CN112076181A - 右旋氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开右旋氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用，属于医药领域。本发明以小鼠为模型，证实了右旋氯胺酮可以减轻TNF‑α诱导的全身性炎症反应，可以缓解小鼠盲肠损伤及细胞坏死样凋亡，抑制盲肠组织中p‑RIP3及p‑MLKL表达，从而为临床上防治全身性炎症反应综合征提供新的思路与手段。

Description

右旋氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用

技术领域

本发明涉及右旋氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是指各种感染或非感染性的因素作用于机体，引起各种炎症介质过量释放和炎症细胞过度激活而产生的一种病理生理状态，最终可导致多器官功能障碍综合征(multiple organdysfunction syndrome，MODS)。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一种多效性细胞因子，在免疫炎症、细胞存活和细胞死亡中都有很重要的作用。细胞因子TNF-α在炎症反应中有着重要的作用，静脉注射过量TNF-α可使机体受到刺激而过度释放细胞因子使免疫失控，加剧机体的炎症反应，对盲肠、心脏、肾脏和脑等器官造成损害。在细胞因子TNF-α的刺激下，通过激活受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein 1,RIP1)、受体相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein 3,RIP3)、蛋白激酶样结构域蛋白(mixed lineage kinase domain-Like,MLKL)三个核心功能蛋白而诱导细胞坏死性凋亡。细胞因子TNF-α在SIRS中具有潜在的诊断、治疗价值并有可能成为SIRS诊疗的靶目标。

TNF-a通过细胞表面肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNFR)，在某些细胞中，会形成一个RIP1、RIP3、MLKL等组成的多蛋白复合物，即坏死小体，使细胞发生坏死性凋亡(Necroptosis)，进而炎症自我持续放大且产生自我破坏，就会导致过度应激反应。这种坏死样凋亡是TNF-α诱导的SIRS病理的重要原因。目前对其治疗方法主要包括：(1)干预信号通路，(如核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)，活化蛋白1(activator protein1,AP-1)等)制剂；(2)受体靶向制剂；(3)中药单体(人参皂苷，汉黄芩素)等。但由于TNF-α诱导的SIRS损伤机制的研究尚不够深入，故目前TNF-α诱导SIRS的药物针对性较差，部分药物疗效不确定或价格昂贵或毒副作用较大。开发新型更加有效的防治药物成为本领域未来的研究热点。

有研究表明，右旋氯胺酮除强效镇痛作用外，还具有舒张支气管平滑肌，改善肺的顺应性及提高机械通气效果，降低肺损伤。此外，右旋氯胺酮能抑制炎症因子产生，还可以诱导抗炎因子的生成。但是，右旋氯胺酮对TNF-α诱导的SIRS的作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种右旋氯胺酮的新用途，将其用于制备治疗全身性炎症反应药物，解决了诱导SIRS的药物针对性较差，药物治疗不确切或价格昂贵或毒副作用较大的问题。

本发明所述右旋氯胺酮的给药剂量取决于多种因素如性别、年龄、体重、SIRS炎症程度或给药途径并有临床医师判断，其药物的用量分为每公斤体重2.5～10mg。经试验验证，上述剂量均为右旋氯胺酮的有效剂量。

本发明所述右旋氯胺酮可单独使用腹腔内注射给药。

本发明所述右旋氯胺酮作为已知化合物可通过本领域已知方法制备或从市场购买上获得。

本发明所述右旋氯胺酮还可以用于治疗由细胞因子风暴引起的全身性炎症反应，细胞因子风暴可引起全身性炎症反应，如果不加以治疗，可能导致死亡，是H7N9，SARS及新冠病毒肺炎等临床表现凶险的重要因素；细胞因子风暴包括大量促炎细胞因子的释放，如干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素IL-1、IL-6和IL-18等，导致全身炎症反应发生；既往研究显示，通过缓解小鼠盲肠损坏，可减少干扰素(IFN)-γ、白细胞介素IL-6等细胞因子产生，从而缓解全身炎症反应；因此，右旋氯胺酮可以用于制备治疗细胞因子风暴的药物。

本发明的有益效果：本发明所述右旋氯胺酮可以缓解TNF-α诱导的细胞坏死性凋亡，在尾静脉注射TNF-α的小鼠模型中，给予2.5、5、10mg/kg右旋氯胺酮后，可以有效降低模型小鼠的死亡率；给予10mg/kg右旋氯胺酮后，可有效缓解模型动物疾病程度，减轻盲肠组织损伤，降低盲肠组织中RIP3和MLKL磷酸化水平，也进一步表明右旋氯胺酮可以缓解TNF-α诱导的细胞坏死性凋亡，可以用于防治TNF-α诱导的SIRS。

附图说明

图1为盐酸艾司氯胺酮(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)对TNF-α诱导小鼠SIRS模型的动物存活率的的影响。

图2为盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg)对TNF-α诱导小鼠SIRS模型的动物疾病程度评分(Sickness Score)的影响。

图3为盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg)对小鼠盲肠组织损伤的影响。

图4为盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg)对p-RIP3及p-MLKL表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

盐酸艾司氯胺酮的主要成分为右旋氯胺酮，因此，本发明实施例以盐酸艾司氯胺酮为例进行详细说明，实际使用过程中右旋氯胺酮与其他人体可接受的辅料混合制备得到的药物也可以用于本发明。

实施例1

本实施例通过动物试验进一步验证盐酸艾司氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用，具体试验过程如：

1、实验动物和试剂：SPF级雌性雄性C57BL/6小鼠，6-8周，体重18-22g，购自厦门大学实验动物中心。L929细胞系，由厦门大学生命科学学院馈赠。

盐酸艾司氯胺酮注射液购自恒瑞医药。

PI染料、p-RIP3抗体、p-MLKL抗体购自美国Sigma公司。

2、实验方法

将小鼠按随机数字表法分为假手术组，TNF-α组，盐酸艾司氯胺酮2.5mg/kg组、5mg/kg组，10mg/kg组。术前禁食12小时，自由饮水；盐酸艾司氯胺酮(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)腹腔注射，20min后给予TNF-α(14μg/只)，假手术组注射等体积生理盐水，随后进行小鼠存活率观察。将小鼠按随机数字表法分为假手术组，TNF-α组，盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组。术前禁食12小时，自由饮水。盐酸艾司氯胺酮(10mg/kg)腹腔注射，20min后给予TNF-α(14μg/只)，假手术组注射等体积生理盐水，随后进行疾病程度评分(Sickness Score)、盲肠组织损伤检测及p-RIP3、p-MLKL表达检测。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

3、检测指标与方法

3.1小鼠存活率检测

建模后至72h持续观察小鼠存活情况，并进行统计学分析。

3.2小鼠存活率检测

建模后至18h持续观察小鼠疾病程度评分(Sickness Score)情况，并进行统计学分析。

3.3小鼠盲肠组织损伤检测

建模后12h时，观察小鼠盲肠组织损伤情况，并进行统计学分析。

3.4小鼠盲肠组织损伤检测

建模后12h时，利用Western blot染色检测小鼠盲肠组织p-RIP3、p-MLKL表达情况。

4、统计学分析：采用GraphPad Prism 8.0(Graph Pad Software,San DiegoCalifornia USA，www.graphpad.com)进行统计学处理。正态分布计量资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，两组间比较采用t检验，三组及以上比较采用单因素方差分析，重复测量数据采用重复测量方差分析，组间两两比较采用Bonferroni post-hoc检验；非正态分布计量资料以中位数(四分位数)间距表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；生存分析采用Kaplan-Meier检验。

5、实验结果

①结果显示，TNF-α组24h小鼠存活率为0％，盐酸艾司氯胺酮2.5mg/kg组24h小鼠存活率为38％，盐酸艾司氯胺酮5mg/kg组24h小鼠存活率为60％，盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组24h小鼠存活率为80％。结果如图1所述，由图可以看出：盐酸艾司氯胺酮能够显著促进模型动物存活，且呈一定的剂量依赖关系。

②小鼠疾病程度评分(Sickness Score)结果显示，注射TNF-α18h时小鼠疾病程度评分明显增加；而盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组小鼠疾病程度评分明显降低。

③检测盲肠损伤情况，结果如图3所示，由图可以看出：注射TNF-α12h时盲肠损伤评分明显增加；而盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组小鼠盲肠损伤评分明显降低。

④利用Western blotting检测p-RIP3、p-MLKL的表达，结果如图3所示，由图可以看出：与假手术组比较，注射TNF-α12h时小鼠盲肠组织中p-RIP3及p-MLKL表达明显增加，而盐酸艾司氯胺酮10mg/kg组小鼠盲肠组织中p-RIP3及p-MLKL表达明显减少。

众所周知，TNF-α是使细胞发生坏死性凋亡的重要因素，同时也是导致SIRS主要的病理基础；由TNF-α引起的细胞坏死样凋亡可以由膜表面受体，如TNFR1，Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)，Toll样受体3(toll-like receptor 3，TLR3)以及干扰素生成调节受体(interferon production regulator receptors,IFNRs)等起始；这些受体与配体结合后通过下游接头蛋白含有TIR结构域的衔接子诱导干扰素-β(TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β,TRIF)等促进RIP1与RIP3，通过RHIM-RHIM结构域相互作用，使得RIP3发生多聚化和磷酸化。磷酸化的RIP3可以使下游MLKL磷酸化，磷酸化的MLKL向细胞膜的转运导致坏死，并释放损伤相关的分子模式(damage associatedmolecular patterns,DAMPs)。目前用于评判TNF-α诱导的细胞坏死性凋亡，进而发生SIRS的生物标记物包括p-RIP3和p-MLKL等。其含量的高低与细胞发生坏死性凋亡成正相关关系。因此若能降低组织中这些生物标志物水平，可对TNF-α诱导的SIRS损伤起到保护作用。

在TNF-α导致的SIRS病理进程中，盲肠是最先出现损伤的部位，损伤表面为有盲肠远端(封闭端)向近端(盲肠于小肠向链接部位)出现肿胀及出血症状，且盲肠内容物呈现脓状。在TNF-α刺激下，盲肠上皮细胞很快发生了RIP3和MLKL依赖的坏死样凋亡。而这种坏死依赖性的盲肠损伤可能是全身性炎症反应的前期征兆：TNF-α诱导下，盲肠中的RIP3和MLKL被大量激活，导致了盲肠上皮细胞的大量坏死，进而导致了炎症的级联反应严重的炎症反应，引发SIRS。申请人的实验表明TNF-α诱导小鼠建模后，小鼠死亡，盲肠组织会出现出血变红和肿胀的现象，同时盲肠上皮细胞会发生大量的坏死样凋亡；盐酸艾司氯胺酮治疗后有效降低了模型小鼠的死亡率，减轻了小鼠疾病程度，缓解了盲肠组织损伤，抑制了盲肠组织p-RIP3和p-MLKL表达。

综上所述，在尾静脉注射TNF-α小鼠模型中，盐酸艾司氯胺酮可通过抑制p-RIP3和p-MLKL表达，缓解细胞发生坏死性凋亡，从而对感染或非感染时炎症反应造成的组织器官损害发挥保护作用。

根据上述说明书的揭示及教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改；因此，本发明并不局限于以上揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更应当视为本发明的权利要求的保护范围。此外，虽然本发明中使用了某些特定术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制，采用与其相同或相似方法及组分而得到的其他药液及其制备和应用方法均在本发明保护范围内。

Claims (3)

1.右旋氯胺酮在制备治疗全身性炎症反应药物中的应用。

2.右旋氯胺酮在制备治疗由细胞因子风暴引起的全身性炎症反应药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述右旋氯胺酮的用量为每公斤体重2.5～10mg。

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