CN112089503B - 一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法 - Google Patents

一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法 Download PDF

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Abstract

本发明阐述了一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法，每头母猪每天定点喂食同期发情剂，连续喂食18天后，间隔5天后肌肉注射PG600，再间隔1天后，选取发情正常的个体进行体外克隆胚胎移植。本发明通过同期发情剂和PG600的喂食或注射，为代孕母猪移植克隆胚胎后为其提供了合适的微环境，控制了代孕母猪的发情、排卵与胚胎移植时间的同步性，大大增加了克隆胚胎着床的成功率及代孕母猪怀孕率，从而实现克隆猪批量化成产，为规模化生产克隆猪奠定了基础。

Description

一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法
技术领域
本发明属于诱导发情和克隆胚胎移植领域，具体涉及一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法。
背景技术
体细胞克隆技术在优良家畜品种的扩增繁殖、濒临灭绝品种的保护、转基因动物生产、动物疾病模型、器官移植等领域具有巨大应用潜力。但克隆效率仍然很低，一般家畜成功率仅为1％～2％(存活子数/克隆胚胎)，对于猪而言，其成功率甚至低于1％，造成胚胎和代孕母猪巨大浪费，同时植入大量胚胎死亡也引起了更多的伦理关注。克隆胚胎移植代孕母猪存在发情时间、排卵时间难以确定、及体外克隆胚胎与代孕母猪子宫着床同步性不一致的等技术难题，这制约着该技术实现批量化生产应用的关键因素。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法，每头母猪每天定点喂食四烯雌酮，连续喂食18天，第23天每头母猪肌肉注射PG600，间隔1天后，选取发情正常的个体进行体外克隆胚胎移植。
具体的，所述同期发情剂的喂食时间为每天上午8点左右，喂食量为40～50mg/110kg体重。
具体的，所述PG600为包括400单位的孕马血清促性腺激素和200单位的人绒毛膜促性腺激素的合成物；所述PG600的注射量为1000～1500IU/110kg体重，注射时间为每天上午8～12点之间。
具体的，克隆胚胎移植过程中，处于1-2细胞期的克隆胚胎移植给1天前表现静立反射且未排卵的代孕母猪，处于2-8细胞期的克隆胚胎移植给2天前表现静立反射且已排卵的代孕母猪。
具体的，克隆胚胎激活时间比代孕母猪排卵时点提前24h。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明通过四烯雌酮和PG600的喂食或注射，为代孕母猪移植克隆胚胎后为其提供了合适的微环境，控制了代孕母猪的发情、排卵与胚胎移植时间的同步性，大大增加了克隆胚胎着床的成功率及代孕母猪怀孕率，从而实现克隆猪批量化成产，为规模化生产克隆猪奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例提供的药物处理后母猪卵巢发育情况；(a)未排卵；(b)即将排卵或刚排卵；(c)排过卵。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的同期发情剂采用四烯雌酮。同期发情剂起到对动物下丘脑-垂体腺体-卵巢复合体的负反馈作用，促性腺激素释放激素脉冲频率降低，促卵泡生成素和黄体生成素分泌处于基础水平，卵泡的生长发育受到抑制。用药停止后，循环再次开始，5-7天后达到发情及排卵高峰期，从第12天到15天回退至黄体期，同期发情剂维持抑制作用让循环停留在15天。当饲喂停止，卵泡在第16天重新被挑选然后开始生长发育。
本发明体提供的PG600具体是400单位的孕马血清促性腺激素和200单位的人绒毛膜促性腺激素的合成物；孕马血清(PMSG)是母马在妊娠后40-120天时从母马身上采的血清，它有如下作用：1、对不发情的母猪催情，不论卵巢上有无卵泡，均可发生效果，因此可用于卵巢发育不全、卵巢机能衰退等。2、在胚胎移植中，用于供体母猪，诱发超数排卵。等人绒毛膜促性腺激素(HCG)：是从孕妇尿或刮宫物中提取的激素，具有如下下作用：1、有促使卵泡成熟、排卵和形成黄体的作用，故认为它是一种和促黄体素作用相似的激素。2、促进睾丸间质分泌睾酮，以刺激雄性生殖器官的发育和生精机能。3、用于动物的催情，但对卵巢静止者无效，只有卵巢上已有小卵泡时才有催情作用。
本发明选用的PG600极大的提高了代孕母猪发情排卵的效率，为成功建立此方法提供了有效支撑。
本发明现有技术的基础独创了一套稳定的技术方案，历时6个月在不同阶段不同部位成功移植了近120头代孕母猪，胚胎数量30000余枚，其中成功怀孕69头，出生并存活克隆仔猪207头，受孕率达57％，平均窝产克隆仔猪3头，处于国内外领先水平，基本实现了克隆猪的批量生产。
1、药物的用量及饲喂方法
本发明所使用的控制药品是购置于法国诗华公司的同期发情剂以及购置英特威公司的PG600，试验选取代孕母猪体重110kg左右，健康的初情后备母猪60头，分成5组，每组12头分别饲喂量为40mg/110kg、45mg/110kg、50mg/110kg的同期发情剂溶液(对比例喂食量为38mg/110kg和52mg/110kg)，饲喂18天，第23天肌肉注射PG600 1000IU/110kg、1200IU/110kg和1500IU/110kg(对比例喂食量800IU/110kg和1500IU/110kg)，第25天手术观察卵巢的发育、排卵情况，确定最佳用药浓度。
表1不同用量的四烯雌酮和PG600处理代孕母猪
Figure BDA0002710076730000041
结合图1的结果表明，采用40～50mg/110kg体重的四烯雌酮饲喂代孕母猪作为同期发情剂，并在间隔5天后注射1000～1500IU/110kg体重的PG600促进发情排卵，其卵巢发育和排卵情况均达到最理想状态。并且，采用本发明提供的同期发情剂在120头代孕母猪中，其同期排卵率(同期排卵母猪数与总共代孕母猪数量的百分比)高达90％以上。
2、体外克隆胚胎移植代孕母猪的关键维度
表2代孕母猪的饲喂及胚胎移植时间管理程序
Figure BDA0002710076730000042
具体的，用10毫升注射器吸取6ml同期发情剂液体，均匀滴洒在饲料中并混合均匀，然后投喂到代孕母猪的料槽中，待母猪吃完后填写饲喂记录。或者采用面包辅助饲喂，可将面包掰开一个切口，然后将药物均匀滴洒在面包内，待吸收完全后再饲喂。试验猪群饲喂周期为18天，从第19天当日停止饲喂同期发情剂，第23天每头代孕母猪分别注射PG6005ml，第25天选取发情表现正常的母猪，进行克隆胚胎移植。
3、克隆胚胎与代孕母猪匹配移植
本发明提供的克隆胚胎与代孕母猪匹配移植的方式有两种：A方式：停药第7天，2-4细胞期胚胎移植到代孕母猪输卵管部位；B方式：停药13天，囊胚移植到代孕母猪子宫内。
另外，本发明克隆胚胎与代孕母猪匹配移植步骤中：
(1)代孕母猪的选取：克隆胚胎激活时间比代孕母猪排卵时点提前24h为宜，而母猪排卵通常发生在“静立反射”后的12～36h，因此要选择“静立反射”与激活时间相同步的代孕母猪；
(2)胚胎移植：体外培养1天的克隆胚胎(1-2细胞期)移植给1天前表现“静立反射”的代孕母猪(未排卵)，体外培养2天的克隆胚胎(2-8细胞期)移植给2天前表现“静立反射”的代孕母猪(已排卵)。
如表3所示，经过6个月对胚胎移植代孕母猪受孕率的统计，结果表明停药第7天，2-4细胞期胚胎移植到输卵管部位(A组)；停药13天，囊胚移植到代孕母猪子宫内(B组)。这两种方式均获得了较高的受孕率，说明采用四烯雌酮和PG600联合控制代孕母猪的发情、排卵与胚胎移植时间形成了很好的同步性，有效契合胚胎着床。
并且由表3可知，实施例1-5的受孕率均显著高于对比例，这说明对比例在代孕母猪的选取和胚胎移植中，克隆胚胎激活时间比代孕母猪“静立反射”的时间不同步，由此导致其受孕率显著降低。由此可知，选用本发明通过四烯雌酮和PG600联合控制代孕母猪发情、及饲喂及胚胎移植时间管理程序，能够显著提高受孕率。
表3胚胎发育时期与妊娠率的比较
Figure BDA0002710076730000061
本发明提供的方法饲喂四烯雌酮的周期为18天，停药第7天进行胚胎移植手术，在第23天肌肉注射PG600，代孕母猪出现发情高峰期在第23至24天比例可达90％以上。此方法为代孕母猪移植克隆胚胎后为其提供了合适的微环境，大大增加了克隆胚胎着床的成功率及代孕母猪怀孕率，从而实现克隆猪批量化成产，为规模化生产克隆猪奠定了基础。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.一种体外克隆胚胎移植代孕母猪的方法，其特征在于，每头母猪每天定点喂食四烯雌酮连续喂食18天，间隔5天后每头母猪肌肉注射PG600，间隔1天后，选取发情正常的个体进行体外克隆胚胎移植；
所述四烯雌酮的喂食时间为每天上午8点左右，喂食量为40~50mg/110kg体重；PG600的注射量为1000~1500IU/110kg体重；
所述PG600为包括400单位的孕马血清促性腺激素和200单位的人绒毛膜促性腺激素的合成物；所述PG600的注射时间为每天上午8~12点之间；
克隆胚胎移植过程中，处于1-2细胞期的克隆胚胎移植给1天前表现静立反射且未排卵的代孕母猪，处于2-8细胞期的克隆胚胎移植给2天前表现静立反射且已排卵的代孕母猪。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，克隆胚胎激活时间比代孕母猪排卵时点提前24 h。
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