CN112088221A - 通过借助于建立多样性指数评定肿瘤变异多样性来进行癌症预后的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种预测结直肠癌患者对疗法的响应的方法，所述方法包括通过分析来自患者样本的循环肿瘤DNA来测量肿瘤遗传异质性。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及癌症患者的基于核酸检测领域。
背景技术
许多癌症患者被诊断为转移期或从早期疾病进展到转移。此时，预后不良，选择有效的治疗疗法至关重要。现代诊断方法依赖于在循环肿瘤DNA(ctDNA)中发现的突变来预测肿瘤耐药性和复发(参见美国专利申请序列号14/774,518和国际申请号PCT/US2015/049838，标题为“循环肿瘤标记物的鉴定和用途”)。例如，耐药突变的突变等位基因频率(AF)的增加表明对特定靶向疗法产生了耐药性。然而，有必要对肿瘤从治疗前到治疗后的演变进行更全面的评估，以便选择合适的疗法。
从分析循环肿瘤DNA中获得的突变数据可能包含无法用本领域现有的工具轻易解释的信息。每个患者在给定时间内都有一系列来自原发性和转移性肿瘤的循环肿瘤变体，这些变体已将DNA释放到循环中。具体突变或突变负荷的存在与否可以用本领域现有的技术检测，但不容易解释以用于患者护理。有必要将这些突变数据解释和转化为临床有用的信息。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供一种鉴定癌症患者预后的方法，所述方法包括以下步骤：从所述患者的无细胞血液样本中分离核酸；在样本中确定表1中列出的每个生物标记物的至少一部分序列；确定所述患者肿瘤变异多样性指数；如果肿瘤变异多样性与相关群体中治疗结果良好的患者的肿瘤变异多样性处于同一分位数，则将患者鉴定为预后良好；或者，如果肿瘤变异多样性与相关群体中治疗结果不良的患者的肿瘤变异多样性处于同一分位数，则将患者鉴定为预后不良。所述肿瘤变异多样性选自Shannon多样性指数、Simpson多样性指数、Inverse Simpson多样性指数和Gini-Simpson多样性指数。在一些实施例中，所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)。所述预后可为总体生存时间(OS)。
在一些实施例中，多样性指数是使用根据公式I确定的群体中种类的比例来确定的。所述Shannon多样性指数可以是根据公式II确定的。所述Simpson多样性指数可以是根据公式III确定的。所述Inverse Simpson多样性指数可以是根据公式IV确定的。所述Gini-Simpson多样性指数可以是根据公式V确定的。
在一些实施例中，所述相关群体是患有相同类型癌症的患者群体。
确定序列的步骤可以包括靶富集、衔接子连接、分子条形码、序列比对、纠错和DNA扩增中的一个或多个。
在另一实施例中，本发明提供一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者的方法，所述方法包括以下步骤：从所述患者的无细胞血液样本中分离核酸；在样本中确定表1中列出的每个生物标记物的至少一部分序列；确定所述患者肿瘤变异多样性指数；如果肿瘤变异多样性低，则确定患者可能对化疗方案有积极响应并施用所述化疗方案；或者如果肿瘤变异多样性高，则确定患者不太可能对化疗方案有积极响应，且不施用所述化疗方案。在一些实施例中，如果肿瘤变异多样性低于相关群体中的肿瘤变异多样性指数的第一三分位数，则所述肿瘤变异多样性低；且如果肿瘤变异多样性等于或高于相关群体中的肿瘤变异多样性指数的第一三分位数，则所述肿瘤变异多样性高。
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在另一实施例中，本发明提供一种设计用于检测患者肿瘤变异多样性的计算机系统，所述计算机系统包括处理器和耦合到所述处理器的非临时计算机可读介质，所述介质包括所述处理器可执行的代码，所述代码用于执行包括以下步骤的方法：分析表1中的生物标记物的测序数据；执行序列比较和突变检测、纠错；根据公式II、公式III、公式IV和公式V中的一个或多个公式确定肿瘤变异多样性指数，以及确定样本中肿瘤变异多样性是否高于或低于预定阈值。
附图说明
图1显示了IV期小细胞肺癌(SCLC)患者的总体生存时间(OS)和Shannon多样性指数之间的关系。
图2显示了IV期小细胞肺癌(SCLC)患者的总体生存时间(OS)和Gini-Simpson多样性指数之间的关系。
图3显示了IV期肺腺癌(非小细胞肺癌，NSCLC)患者的总体生存时间(OS)和Gini-Simpson多样性指数之间的关系。
具体实施方式
定义
下述定义并非限制性的，而仅有助于理解本公开内容。
术语“PFS”在本文中用于描述患者的无进展生存时间。
术语“OS”在本文中用于描述患者的总体生存时间。
术语“循环肿瘤DNA(ctDNA)”在本文中用于描述在人血浆或血清中发现的源于肿瘤的一部分无细胞DNA(cfDNA)。循环肿瘤DNA通过肿瘤特有的突变与非肿瘤DNA区分开。
术语“生物标记物”在本文中用于描述含有与生物学或临床现象有关的信息的核苷酸序列。例如，所述信息可以是所述核苷酸序列的突变状态。所述生物标记物可以是基因(包括编码序列、调节序列、内含子或剪接位点)或基因间区域。所述临床现象可以是患者的样本中存在恶性细胞，例如肿瘤细胞的存在。
术语“多样性指数”在本文中用于描述定量测量，该定量测量反映了数据集中存在多少不同种类，同时考虑到基本实体在这些种类之间的均匀分布。参见Magurran，A.E.，Measuring Biological Diversity，2003Wiley-Blackwell。术语“肿瘤多样性指数”和“肿瘤变异多样性指数”可交替使用，指应用于在肿瘤中发现的突变序列变体(种类)的多样性指数。
本发明是一种基于患者的循环肿瘤DNA(ctDNA)的突变含量来评定肿瘤患者预后的方法。具体地，评估突变含量以确定患者肿瘤细胞的多样性。
循环肿瘤DNA分析结果可包含超出本领域现有的工具所能评估的范围的信息。每个患者在给定时间都有一系列包含原发性肿瘤和转移性肿瘤两者的循环肿瘤变体，这些变体已将DNA释放到循环中。由于肿瘤的不同亚克隆会促进循环肿瘤DNA的产生，因此循环肿瘤变体可能比我们从典型的组织测定中获得的更多。此外，原始肿瘤细胞的亚克隆随着时间的推移而进化，从而改变了患者的血液中可检测到的突变谱。本发明是一种利用生态多样性指数来分析患者肿瘤细胞群的丰富度和丰度，以便向患者的医生提供可操作的结果的新方法。
生态多样性指数先前已被应用于肿瘤。Maley等人(Genetic clonal diversitypredicts progression to esophageal adenocarcinoma.Nat.Genet.38，468-473(2006))，通过对TP53和17号染色体着丝粒的多个组织活检、细胞分类和FISH探针来测量每个样本的遗传差异克隆，证明了Shannon多样性在食管腺癌中的应用。发现Shannon多样性指数排名前四分位数的患者由巴雷特食管癌前病变发展为食管腺癌的几率增加。AlmendroV等人(Inference of tumor evolution during chemotherapy by computationmodeling and in situ analysis of genetic and phenotypic cellulardiversity.Cell Reports.6，514-527(2014))使用了类似的方法来表征乳腺癌的多样性，而Merlo LMF等人(A comprehensive survey of clonal diversity measures inBarrett′s esophagus as biomarkers of progression to esophagealadenocarcinoma.Cancer Prevention Research Nov；3(11)：1388-97(2010))表明Shannon和Simpson在食管腺癌中相似。
本发明是将生态多样性指数应用于在患者的ctDNA中检测到的突变的综合方法。在一些实施例中，所述指数是Shannon指数、Simpson指数或其组合。在一些实施例中，通过应用于患者的ctDNA的下一代测序数据来评估突变。对生态多样性的评估可为患者提供预后和建议的治疗方法。
在一些实施例中，本发明使用生物标记物组通过下一代测序(NGS)来鉴定癌症相关基因中的体细胞突变和突变负荷。在一些实施例中，本发明利用来自患者的血液或血液来源的样本。所述样本可以包括血液的任何部分，例如血清或血浆，其含有无细胞DNA，所述无细胞DNA包括循环肿瘤DNA(cfDNA或ctDNA)。在一些实施例中，在治疗期间的不同时间，例如在手术前后或化疗方案之前、期间和之后，连续获取所述样本。在一些实施例中，肿瘤样本(诸如实体肿瘤样本)用于与血液样本进行比较。固体组织或血液样本可通过保存其中DNA的适当方法收集，包括福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)、新鲜冷冻组织或保存介质中收集的血液组织。
在一些实施例中，本发明利用生物标记物组，包括基因组或突变组或体细胞变异组。与现有的全基因组测序(WGS)和全外显子组测序(WES)等方法相比，使用包含所述基因组一小部分(例如1兆碱基、200千碱基、100千碱基或更少)的生物标记物组的效率有所提高。生物标记物组中评估的突变可以包括单核苷酸变异(SNV)、缺失和插入(in-del)，如果所述单核苷酸变异(SNV)、缺失和插入(in-del)发生在基因的编码区，则它们对应于无义错义突变和移码突变。其他类型的突变包括基因融合和易位。已在例如美国专利申请序列号14/774,518和国际申请号PCT/US2015/049838“循环肿瘤标记物的鉴定和用途”中描述了此类生物标记物组的选择、尺寸和含量。在一些实施例中，本发明包括确定生物标记物组中生物标记物(例如，表1中列出的基因)的序列。在一些实施例中，确定基因的整个序列。在其他实施例中，确定基因的整个编码序列。在其他实施例中，仅确定已知在癌症中经历突变的基因的一部分序列。在其他实施例中，所述生物标记物不与编码序列相关，而是与已知在人类肿瘤中突变的调节序列或未知功能序列相关。
在本发明的上下文中，可以通过本领域已知的任何合适的方法来确定生物标记物的序列。所述合适的方法将具有足够的准确性，例如灵敏度和特异性，以低错误率检测稀有序列。在一些实施例中，测序方法包括纠错步骤，诸如分子条形码的使用、误差定型和误差抑制的其他化学或计算方法，例如参见专利申请“循环肿瘤标记物的鉴定和用途”，如上文所述。所述测序方法可以包括大规模平行测序方法，包括基于阵列的测序(Illumina，SanDiego，Cal.)、基于乳液的测序(ThermoFisher，Waltham，Mass.)、基于光学测量的测序(Pacific BioSciences，Menlo Park，Cal.)、或基于纳米孔的测序(Roche SequencingSolutions，Santa Clara，Cal.)、或牛津纳米孔(Oxford，UK)、或任何其他可用的基于单分子的测序方法。
在一些实施例中，本发明利用生物标记物组，诸如
ctDNA分析试剂盒(Roche Sequencing Solutions，Inc.，Pleasanton，Cal.)，其能够分析患者的组织和血液，以鉴定且定量样本中的肿瘤特异性突变。所述生物标记物组的组成是表1所示的
ctDNA分析试剂盒监测组。
表1.监测生物标记物组的组成
在一些实施例中，使用表1中列出的197个基因组。在一些实施例中，本发明进一步包括基于从临床样本获得的结果改进所述生物标记物组的步骤。在一些实施例中，本发明包括分析来自统计学上大量患者的无细胞DNA中生物标记物的存在与A)RFS、B)TTR(或DFS)、C)OS或上述任何一种对治疗的响应之间的相关性的步骤。显示预测相关性的其他生物标记物将包括在所述生物标记物组中。未显示有统计学意义的预测相关性的生物标记物将被排除在所述生物标记物组之外。
在一些实施例中，确定生物标记物序列的步骤包括靶富集步骤。所述富集可以通过一个或多个靶特异性探针捕获靶序列来实现。样本中的核酸可变性并与单链靶特异性探针接触。所述探针可以包括亲和力捕获部分的配体，以便在形成杂交复合物后，通过提供亲和力捕获部分来捕获它们。在一些实施例中，所述亲和力捕获部分为亲和素或链霉亲和素，且所述配体为生物素。在一些实施例中，亲和力捕获部分与固体支持物结合。如下文进一步详细描述的，所述固体支持物可以包括超顺磁性球形聚合物颗粒，诸如DYNABEADSTM磁珠或磁性玻璃颗粒。
在一些实施例中，确定生物标记物序列的步骤进一步包括衔接子连接步骤，其中衔接子分子与靶核酸连接。所述连接可以是平末端连接，也可以是更有效的粘性末端连接。所述靶核酸可以通过包括链填充的“末端修复”平末端化，即通过DNA聚合酶延伸3’-末端以消除5’-突出端。在一些实施例中，平末端化核酸可以通过向衔接子的3’-端添加单个核苷酸和向靶核酸的3’-端添加单个互补核苷酸(例如，通过DNA聚合酶或末端转移酶)具有粘性。在其他实施例中，所述衔接子和所述靶核酸可以通过使用限制性内切酶消化来获得粘性端(突出端)。所述限制性内切酶识别位点可以是固有的，或者是被工程化植入到序列中。在一些实施例中，可能需要其他酶步骤来完成所述连接。在一些实施例中，多核苷酸激酶可以用于向所述靶核酸分子和衔接子分子添加5’-磷酸盐。在一些实施例中，所述衔接子分子是在体外合成的人工序列。在其他实施例中，所述衔接子分子是在体外合成的天然存在的序列。在其他实施例中，所述衔接子分子是分离的天然存在的分子。
在一些实施例中，确定生物标记物序列的步骤进一步包括扩增所述靶核酸的步骤。所述扩增可以通过指数聚合酶链反应(PCR)、仅对一条链进行线性扩增或利用寡核苷酸引物的任何其他方法。在PCR Strategies(M.A.Innis、D.H.Gelfand和J.J.Sninsky编，1995，Academic Press，San Diego，CA)第14章；PCR Protocols：AGuide to Methods andApplications(M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky和T.J.White编，Academic Press，NY，1990)中描述了多种PCR条件。扩增步骤可能发生在衔接子连接之前或之后。因此，扩增利用通用的引物结合位点，例如通过衔接子连接引入到靶序列中。在其他实施例中，在衔接子连接之前使用基因特异性(靶特异性)引物或引物对，且如本文所述将扩增的靶核酸连接到衔接子上。
在一些实施例中，本发明包括将条形码引入到所述靶核酸中。对单个分子进行测序通常需要分子条形码，诸如例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所述。独特的分子条形码是短人工序列，其通常在体外操作的最初步骤中添加到样本(诸如患者的样本)中的每个分子上。所述条形码标记了分子及其子代。所述独特的分子条形码(UID)有多种用途。条形码可以跟踪样本中的每个单个核酸分子，以评估例如患者的血液中循环肿瘤DNA(ctDNA)分子的存在和数量，以便在不进行活检的情况下检测和监测癌症。参见美国专利申请14/774,518。独特的分子条形码也可用于测序纠错。单个靶分子的整个子代都用相同的条形码标记，并形成条形码家族。不被带条形码家族的所有成员共享的序列变异被作为伪像丢弃而不是真突变。条形码还可以用于位置重复数据删除和靶定量，因为整个家族代表原始样本中的单个分子。参见同上。
在一些实施例中，衔接子包括一个或多个条形码。在其他实施例中，扩增引物(例如，在衔接子连接之前用于扩增的那些引物)包括引物5’-部分的条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于鉴定样本来源的多重样本ID(MID)。所述条形码也可以作为唯一的分子ID(UID)，用于鉴定每个原始分子及其子代。所述条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施例中，将单个条形码用作UID和MID。在一些实施例中，每个条形码包括预定义序列。在其他实施例中，所述条形码包括随机序列。条形码可以是1-20个核苷酸长。
在一些实施例中，确定生物标记物序列的步骤进一步包括序列分析的步骤。所述步骤包括序列比对、纠错和确定序列变异(突变)。在一些实施例中，比对用于从多个序列(例如，具有相同条形码(UID)的多个序列)中确定共有序列。在一些实施例中，条形码(UID)用于从具有相同条形码(UID)的多个序列中确定共有序列。在其他实施例中，使用条形码(UID)来消除伪像，即，存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。源自PCR误差或测序误差的此类伪像可以被消除。
在一些实施例中，通过定量样本中每个条形码(UID)的序列的相对数量，可以定量样本中的每个序列的数量。每个UID代表原始样本中的单个分子，且计数与每个序列变体相关的不同UID可以确定每个序列在原始样本中的比例。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读出的数量。在一些实施例中，为了准确的定量结果，每个UID(“序列深度”)都需要读取相关数量。在一些实施例中，期望的深度是每个UID 5-50次读取。
本发明包括通过确定多样性指数来确定患者样本中的肿瘤变异多样性的步骤，多样性指数是反映数据集中有多少不同种类，并同时考虑到基本实体(诸如单个突变序列)在那些种类之间是如何均匀分布的定量测量。参见Magurran，A.E.，Measuring BiologicalDiversity，2003Wiley-Blackwell。
在一些实施例中，所述多样性指数是表示为(∑ipi ln(pi))的Shannon多样性指数，其中pi为种类i在群体中的比例。种类为患者样本中存在的序列的变体。由于样本中所有种类的比例加起来应为1(即∑ipi＝1)，因此每个pi由每个样本的所有pi之和归一化。评估种类(即变异(突变)序列)数量以确定pi。在一些实施例中，根据公式I，种类数量被评定为VARDEPTH。在其他实施例中，种类数量被评定为另一定量测量，诸如双重深度(即，测量的具有变体的双重分子)或等位基因频率。
在一些实施例中，根据公式I计算pi，即种类i在群体中的比例。
公式I
pi＝VARDEPTHi/SVD
VARDEPTH＝去重复的变体深度或分子深度，即在测序运行中检测到的含有变异(突变)的独特分子的数量；
SVD＝∑i VARDEPTHi代表所有具有检测到的变异(突变)的分子总数
因此，所述Shannon多样性指数表示为公式II。
公式II
Shannon＝-∑i(VARDEPTHi/SVD)ln(VARDEPTHi/SVD)
在一些实施例中，所述多样性指数是表示为∑i pi 2(公式III)的Simpson多样性指数。在一些实施例中，所述多样性指数是表示为1/∑ipi 2(公式IV)的Inverse Simpson指数。在一些实施例中，所述多样性指数是表示为1-∑ipi 2(公式V)的Gini-Simpson指数。在所有实施例中，pi是如上文所述计算的种类i在群体中的比例(例如，根据公式I或使用定量测量替代公式I中使用的VARDEPTH代替VARDEPTH)。
在一些实施例中，根据本发明确定的肿瘤变异多样性被评定为高或低。在一些实施例中，在群体水平上评定肿瘤变异多样性，其中相关群体包括诊断为同一类型癌症的癌症患者。例如，如果所述肿瘤变异多样性在群体中低于分位数，则将其定义为低；如果所述肿瘤变异多样性在群体中等于或高于分位数，则将其定义为高。所述分位数可以是四分位数、三分位数或中位数。在一些实施例中，所述分位数是三分位数，如果所述肿瘤变异多样性在群体中低于第一三分位数，则将其定义为低；如果所述肿瘤变异多样性在群体中等于或高于第一三分位数，则将其定义为高。
在一些实施例中，本发明包括使用从患者的ctDNA获得的肿瘤变异多样性指数来评估患者的癌症状态的步骤。在一些实施例中，所述评估包括鉴定患者可能或不可能对抗癌疗法有响应。在其他实施例中，所述评定包括确定以预测的无进展生存时间(PFS)和总体生存时间(OS)表示的患者的预后。在一些实施例中，对疗法的响应评估为疗法完成后的预测的无进展生存时间(PFS)和总体生存时间(OS)。在一些实施例中，所述疗法是一线化疗或放化疗。所述评估基于如本文所述确定的肿瘤变异多样性。在一些实施例中，评估步骤包括确定患者预后的步骤可以使用如上所述的群体数据来完成。在一些群体中，较低的肿瘤多样性指数表明预后不良，对疗法的响应不佳。对于这类群体，检测肿瘤多样性指数低于设定的分位数(诸如四分位数、三分位数或中位数)，则表明对预后不良和对疗法的响应不佳的评估。在其他群体中，较高的肿瘤多样性指数表明预后良好，对疗法有积极响应。对于这类群体，检测肿瘤多样性指数在设定的分位数(诸如四分位数、三分位数或中位数)或其以上，则表明对预后良好和对疗法的积极响应的评估。
下面列出的实施例显示了肿瘤多样性指数在不同群体(即诊断为不同类型癌症的患者)中的用途。在第一个实施例中，如图1所示，与Shannon多样性指数较高的患者相比，Shannon多样性指数较低的IV期小细胞肺癌(SCLC)患者预后不良。所述指数在基线检查时(化疗前)进行评估。在第一三分位数(≤1.17)中，双重深度变异的患者总体存活较短(危险比＝1.8；95％CI 1-3.3；log-rank p＝0.034；中位存活差＝4.5个月)。
在另一个实施例中，如图2所示，与Gini-Simpson多样性指数较高的患者相比，Gini-Simpson多样性指数较低的IV期小细胞肺癌(SCLC)患者预后不良。所述指数在基线检查时(化疗前)进行评估。在第一三分位数(≤0.64)中，双重深度变异的患者总体存活较短(危险比＝1.8；95％CI 1-3.3；log-rank p＝0.033；中位存活差＝4.5个月)。Gini-Simpson和inverse Simpson值给出了相同的存活分析结果。
在不同群体的一个实施例中，与Gini-Simpson多样性指数较高的患者相比，Gini-Simpson多样性指数较低的IV期肺腺癌(非小细胞肺癌，NSCLC)患者的预后更好(图3)。所述指数在基线检查时(化疗前)进行评估。在第一四分位数(≤0.65)中，双重深度变异的患者在接受化疗治疗6个月后有较长的无进展生存时间。Gini-Simpson和inverse Simpson值给出了相同的存活分析结果。
在一些实施例中，本发明还包括基于由从患者的ctDNA获得的肿瘤变异多样性指数指导的评估，推荐或施用对患者癌症的疗法的步骤。在一些实施例中，本发明包括通过预测疗法完成后的无进展生存时间(PFS)和总体生存时间(OS)(使用如本文所述确定的肿瘤变异多样性)来确定患者是否可能对疗法有响应的步骤，以及如果预测患者会响应，则向患者推荐或施用所述疗法。在一些实施例中，所述疗法是化疗、放化疗或免疫疗法。
本发明的一个方面包括用于检测患者肿瘤变异多样性的系统。所述系统包括处理器和耦合到所述处理器的非临时计算机可读介质，所述介质包括所述处理器可执行的代码，所述代码用于执行包括以下步骤的方法：分析表1中的生物标记物的测序数据；执行序列比较和突变检测、纠错；根据公式II、III、IV或V以及样本中所述肿瘤变异多样性是否高于或低于预定阈值(例如，基于群体的阈值)来确定肿瘤变异多样性指数。在一些实施例中，如果所述肿瘤变异多样性等于或高于所述阈值，则系统将患者分类为具有高肿瘤变异多样性并且可选地输出针对高肿瘤变异多样性的预后或疗法建议。同时，如果所述肿瘤变异多样性低于所述阈值，则系统将患者分类为具有低肿瘤变异多样性并且可选地输出针对低肿瘤变异多样性的预后或疗法建议。
在一些实施例中，计算机可读介质包括数据库，所述数据库包括依赖于患者中肿瘤变异多样性的可用疗法的列表，所述计算机可读介质可以包括一个或多个存储设备。所述计算机可读介质进一步包括程序代码，所述程序代码具有生成列出适当疗法的报告的指令。
所述系统可以包括各种功能方面，诸如服务器，其包括用于处理数字数据的处理器、耦合到用于存储数字数据的处理器的存储器、耦合到用于输入数字数据的处理器的输入数字转换器、存储在存储器中且可由所述处理器访问的程序代码、耦合到所述处理器和存储器的用于显示从数字数据、数据网络和一个或多个信息数据库中获得的信息的显示设备。所述数据库可以包括患者数据、患者样本数据、包括先前治疗数据的临床数据、疗法和治疗剂的列表、患者跟踪数据等。
实施例
实施例1.小细胞肺癌(SCLC)患者的肿瘤变异多样性评估
在本实施例中，从56例IV期小细胞肺癌(SCLC)受试者中获得预处理血浆样本。所述受试者之前用一线化疗或放化疗治疗过。血浆样本用
ctDNA监测试剂盒(Roche Sequencing Solutions，Pleasanton，Cal.)(198千碱基的靶向下一代测序组)进行分析(表1)。所述样本按照制造商的建议进行处理。根据制造商的建议对测序数据进行分析，以确定序列读出中的变体。
将Shannon多样性指数(公式I)和Simpson多样性指数(公式II)应用于变体数据，方法是将每个体细胞变体视为一个种类，且将检测到的具有该突变的双重分子数量视为该种类的丰度。如果样本的血浆变异多样性得分低于同期群的第一三分位数，则将其列为低肿瘤异质性。
结果表明，以Shannon多样性指数评估具有低肿瘤变异多样性的IV期SCLC受试者总体存活较短(危险比＝1.8；95％CI 1-3.3；log-rank p＝0.034；中位存活差＝4.5个月；图1)。同样，以Gini-Simpson指数或inverse Simpson多样性指数评估具有低肿瘤变异多样性的受试者总体存活较短(危险比＝1.8；95％CI 1-3.3；log-rank p＝0.033；中位存活差＝4.5个月；图2)。
实施例2.非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤变异多样性评估
我们还从41例IV期肺腺癌(非小细胞肺癌(NSCLC))前瞻性观察研究中评估了预处理血浆样本的Simpson多样性指数。所述受试者之前用一线化疗或放化疗治疗过。血浆样本用
ctDNA监测试剂盒(Roche Sequencing Solutions，Pleasanton，Cal.)(198千碱基的靶向下一代测序组)进行分析(表1)。所述样本按照制造商的建议进行处理。根据制造商的建议对测序数据进行分析，以确定序列读出中的变体。
将Shannon多样性指数(公式I)和Simpson多样性指数(公式II)应用于所述变体数据。如果样本的血浆变异多样性得分低于训练同期群的第一三分位数，则将其分类为低肿瘤变异多样性。以Gini-Simpson指数或inverse Simpson多样性指数评定具有低肿瘤变异多样性的IV期腺癌受试者在接受化疗治疗6个月后有较长的无进展生存时间(图3)。
尽管已经参考特定实施例详细描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，可以在本发明的范围内进行各种修改。因此，本发明的范围不应受到本文所述的实施例限定，而由下面呈现的权利要求书限定。
Claims (15)
1.一种鉴定癌症患者的预后的方法，其包括以下步骤：
(a)从获自所述患者的无细胞血液样本中分离核酸；
(b)在样本中确定表1中列出的生物标记物中的每种生物标记物的至少一部分序列；
(c)确定所述患者的肿瘤变异多样性指数；
(d)如果肿瘤变异多样性与相关群体中具有良好结果的患者的肿瘤变异多样性处于同一分位数，则将所述患者鉴定为具有良好的预后；或者
(e)如果肿瘤变异多样性与相关群体中具有不良结果的患者的肿瘤变异多样性处于同一分位数，则将所述患者鉴定为具有不良的预后。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤变异多样性选自Shannon多样性指数、Simpson多样性指数、Inverse Simpson多样性指数和Gini-Simpson多样性指数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中多样性指数是使用根据公式I确定的群体中的种类的比例来确定的。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述Shannon多样性指数是根据公式II或III确定的。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述Inverse Simpson多样性指数是根据公式IV确定的。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述Gini-Simpson多样性指数是根据公式V确定的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述相关群体是患有相同类型癌症的患者群体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述序列包括靶富集步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述序列包括衔接子连接步骤。
11.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述序列利用分子条形码。
12.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述序列包括序列比对步骤。
13.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述序列包括纠错步骤。
14.一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(a)从获自所述患者的无细胞血液样本中分离核酸；
(b)在样本中确定表1中列出的生物标记物中的每种生物标记物的至少一部分序列；
(c)确定所述患者的肿瘤变异多样性指数；
(d)如果肿瘤变异多样性低，则将所述患者鉴定为可能对化疗方案有积极响应，并且施用所述化疗方案；或者
(e)如果肿瘤变异多样性高，则将所述患者鉴定为不太可能对所述化疗方案有积极响应，并且不施用所述化疗方案。
15.一种治疗小细胞肺癌(SCLC)患者的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)从获自所述患者的无细胞血液样本中分离核酸；
(b)在样本中确定表1中列出的生物标记物中的每种生物标记物的至少一部分序列；
(c)确定所述患者的肿瘤变异多样性指数；
(d)如果肿瘤变异多样性低，则将所述患者鉴定为可能对化疗方案有积极响应，并且施用所述化疗方案；或者
(e)如果肿瘤变异多样性高，则将所述患者鉴定为不太可能对所述化疗方案有积极响应，并且不施用所述化疗方案。
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