特异性识别肿瘤细胞的靶向工具。
本研究利用细胞培养，荧光激发显影技术，发现一个小分子物质，乙氧基荧光素乙酯可以进入肝癌细胞，胃癌细胞，并可留置富集很长时间，大于24小时，具有定向，靶向肝癌，胃癌细胞作用，可为此类癌细胞的靶向性，精准性，甚至是特异性诊断及治疗提供了理想的靶向性工具。
在本发明的第一方面，提供了一种式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物的用途，用于制备用于靶向肿瘤细胞中的靶向剂，
式中，
R1为C1-C6烷基、C3-C8环烷基；
L1为-CO-、或-CH2-；
L2为-O-、或-NH-；
R2为H、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、或(C1-C4亚烷基)-Z，其中Z为氮芥、铂类等烷化剂毒素分子、核素。
在另一优选例中，所述毒素分子包括抗代谢、抗有丝分裂类毒素、MMAE(单甲基奥瑞他汀E)。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：肝癌细胞、胃癌细胞、恶性母细胞瘤。
在另一优选例中，所述恶性母细胞瘤包括与HepG2类似的恶性母细胞瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：肝母细胞瘤细胞。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自选自下组：HepG2、MGC-803。
在另一优选例中，R1为甲基、乙基、或丙基。
在另一优选例中，R2为甲基、乙基、或丙基。
在另一优选例中，L1为-CO-，且L2为-O-。
在另一优选例中，所述的式A化合物选自下组：
在另一优选例中，所述的靶向肿瘤细胞中的靶向剂包括：造影剂。
在本发明的第二方面，提供了一种体外的、非诊断的特异性识别肿瘤细胞的方法，包括：在体外，将待检测的细胞与肿瘤细胞靶向剂进行接触并孵育，然后测定所述细胞的胞内中所述肿瘤细胞靶向剂的数量；
其中，所述的肿瘤细胞靶向剂是式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；(其中式A如权利要求1中所定义)；
其中，如果所述细胞的胞内所述肿瘤细胞靶向剂的数量S1显著高于正常细胞内所述肿瘤细胞靶向剂的数量S0，则表示所述细胞为肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指S1/S0≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3.0。
在另一优选例中，所述的测定包括荧光测定。
在另一优选例中，所述的荧光测定是测定所述细胞的胞内荧光量。
在另一优选例中，所述的荧光检测采用EFEE458nm激发光，并在558nm下检测荧光。
在另一优选例中，所述的待检测的细胞为哺乳动物的细胞。
在另一优选例中，所述的待检测的细胞包括：血液样品中的细胞、体液样品中的细胞、尿液样品中的细胞、呕吐物中的细胞、胃液中的细胞、排泄物中的细胞。
在另一优选例中，所述的体液包括：腹水、胸腔积液、胆汁、宫腔液、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：肝癌细胞、胃癌细胞、各种恶性母细胞瘤，如神经母细胞瘤，肾母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，髓母细胞瘤。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞包括：肝母细胞瘤细胞。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞选自选自下组：HepG2、MGC-803。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗的。
在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，包括：
(i)第一容器，以及位于所述第一容器内的第一试剂，所述的第一试剂为肿瘤细胞靶向剂，所述的肿瘤细胞靶向剂是式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；(其中式A如权利要求1中所定义)；和
(2)使用说明书，所述使用说明书记载了所述式A化合物作为靶向造影剂的用法。
在本发明的第四方面，提供了一种特异性识别肿瘤细胞的方法，包括：给需要的对象施用一肿瘤细胞靶向剂，所述的肿瘤细胞靶向剂是式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；(其中式A如权利要求1中所定义)；
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的施用包括口服、注射、或其组合。
在另一优选例中，所述的施用包括口服。
在本发明的第五方面，提供了一种试剂产品(或试剂组合)，包括：
(i)第一试剂，所述的第一试剂为肿瘤细胞靶向剂，所述的肿瘤细胞靶向剂是式A所示的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；(其中式A如权利要求1中所定义)；和
(ii)药学上可接受的载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了EFEE染色液(2#)与荧光素(1#)染色三株不同类型癌细胞的效果，HepG2：肝癌细胞；A549：肺癌细胞；MGC-803：胃癌细胞。
图2显示了不同浓度的EFEE染色液对肝癌细胞与非肝癌细胞的染色，HepG2：肝癌细胞；HL-7702：正常肝细胞。
图3显示了EFEE染色液孵育时间对肝癌细胞染色的影响。
图4显示了EFEE染色液染色肝癌细胞后保留时间的测定，0h：表示2#染料孵育细胞3h撤掉后，立即拍照；-1h：表示2#染料孵育细胞3h后，撤掉染料，洗净后换新鲜培养液继续培养1h后，在荧光显微镜下观察(其他时间以此类推)。
图5显示了EFEE以及荧光素的吸收光谱图。
图6显示了EFEE以及荧光素的激发光谱图。
图7显示了EFEE以及荧光素的发射广谱图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种式A化合物，以乙氧基荧光素乙酯为例，式A化合物在肝癌细胞中作为靶向剂。利用显微荧光技术，在体外细胞培养体系中，式A化合物在很低浓度(3uM)时，在很短时间(15分钟)内就可以对具有代表性的肝癌细胞，胃癌细胞实现选择性摄入，出现特异性荧光显色，而对同类型的非癌细胞没有选择性摄入(或者很少能摄入)，不出现特异性荧光显色。并且这样的选择性摄入，在经过洗涤，并换用没有染色液的细胞培养液后，不会从癌细胞中流出，保留时间至少大于24小时。EFEE可以对肝癌细胞、胃癌细胞或类似的恶性母细胞瘤细胞进行特异性识别，可以作为肝癌和胃癌等癌症的高选择性靶向工具，在诊治疾病上，将具有广泛的潜在使用价值。在此基础上完成了本发明。
HepG2肝癌细胞株
HepG2肝癌细胞株是属于肝母细胞瘤(Heptoblastoma)，母细胞瘤在人类是属于高度恶性的肿瘤，多见于小儿，常见的有神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，髓母细胞瘤，骨母细胞瘤，胶质母细胞瘤，肾母细胞瘤等。
式A
其中，R1、R2、L1、L2如上所述。
优选地，式A化合物为乙氧基荧光素乙酯
乙氧基荧光素乙酯，Ethoxyfluorescein ethyl ester(EFEE)，乙基-2-(6-乙氧基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)苯甲酸酯，英文名称：ethyl 2-(3-ethoxy-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate。
细胞毒素
术语“细胞毒素”是指抑制或阻止细胞表达活性、细胞功能和/或造成细胞破坏的物质。该术语包括放射性同位素、化学治疗剂以及毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。毒素的例子包括但不限于：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonariaofficinalis)抑制剂以及糖皮质激素和其它化学治疗剂，以及放射性同位素，如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212或213、P32和包括Lu177在内的Lu的放射性同位素。抗体也可与能够将前药转化成其活性形式的抗癌前药活化酶偶联。
优选的小分子药物为具有高细胞毒性的化合物，优选单甲基澳瑞他汀(monomethylauristatin)、加利车霉素、美登素类、或其组合；更佳地选自：单甲基澳瑞他汀-E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀-D(MMAD)、单甲基澳瑞他汀-F(MMAF)、或其组合。
本发明的主要优点包括：
1)本发明所述的乙氧基荧光素乙酯可以对肿瘤细胞进行特异性识别，可以作为肿瘤的高选择性靶向工具，具有广泛的潜在使用价值；
2)本发明所述的乙氧基荧光素乙酯只进入肿瘤细胞，而不进入正常细胞，对正常细胞损伤小，副作用低；
3)基于以上二点，乙氧基荧光素乙酯可以作为一个全新的化学实体(NCE)进行优化，再接上毒素，核素等，估计可实现对正常细胞损伤小，对能选择性进入的癌细胞达到靶向性，选择性，精准性杀伤，甚至是特异性诊断及治疗。包括利用荧光技术实现手术导航，实现精准性根治的目标。甚至可以通过静脉滴注或口服乙氧基荧光素乙酯，待24-48小时后，机体体液中乙氧基荧光素乙酯基本排空时，再通过活检病人癌瘤组织，在细胞病理水平，利用特定波长激发及荧光显色技术，用于活体肿瘤诊断，或者根据该化合物在癌瘤细胞内的情况，事先预测该靶向治疗的疗效。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明所用的材料和试剂为市售产品。
材料
荧光素
实施例1.
乙氧基荧光素酸乙酯的制备
将荧光素(5g)溶解在DMF中，滴加20倍当量的溴乙烷，氮气保护，室温搅拌过夜。后加入二氯甲烷，水洗三次，收集有机相，旋蒸，过硅胶柱纯化，从而得到乙氧基荧光素酸乙酯(EFEE)，收率≥80％。
实施例2.
EFEE染色液与荧光素染色三株不同类型癌细胞的效果
实验方法：
1)HepG2,A549，MGC-803细胞种于6孔板(30万细胞/孔)，置于细胞培养箱培养过夜。
2)分别加入终浓度为0μM,20μM荧光染料，孵育3h后，弃尽培液，使用温的1xPBS清洗3次，各孔再加入适量的温PBS。
3)使用奥林巴斯IX73型倒置荧光显微镜拍摄荧光照片。
结果：如图1所示，
1.荧光素荧光染料(1#)在HepG2细胞中的摄入量与A549和MGC-803细胞没有明显差异，都没有细胞内摄入。
2.EFEE荧光染料(2#)在HepG2细胞中的摄入量非常显著高于A549和MGC-803细胞，在MGC-803细胞也有明显摄入。
实施例3.
不同浓度的EFEE染色液对肝癌细胞与非肝癌细胞的代表性人肝细胞(HL-7702＝L02)的染色
实验方法
1)HepG2,HL-7702细胞种于6孔板(30万细胞/孔)，置于细胞培养箱培养过夜。
2)分别加入终浓度为0μM,5μM，20μM荧光染料，孵育3h后，弃尽培液，使用温的1xPBS清洗3次，各孔再加入适量的温PBS。
3)使用奥林巴斯IX73型倒置荧光显微镜拍摄荧光照片。
结果：如图2所示，
1.EFEE荧光染料在HepG2细胞中摄入量非常显著高于HL-7702细胞。
2.EFEE荧光染料在HL-7702细胞中的摄入量很少，几乎没有。
3.EFEE荧光染料在HepG2细胞中摄取没有明显的浓度差异性。
实施例4.
EFEE染色液孵育时间对肝癌细胞染色的影响
实验方法
1)HepG2细胞种于6孔板(30万细胞/孔)，置于细胞培养箱培养过夜。
2)加入终浓度为20μM的EFEE荧光染料，分别孵育15min,30min,1h,2h,3h后，弃尽培液，使用温的1xPBS清洗3次，各孔再加入适量的温PBS。
3)使用奥林巴斯IX73型倒置荧光显微镜拍摄荧光照片。
结果：如图3所示，
EFEE荧光染料可以快速被HepG2细胞摄取，随孵育时间延长，荧光强度没有明显增加。
实施例5.
EFEE染色液染色肝癌细胞后保留时间的测定
实验方法
1)HepG2细胞种于6孔板(30万细胞/孔)，置于细胞培养箱培养过夜。
2)加入终浓度为20μM的EEEE荧光染料，孵育3h后，弃尽培液，使用温的1xPBS清洗3次，各孔再加入适量的温PBS。继续培养。
4)分别在弃掉EFEE荧光染料后的0h,1h,2h,3h,6h,12h,24h，使用奥林巴斯IX73型倒置荧光显微镜拍摄荧光照片。
结果：如图4所示，
EFEE荧光染料在HepG2细胞中可以长久保持24h不被降解。随着撤销染料的时间延长，细胞的荧光强度没有明显的变化。
实施例6.
诊断：用于胃镜下的胃癌诊断。在血液，腹水，胸腔积液，尿液，宫腔液，其它体液中，以及组织或其病理切片中等，寻找癌细胞用于诊断。带上碘，钆，放射性F18等用于肿瘤结节影像学定性，定位，定量等诊断、鉴别诊断等。
实施例7.
治疗：作为肝癌，胃癌识别导引剂，带上放射性，细胞毒药物，或者毒性基团等杀伤剂，对肝癌，胃癌等实施选择性杀伤。以肝癌经皮选择性肝动脉化疗栓塞(TACE)治疗为例，可通过供血动脉灌注性化疗。还可以用于肿瘤病人手术时的导航，前哨淋巴结转移的识别，根治性手术清扫，以及前面所述机体静脉注射或口服24-48后，用于活体肿瘤诊断，利用该方法的靶向治疗对肿瘤疗效的预测等。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
1.一种式A所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于靶向肿瘤细胞中的靶向诊断或治疗制剂中的用途，
(A)
式中，
R1为甲基、乙基、或丙基；
L1为-CO-；
L2为-O-；
R2为甲基、乙基、或丙基；
所述肿瘤细胞选自下组：HepG2、MGC-803。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤细胞为HepG2细胞。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式A化合物为
4.一种体外的、非诊断的特异性识别肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：在体外，将待检测的细胞与肿瘤细胞靶向剂进行接触并孵育，然后测定所述细胞的胞内中所述肿瘤细胞靶向剂的数量；
其中，所述的肿瘤细胞靶向剂是如权利要求1中式A所示的化合物或其药学上可接受的盐；
其中，如果所述细胞的胞内所述肿瘤细胞靶向剂的数量S1显著高于正常细胞内所述肿瘤细胞靶向剂的数量S0，则表示所述细胞为肿瘤细胞；
所述肿瘤细胞选自下组：HepG2、MGC-803。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的“显著高于”指S1/S0≥1.5。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的“显著高于”指S1/S0≥2.0。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的“显著高于”指S1/S0≥3.0。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的测定包括荧光测定。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的荧光检测采用EFEE458nm激发光，并在558nm下检测荧光。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为血液样品中的细胞。
11.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为体液样品中的细胞。
12.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为尿液样品中的细胞。
13.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为呕吐物中的细胞。
14.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为胃液中的细胞。
15.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待检测的细胞为排泄物中的细胞。
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