CN112107563B - 一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用 - Google Patents

一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用，涉及生物医学技术领域。本发明所述化合物包括β‑石竹烯和/或石竹烯氧化物，所述化合物能够显著抑制不同物种TRPM8配体门控型离子通道的冷和薄荷醇激活。β‑石竹烯和石竹烯氧化物作用于包括人类在内的其他物种的TRPM8受体，在一定时间内会钝化动物对外界寒冷的感应。综上所述，β‑石竹烯和石竹烯氧化物增强了大、小鼠等物种对寒冷的抵抗力，可以作为资源开发成一种潜在的冷保护剂或护肤品，应用于人类和其它动物抵御寒冷。其次，β‑石竹烯和石竹烯氧化物靶向作用于受体TRPM8，可以应用于相关离子通道病的研究及其作为潜在治疗药物。

Description

一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用。
背景技术
β-石竹烯(β-caryophyllene)是一类广泛存在于柠檬、园柚、肉豆蔻、胡椒、覆盆子、黑加仑、肉桂叶油、丁香叶油中的天然双环倍半萜类化合物，具有天然香气，可用于调配和合成各种香料。β-石竹烯的双键容易被氧化，长时间暴露于空气中时会逐步氧化转换为一个更加稳定的氧化产物，即石竹烯氧化物(Caryophyllene oxide)。
β-石竹烯及石竹烯氧化物广泛存在于自然界中，自由放养的家畜在野外能够通过摄食富集这些化合物。早期研究发现的野生大熊猫HMR行为，即在冬季寒冷季节，野生大熊猫会对马粪非常感兴趣，表现出嗅闻、在马粪上打滚并往身上涂抹马粪等一系列行为。结合气象数据分析发现，大熊猫HMR行为的发生频次及持续时间均与气温变化相关，在气温寒冷时大熊猫HMR的频次和持续时间都显著增加。上述行为观察和实验结果均表明，大熊猫的HMR行为与气温相关，如在寒冷条件下发生频次增加。如何对HMR行为的机理进行研究，并对此进行利用，现已成为一个全新的研究课题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用，提供所述化合物在生物体内的作用靶点、作用机制、在大、小鼠上抵御寒冷的效果及其在不同生物类群中的抗寒普适性，可作为资源开发成一种潜在的冷保护剂或护肤品，应用于人类和其它动物抵御寒冷。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种影响人和动物对冷感知的化合物，所述化合物包括β-石竹烯和/或石竹烯氧化物。
本发明还提供了所述化合物在提高人和动物对寒冷抵抗力中的应用。
本发明还提供了一种冷保护剂，所述冷保护剂的有效成分包括所述化合物。
本发明还提供了所述冷保护剂在抵御寒冷中的应用。
本发明还提供了一种防寒护肤品，所述护肤品的有效成分包括所述化合物。
本发明还提供了一种TRPM8离子通道抑制剂，所述离子通道抑制剂的有效成分包括所述化合物。
本发明还提供了所述离子通道抑制剂在制备治疗TRPM8离子通道相关疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗TRPM8离子通道相关疾病的药物，所述药物的有效成分包括所述化合物或所述离子通道抑制剂。
本发明提供了一种影响人和动物对冷感知的化合物，均为广泛存在于自然界各种植物中的天然双环倍半萜类化合物，尤其是β-石竹烯是用于调配香料的食用香精，其作为抵御寒冷的新型冷保护剂对人体无副作用。本发明所述化合物能够显著抑制不同物种TRPM8(Transient receptor potential melastatin 8)配体门控型离子通道的冷和薄荷醇激活。电生理实验表明β-石竹烯和石竹烯氧化物作用于包括人类在内的其他物种的TRPM8受体。TRPM8作为动物皮肤表面的重要冷觉感受器被抑制，在一定时间内会钝化动物对外界寒冷的感应。通过在模式动物大、小鼠的实验表明，涂抹β-石竹烯或石竹烯氧化物可以增强小鼠对冷板的耐受能力，在寒冷条件下不需聚群取暖，同时注射Icilin和石竹烯氧化物能抑制Icilin诱导的大鼠颤抖行为和小鼠跳跃行为，明显增强大、小鼠对寒冷的抵抗力。综上所述，β-石竹烯和石竹烯氧化物增强了大、小鼠等物种对寒冷的抵抗力，可以作为资源开发成一种潜在的冷保护剂或护肤品，应用于人类和其它动物抵御寒冷。其次，β-石竹烯和石竹烯氧化物靶向作用于受体TRPM8，可以应用于相关离子通道病的研究及其作为潜在治疗药物。
附图说明
图1为β-石竹烯和石竹烯氧化物对TRPM8的影响，其中A表示β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制gpTRPM8薄荷醇激活情况；B表示石竹烯氧化物抑制gpTRPM8的冷激活全细胞记录；
图2为β-石竹烯和石竹烯氧化物与其它温度相关受体的靶向作用情况；
图3为gpTRPM8的模拟结构(A)及其β-石竹烯和石竹烯氧化物的作用位点(B)；
图4为β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制不同物种TRPM8的激活及其已验证物种的系统发育关系；其中A为已验证物种的系统发育关系，B为β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制不同类群代表性物种TRPM8的薄荷醇激活的全细胞电流，C为石竹烯氧化物抑制冷诱导不同物种TRPM8受体激活的IC50；
图5为β-石竹烯和石竹烯氧化物对小鼠和大鼠抵御寒冷的效果，其中A为涂抹石竹烯氧化物(100μM)的小鼠比对照组表现出更多跨越冷板的行为，Y轴表示小鼠在5min内跨越冷板和试探次数比，B为涂抹石竹烯氧化物(100μM)的小鼠比对照组在冷板上停留时间更长，Y轴表示5min内小鼠在冷、暖板上停留时间比，C为涂抹生理盐水的正常小鼠在4℃低温下的聚群行为(右)和涂抹石竹烯氧化物(100μM)的小鼠不聚群行为(左)，D为同时注射石竹烯氧化物(100μM/kg)抑制Icilin(1mg/kg)刺激大鼠的颤抖行为，E为同时注射石竹烯氧化物(100μM/kg)抑制Icilin(10mg/kg)刺激小鼠的跳跃行为。
具体实施方式
本发明提供了一种影响人和动物对冷感知的化合物，所述化合物包括β-石竹烯和/或石竹烯氧化物。
在本发明中，β-石竹烯或石竹烯氧化物都能靶向作用于冷感应受体TRPM8，且能够显著抑制TRPM8的冷和薄荷醇激活，从而使得人或动物在寒冷条件下，通过所述化合物辅助进行御寒。本发明中，通过对野生大熊猫HMR行为进行调查，利用GC-MS技术对马粪化合物组成进行分析发现，马粪中含有大量的β-石竹烯和石竹烯氧化物，在对动物园圈养大熊猫进行验证后发现β-石竹烯及石竹烯氧化物是引起大熊猫HMR行为的关键化学物质，因此所述化合物能够影响人和动物对冷的感知，并可用于提高任何动物对寒冷的抵抗力。
本发明还提供了所述化合物在提高人和动物对寒冷抵抗力中的应用。
本发明所述化合物可特异性靶向受体TRPM8，所述TRPM8是一类配体门控型离子通道，具有六个跨膜结构域，并以四聚体形式发挥作用，可被冷和薄荷醇激活，被认为是一种重要的冷感应受体。本发明通过小鼠的冷板实验、聚群实验和跳跃实验验证β-石竹烯和石竹烯氧化物对小鼠的御寒效果；通过大鼠的“湿狗”实验验证β-石竹烯和石竹烯氧化物对大鼠的御寒效果。合成小鼠、大鼠和人等18个不同物种TRPM8质粒，利用膜片钳技术验证β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制从两栖类到哺乳动物等不同类群TRPM8的冷激活，证实β-石竹烯及石竹烯氧化物在不同物种上应用的普适性。
本发明还提供了一种冷保护剂，所述冷保护剂的有效成分包括所述化合物。
本发明对所述冷保护剂的剂型并没有特殊限定，利用本领域的常规剂型即可。本发明优选将所述冷保护剂通过外敷或者注射等方式应用于人类和动物抵御寒冷、短期内克服极端低温、适应高原和极地环境等。
本发明还提供了所述冷保护剂在抵御寒冷中的应用。本发明所述应用优选包括外敷或注射等方式。本发明所述抵御寒冷优选包括短期内克服极端低温、适应高原和极地环境等。
本发明还提供了一种防寒护肤品，所述护肤品的有效成分包括所述化合物。
本发明对所述护肤品的种类并没有特殊限定，能够直接作用于人体即可，可用于人类皮肤防寒。
本发明还提供了一种TRPM8离子通道抑制剂，所述离子通道抑制剂的有效成分包括所述化合物。
本发明在HEK293T细胞系上过表达大熊猫TRPM8受体(gpTRPM8)，通过膜片钳技术发现，β-石竹烯和石竹烯氧化物的作用靶点是TRPM8受体，能够抑制TRPM8受体的冷激活和薄荷醇激活。利用Rosetta分子建模软件对gpTRPM8的分子结构进行模拟。通过对gpTRPM8序列进行点突变，发现突变位点W877A能够影响β-石竹烯和石竹烯氧化物结合，因此所述化合物可抑制TRPM8离子通道。
本发明还提供了所述离子通道抑制剂在制备治疗TRPM8离子通道相关疾病的药物中的应用。本发明所述TRPM8离子通道相关疾病优选包括炎性疼痛、心血管系统疾病及部分肿瘤疾病。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。
本发明还提供了一种治疗TRPM8离子通道相关疾病的药物，所述药物的有效成分包括所述化合物或所述离子通道抑制剂。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
β-石竹烯和石竹烯氧化物与gpTRPM8等温度相关受体靶向作用的电生理实验
根据大熊猫现有参考基因组(ACTA00000000.1)及其预测的蛋白质编码序列合成gpTRPM8(XP_011221623)等相关温度感应受体(Nav 1.6,Nav 1.7,Nav 1.8,Nav 1.9,KCNK9,KCNK10,KCNK18,TRPA1,TRPV1 KCNK2,Kv 1.2和TRPC5)的cDNA序列。所有合成的cDNA都克隆在pEGFPN1质粒载体中。将gpTRPM8等质粒瞬转过表达在HEK293T细胞系上。所有HEK293T细胞系均用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基加入10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，37℃，5％的CO2孵育培养。
倒置显微镜下选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20～25℃条件下进行膜片钳实验。选用WPI 0.86mm薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管为玻璃电极材料，玻璃电极在拉制仪(P-97，Shutter)上经5步拉制而成，玻璃电极热抛光后电极尖端口径为1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃电极内灌细胞内液。玻璃电极初始电阻为1.5～2.5MΩ。待电极与细胞膜之间形成高阻抗的京欧(GΩ)封接后，补电极快电容。然后给予一短而有力的负压，将钳制在电极中的细胞膜迅速打破，再补偿细胞慢电容。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为0mV，细胞稳定10分钟使用适宜的脉冲电压(80/-80mV)开始记录电流。药物使用BiolabRS200进行灌流，药物之间的切换速度为50ms。串联电阻(Rs)在实验过程中始终保持在5～8MΩ的范围之内维持不变，系统串联电阻补偿一般在30～60％之间。实验数据用PatchMaster软件分析，数据的进一步分析使用Igor软件。所有结果均采用平均值(Average)±标准误(SEM)的形式表示，n代表实验的数据个数。
通过灌注预冷溶液来实现冷诱导通道的激活。溶液冷却的方法是将溶液池埋入冰块中，然后通过一条单独的管道灌注。移液管放置在离管出口约1mm的地方。采用TA-29微型珠式热敏电阻(HarvardApparatus)，以确保实时监测外液温度。温度监测器放置在细胞或细胞膜旁边。热敏电阻的温度读数输入到贴片放大器的模拟输入，并与全电池或单通道电流同步记录。
TRPM8通道内外液：130mM NaCl、3mM HEPES、0.2mM EDTA，用NaOH溶液将pH调至7.4。
钾离子通道内液：120mM KF、20mM NMG(N-methyl-D-glucamine)、10mM HEPES、11mM EGTA、2mM MgATP和0.5mM Li2GTP，用KOH溶液将pH调至7.4。
钾离子通道外液：130mM氯化胆碱、5mM KOH、10mM HEPES、12mM葡萄糖、2mM MgCl2和2mM CaCl2，用KOH溶液将pH调至7.4。
钠离子通道内液：20mM NaCl、135mM CsF、1mM MgCl2、5mM EGTA、10mM葡萄糖和10mM HEPES，用CsOH溶液将pH调至7.4。
钠离子通道外液：130mM NaCl、5mM CsCl、20mM TEA-Cl、1.8mM CaCl2、5mM 4-AP、0.01mM戊酸丙胺的盐酸盐、0.1mM NiCl2、1mM CdCl2和10mM HEPES，用NaOH溶液将pH调至7.4。
结果如图1和图2所示，β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制gpTRPM8通道冷激活和薄荷醇激活，且呈现浓度依赖关系(图1中A，B)，其IC50为2.52±0.17μM(n＝10)；β-石竹烯和石竹烯氧化物与其它温度相关受体(gpTRPM8受体外)的靶向作用情况(图2)，均不能激活或抑制这些受体。
实施例2
gpTRPM8的结构模拟及点突变实验
Ⅰ.gpTRPM8结构模拟
gpTRPM8的建模使用Rosetta分子建模套件版本2016.20构建。以钙结合状态(PDB:6O77)TRPM8的低温显微镜结构为模板。每一轮生成10000个模型。在这些模型中，选取能量最低的前10个模型作为下一轮闭环建模的输入。经过几轮KIC环路建模，前十位模型融合良好。最终选择最低能量模型作为gpTRPM8蛋白复合物的预测结构(图3中A)。
Ⅱ.gpTRPM8点突变
利用点突变实验探究gpTRPM8影响β-石竹烯和石竹烯氧化物的靶向结合位点。本发明中使用的所有突变gpTRPM8通道均按照说明书使用QuikChange闪电位点定向诱变试剂盒(Agilent)构建。
A.用Phanta Max Super-Fidelity DNAPloymerase对目标质粒进行扩增
1、将1μl模板DNA序列、8.5μl去离子水、2μl 2×Max缓冲液、0.5μl dNTP混合物、1μl 5’PCR引物、1μl 3’PCR引物以及0.5μl DNA聚合酶离心管进行反应。
突变5’引物(SEQ ID NO.1)：5‘-GTTCGCCGTGGCGATGGTGGCCTTCGGCGTGGCCAGAC-3’；
突变3’引物(SEQ ID NO.2)5‘-AGGCCACCATCGCCACGGCGAACAGGAACAGGAAGAAG-3’。
2、在PCR仪中按以下程序扩增：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸9min，30个循环；72℃延伸5min。
3、PCR扩增产物Dpnl消化：25μl PCR扩增产物，1μl Dpnl，37℃恒温反应5min。
4、重组反应：吸取2μl Dpnl消化产物，2μl CEⅡ缓冲液，1μl ExnaseⅡ和5μl去离子水，37℃恒温反应30min后，冰水浴冷却5min。
B.酶切产物转化、涂板和克隆鉴定
1.取1μl上述步骤4中重组反应的冷却反应液，加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。
2.42℃热激90s后，再在冰中放置1min。
3.加入37℃温浴过的LB培养基900μl，37℃缓慢振荡培养60min。
4.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16h，形成单菌落。
5.每个LB平皿用5m1 LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
对所有点突变体进行测序，以验证其准确性。对于基于gpTRPM8的W877A单点突变，使用以下引物对突变位点区域进行测序：
测序引物(SEQ ID NO.1)：5‘-GTTCGCCGTGGCGATGGTGGCCTTCGGCGTGGCCAGAC-3’。
检测β-石竹烯和石竹烯氧化物对所有点突变gpTRPM8通道薄荷醇激活的抑制活性，并比较β-石竹烯和石竹烯氧化物在野生型和各点突变通道上的抑制速率(图3中B)，W877位置的氨基酸突变显著减弱β-石竹烯和石竹烯氧化物对gpTRPM8通道薄荷醇激活的抑制。
实施例3
β-石竹烯和石竹烯氧化物在不同类群物种上的普适性
根据NCBI上现有参考基因组，合成人、大鼠和小鼠等18个物种(图4中A)的TRPM8冷感应受体序列(表1)。所有合成的cDNA都克隆在pEGFPN1质粒载体中。将gpTRPM8等质粒瞬转过表达在HEK293T细胞系上。所有HEK293T细胞系均用DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’smedium)培养基加入10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素，37℃，5％的CO2孵育培养。全细胞膜片钳记录表明β-石竹烯和石竹烯氧化物同样能抑制不同物种TRPM8受体的冷激活和薄荷醇激活。β-石竹烯及石竹烯氧化物作为不同物种的TRPM8的抑制剂，可以作为潜在的TRPM8通道疾病的药物和冷保护剂。
表1 18个物种的TRPM8冷感应受体序列信息
Figure BDA0002730133790000081
Figure BDA0002730133790000091
图4中显示了不同物种TRPM8的系统发育关系(图4中A)；β-石竹烯和石竹烯氧化物抑制不同物种TRPM8通道冷激活和薄荷醇激活，且呈现浓度依赖关系(图4中B和C)。
实施例4
β-石竹烯和石竹烯氧化物抵御寒冷的功能
Ⅰ.β-石竹烯和石竹烯氧化物辅助小鼠抵御寒冷
1.小鼠冷板实验：成年雄性C57BL/6J小鼠60只(23～25g)，其中30只在小鼠足部涂抹100μM的β-石竹烯或石竹烯氧化物溶液，对照组(30只)涂抹生理盐水。冷板设置15℃，暖板为28℃。与预期结果相同，涂抹生理盐水的正常小鼠偏好停留在28℃的暖板上，而经过涂抹β-石竹烯或石竹烯氧化物溶液处理的小鼠则对温度没有选择性，无论是穿越冷板的次数，还是在冷板上停留的时间都显著高于对照组(图5A和B)，证明涂抹β-石竹烯和石竹烯氧化物可以成功抑制小鼠皮肤表面的TRPM8受体冷激活，助小鼠抵御寒冷。
2.冷诱导聚群行为实验：成年雄性C57BL/6J小鼠20只(23～25g)，在小鼠全身毛发上涂抹100μM的β-石竹烯或石竹烯氧化物溶液，每5只合为一笼。对照组(20只)涂抹生理盐水。将小鼠放置在4℃冷室内，正常供应食物和水，红外相机24小时监测小鼠行为。β-石竹烯或石竹烯氧化物涂抹的小鼠在低温环境小各自分开自由活动，而对照组则表现出畏寒、聚集取暖的行为(图5中C)。
3.小鼠跳跃(逃跑)行为实验：Icilin是TRPM8的激动剂，小鼠腹腔注射后会产生跳跃(逃跑)行为。成年雄性C57BL/6J小鼠40只(23～25g)，以正常注射200mM Icilin的小鼠为对照组(20只)，在实验组(20只)小鼠中腹腔注射200mM Icilin和200mM石竹烯氧化物。与预期相似，腹腔同时注射石竹烯氧化物能很好的抑制小鼠的跳跃(逃跑)行为(图5中D)。
Ⅱ.β-石竹烯和石竹烯氧化物辅助大鼠抵御寒冷
大鼠“湿狗”实验：Icilin是TRPM8的激动剂，大鼠腹腔注射后会产生类似狗从水中起来时的抖毛(颤抖)行为。成年雌性大鼠20只(250g左右)，以正常注射200mM Icilin的小鼠为对照组(10只)，在实验组(10只)小鼠中腹腔注射200mM Icilin和200mM石竹烯氧化物。与预期相似，腹腔同时注射石竹烯氧化物能很好的抑制大鼠的颤抖行为(图5中E)。
上述大鼠、小鼠相关行为学实验表明，通过给动物涂抹或者注射生理浓度的β-石竹烯或石竹烯氧化物，可以帮助动物抵御寒冷。β-石竹烯和石竹烯氧化物增强了大、小鼠等物种对寒冷的抵抗力，可以作为资源开发成一种潜在的冷保护剂或护肤品，应用于人类和其它动物抵御寒冷。其次，β-石竹烯和石竹烯氧化物靶向作用于受体TRPM8，可以应用于相关离子通道病的研究及其作为潜在治疗药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种影响人和动物对冷感知的化合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcgccgtg gcgatggtgg ccttcggcgt ggccagac 38
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggccaccat cgccacggcg aacaggaaca ggaagaag 38

Claims (1)

1.化合物在制备冷保护剂或防寒护肤品中的应用，其特征在于，所述化合物选自β-石竹烯和/或石竹烯氧化物。
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