CN112057624B - Larp7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用 - Google Patents

Larp7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种LARP7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用。本发明首次证明提高LARP7蛋白水平可以防止和治疗的动脉粥样硬化、心衰心脏以及衰老。通过以LARP7为靶点的化学以及基因治疗药物的技术特征可以提高LARP7的动脉粥样硬化、心衰心脏以及衰老组织的表达水平，从而达到预防治疗动脉粥样硬化、心衰以及衰老发生和发展的目的。并且，LARP7在心衰、动脉粥样硬化以及衰老组织中表达显著降低，通过检测比较正常组织和心衰、动脉粥样硬化以及衰老组织中LARP7表达水平差异的技术特征，可以达到诊断这些疾病的目的。

Description

LARP7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种LARP7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用，具体涉及一种以LARP7作为靶点在制备诊断和治疗心力衰竭，动脉粥样硬化或衰老疾病药物中的应用。
背景技术
心力衰竭(心衰)是一类复杂的临床综合征，是大多数心血管疾病的终末阶段，具体指心脏无法行使正常的泵血功能以维持血液流量来满足人体需要。临床表现主要有呼吸困难，过度疲劳和运动耐量受限，通常还伴随大量的体液积聚，最明显的是在肺，腹部和下肢。在全球，约有2％的成年人患有心力衰竭，且随着年龄增高，患病率显著上升， 65岁以上的成年人中，患有心衰的比例上升至6％-10％，而根据欧洲心脏病学会从51个国家采集的调查结果来看，在70-80岁的人口中，该病的患病率上升至10-20％。心衰已成为全球关注的公共卫生问题，影响着全球约2600万人。在我国，有3000万人患有心衰。然而，随着我国人口的老龄化的加速，未来将会有越来越多的尤其是患有慢性病 (如患有肥胖症，糖尿病和高血压)的病人有发展为心力衰竭的风险。
急慢性心衰的治疗主要以对症治疗为主，主要包括以下这几类药物：第一是利尿剂如呋噻米，氢氯噻嗪以及阿米洛利等，可以清除水钠储溜，有效缓解心衰患者的呼吸困难及水总，改善运动耐量。但易导致血容量不足，低血压，肾功能恶化以及电解质紊乱风险。第二类常用药物是肾素-血管紧张素系统抑制剂。主要包括ACEI抑制剂卡托普利，依那普利，缬沙坦等，可以降低HFrEF患者的住院风险和死亡率，改善症状和运动能力。但易引起肾功能恶化，低血压以及高钾血症等。第三类药物是β受体阻滞剂(琥珀酸美托洛尔、比索洛尔及卡维地洛)，能改善症状和生活质量，降低死亡、住院、猝死但可能回导致液体储留，心衰恶化，心动过缓和房室传导阻滞以及低血压等不良症状。以上叙述可以看出现有针对心衰的药物只是对症治疗，不能从心肌本身疾病出发缓解心肌的损伤和功能，不能最终阻止心衰的恶化，从而导致心衰病人五年死亡率为50％左右，比大多数癌症的死亡率都高。
心血管疾病是一类由于高血脂症、动脉粥样硬化、高血压等众多因素导致的全身性或系统性血管病变。全球每年死于心血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。因此心血管疾病已经成为全世界范围内的重大公共卫生问题。据2015年中国心血管报告指出，心血管类疾病在我国各类疾病死亡率位居第一名，其在农村和城市的比例分别为44.6％和42.51％，并且随着经济发展、饮食结构改变以及人口老龄化加剧，心血管疾病患病率显著提高。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础，主要为人体内脂质代谢异常导致动脉血管内膜发生炎症性病变，加速动脉内膜脂质沉积，粥样斑块不断扩大，造成管腔狭窄。粥样斑块一旦破裂，即导致血栓形成和血管堵塞，引发心肌梗死、卒中等急性致死心脑血管事件发生，但是大多数患者在此之前没有任何症状。动脉粥样硬化也是导致心衰的重要原因。
目前临床上干预动脉粥样硬化的药物主要包含以下几类药物：第一是调节血脂类药物，其中最著名的是他汀类药物(洛伐他汀，普伐他汀，辛伐他汀，氟伐他汀等)。它们具有抑制血管内皮的炎症反应作用。炎症消退导致脂质含量降低，并增加纤维帽厚度，从而使斑块更为稳定；第二类是抗氧化剂类药物，例如普罗布考，主要抑制低密度脂蛋白的氧化过程。第三类是多烯脂肪酸类药物，主要抑制肝脏脂质和脂蛋白合成以及吸收。影响动脉粥样硬化形成的因素有许多，例如炎症反应、内皮细胞损伤、氧化自由基损伤、平滑肌细胞增殖和迁移、细胞内及血管内膜下钙离子沉积、血小板黏附和聚集等。但是目前所有药物作用途径比较单一，并不能取得较好的临床效果，即使是被广泛应用的他汀类药物。此外，虽然经皮冠脉支架植入术及冠脉搭桥术可以对病变血管行再次血运重建，但是无法干预和逆转其病理进程。因此找到新的治疗靶点，有助于弥补现有治疗的局限性，通过联合用药为患者提供精准治疗。
随着人类平均寿命延长，社会老龄化问题日趋严重。衰老本身是一个不可逆转的自然过程，同时伴随着众多衰老相关性疾病发生如心衰，动脉粥样硬化，糖尿病、癌症和神经退行性变。目前通过限制热量摄入可以显著延长一些生物体包括酵母、小鼠甚至是一些灵长类的寿命，而这一过程与Sir2组蛋白去乙酰化酶及其哺乳动物同源蛋白 SIRT1的蛋白水平及活性上升密切相关。SIRT1是一种以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 为底物的第三类去乙酰化酶，与衰老相关性疾病例如癌症、阿尔兹海默症、心血管疾病以及2型糖尿病等密切相关，在大脑中过表达SIRT1可延长小鼠寿命，因此SIRT1成为一个热门的衰老及相关疾病药物靶点的候选蛋白，而如何提高SIRT1活性成为药物研发中的关键。
LARP7是一种能够与7SK RNA相互结合的La核糖核蛋白结构域家族成员。LARP7 与7SK RNA以及MEPCE一起维持7SK核糖核蛋白复合体(7SK RNP)的完整性。LARP7 是与遗传疾病相关的基因，在患有侏儒症和Alazmi综合征的患者中均有发现LARP7的功能缺失。除遗传疾病之外，已有研究也表明LARP7与肿瘤发生相关，LARP7通过调控 EMT途径抑制乳腺癌的发生，表达下调后促进乳腺癌EMT、侵袭以及转移；我们最近的工作还发现LARP7在乳腺癌肿瘤中表达升高，可以促进肿瘤生长，抑制DNA损伤修复，提高化疗药物的敏感性。关于LARP7在心衰、动脉粥样硬化以及衰老相关疾病中功能的研究仍然匮乏，LARP7对这些疾病的保护和治疗作用还未见报道。
发明内容
本发明提供了一种LARP7在心衰、动脉粥样硬化或衰老诊疗药物中的应用。本发明首次发现LARP7在患有DCM病人心脏以及在食蟹猴和小鼠的梗死心脏中LARP7蛋白水平降低。在小鼠全身以及心肌细胞中敲除LARP7可以导致心脏发育不良以及心衰。另外，本发明发现在冠状动脉左前降支结扎诱导的小鼠急性心肌梗死模型中利用腺相关病毒过表达LARP7基因，心衰发生进程明显减缓。这揭示了LARP7保护心衰发生的新机制，可用于心衰诊断和治疗相关试剂盒和药物的开发。
本发明提供了一种LARP7在制备诊断和治疗心力衰竭，动脉粥样硬化或衰老疾病药物中的应用。本发明首次发现衰老小鼠和细胞中LARP7蛋白表达降低。我们通过大量生化试验发现LARP7是尚未发现的SIRT去乙酰化酶特异性激动蛋白分子。LAPR7在衰老和动脉粥样硬化中显著降低。LARP7降低影响了SIRT1酶活性，促进衰老和动脉粥样硬化的发生。相反，恢复LARP7则抑制衰老和动脉粥样硬化的发生。相关发现可以用于动脉粥样硬化以及衰老相关疾病的诊断试剂和以及药物的开发。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种以LARP7作为靶点在制备治疗心衰、动脉粥样硬化或衰老相关疾病药物中的用途。
进一步的，所述药物是以LARP7基因作为靶点基因。
进一步的，所述药物是上调LARP7基因表达水平的小分子化学药物、蛋白或基因药物。
进一步的，所述药物是控制LARP7基因和蛋白表达水平的小分子化学药物。优选为上调LARP7基因和蛋白表达水平的小分子化学药物。
进一步的，所述药物是野生型或功能优化型LARP7蛋白。
进一步的，所述药物是用于表达野生型或功能优化型LARP7蛋白的DNA、RNA、质粒、病毒或纳米颗粒。
因此，本发明还提供了一种上调LARP7基因表达水平的基因/化学药物在制备治疗衰老等相关疾病药物中的用途。尤其是上调LARP7基因表达水平的基因药物。
进一步的，所述心衰是急慢性缺血性心衰、自发性心衰(包括自发性扩张性心肌病，先天性心脏病伴发心衰)以及外源性感染导致的心衰。
进一步的，所述动脉粥样硬化是指冠状动脉、主动脉以及外周动脉的粥样硬化。
进一步的，所述衰老相关疾病是指神经退行性病变、糖尿病、皮肤老化和炎症。
进一步的，所述炎症包括溃疡性结肠炎、牛皮癣和感染相关急性炎症。
本发明的第二个技术方案是：LARP7在制备早期检测心衰、动脉粥样硬化或衰老相关疾病试剂盒中的用途。
进一步的，制备以LARP7为靶点的诊断所需抗体、级联免疫试剂盒、免疫组化试剂盒及相关类似产品。
进一步的，所述心衰是急慢性缺血性心衰、自发性心衰(包括自发性扩张性心肌病，先天性心脏病伴发心衰)以及外源性感染导致的心衰。
进一步的，所述动脉粥样硬化是指冠状动脉，主动脉以及外周动脉的粥样硬化
进一步的，所述衰老相关疾病是指神经退行性病变，肿瘤，糖尿病，皮肤老化和炎症。
本发明的第三个技术方案是：LARP7在制备SIRT1激动剂或者抑制剂中的应用
进一步的，所述SIRT1激动剂以LARP7为靶标的增强SIRT1去乙酰化酶活性(可延缓动脉粥样硬化和心衰)的化学试剂，或为野生型或者功能优化型LARP7蛋白，或为表达野生型或者功能优化型LARP7蛋白的RNA、病毒、质粒以及纳米颗粒。
进一步的，所述SIRT1抑制剂为以LARP7为靶标的抑制SIRT1去乙酰化酶活性的化学试剂、蛋白、DNA、RNA、病毒和质粒。
本发明具有如下有益效果：
1)本发明首次证明提高LARP7蛋白水平可以防止和治疗的动脉粥样硬化、心衰心脏以及衰老。通过以LARP7为靶点的化学以及基因治疗药物的技术特征可以提高LARP7 的动脉粥样硬化、心衰心脏以及衰老组织的表达水平，从而达到预防治疗动脉粥样硬化、心衰以及衰老发生和发展的目的。
2)LARP7在心衰、动脉粥样硬化以及衰老组织中表达显著降低，通过检测比较正常组织和心衰、动脉粥样硬化以及衰老组织中LARP7表达水平差异的技术特征，可以达到诊断这些疾病的目的。
3)本发明研究首次证明LARP7是SIRT1的特异性蛋白激动剂。因此通过化学和基因药物提高LARP7的表达水平，或者通过化学药物提高LARP7-SIRT1的结合力，以及别构激活效应的技术特征可以达到促进SIRT1活性，治疗SIRT1活性降低相关疾病如衰老和炎症的目的。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1.蛋白免疫印迹显示LARP7蛋白在心力衰竭患者和心梗动物心脏中表达降低的示意图；其中，a.四名对照者与四名扩张型心肌病(DCM)伴有无法治愈心衰的患者的心脏组织中LARP7表达情况,心衰患者LARP7蛋白水平下降(CTR 0.77vs HF 0.38，p＝0.013)；b-c.心室中LARP7在食蟹猴和小鼠心梗后明显降低；
图2.LARP7心肌特异性敲除小鼠的构建方法及鉴定示意图；其中，a.Larp7 loxP小鼠的构建策略；b.PCR鉴定Larp7 loxP小鼠基因型；c.Western-Blotting发现 LARP7在敲除小鼠中显著降低；mCKO:Myh6-Cre:LARP7f/f心肌特异性敲除小鼠；
图3.显示心肌细胞特异性缺失LARP7的MYH6Cre+；LARP7fl/fl小鼠出现明显心力衰竭的示意图；其中，a.4个月大的小鼠超声心动图M-Mode示意图；b.LARP7缺失的小鼠4个月时的左心室射血分数(EF)和缩短分数(FS)显著下降，左心室舒张期直径(LVDd)和左心室收缩期直径(LVDs)增加；c.d.4个月小鼠心脏的宏观解刨图及HE染色的心脏最大纵截面，LARP7缺失的小鼠心腔明显扩张，室壁变薄； e.RNA-seq显示4个月大野生型与MYH6Cre+；LARP7fl/fl小鼠心脏中心衰标志基因mRNA 表达水平；(f&g)MASSON胶原染色实验显示4个月大的MYH6Cre+；LARP7fl/fl小鼠与野生型相比，心脏胶原容积分数上升，纤维化程度增高(CTR vsLARP7cmko,p<0.0001)；
图4.LARP7通过SIRT1影响心衰的发生示意图；a.Western blot显示LARP7 敲除心脏的SIRT1蛋白表达水平降低；b&c.Seahorse显示LARP7敲除影响线粒体的氧化呼吸能力(Spare inspiration)，而用SIRT1特异性激动剂回补SIRT1去乙酰化酶活性导致恢复部分线粒体的氧化呼吸能力(Spare inspiration)；d..心脏大体解剖注射SIRT1激动剂SRT1720阻止心肌扩张和心衰的发生；e.HE染色显示SRT1720缩小了扩张的心腔和阻止室壁变薄；f.马松染色(Masson’s Trichrome staining)证明SIRT1 1720减缓LARP7敲除心脏的纤维化；
图5.显示急性心梗后过表达LARP7能够保护心功能，延缓心衰的发展示意图；其中，a,AAV9-LARP7病毒表达载体的构建方法；b，AAV9-tdTamato,AAV9-LARP7 病毒的注射策略以及心功能的检测方法；c.Western-blotting检测发现AAV9-LARP7 可以在心梗心脏中过表达LARP7；d.心动超声显示心梗后一个月AAV9-LARP7注射组 FS(d)下降速率减缓，较对照组心功能更好；e.急性心梗后一个月内生存曲线； AAV9-LARP7组较AAV9-CTRL死亡率下降；Kaplan-Meier survival analysis.*: p<0.05；f-g.Masson染色显示AAV9-LARP7组较对照组有更低的纤维化水平；
图6.LARP7是SIRT1去乙酰化酶激动剂，抑制LAPR7导致细胞衰老示意图；其中，a.LARP7在衰老的小鼠肝脏中蛋白表达降低；b-c.衰老标志物SA-β-Gal染色发现敲低LARP7的肺纤维细胞衰老明显增加；d.体外去乙酰化实验显示LARP7可以促进SIRT1去乙酰化酶活性；e.在细胞内敲除LARP7导致SIRT1去乙酰化酶活性降低；f.LARP7促进SIRT1介导的p65去乙酰化；g.LARP7促进SIRT1介导的p53去乙酰化；
图7.LARP7减缓高脂诱导的动脉粥样硬化示意图；其中，A.主动脉整体解刨图显示LARP7敲除促进动脉粥样硬化的转归；实线圈出部分为动脉粥样硬化斑块； ***：p<0.001；B-C.主动脉整体及主动脉根部组织横切样本的油红染色证明主动脉瓣处斑块面积增大，实线圈出部分为油红着色区域；**:p<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
本实施例提供了新的具有应用于评估心衰发生风险潜力的基因标志物LARP7，且为临床治疗心衰，特别是心肌梗死导致的心衰提供了新的靶标。具体发现如下：
1.LARP7在心衰病人的心肌组织中下降
通过Western blot检测我们发现LARP7在临床上患有扩张型心肌病并伴有心衰病人的心肌组织样本中较未患有心衰的心肌样本表达下降。(图1a,CTR 0.77vs HF 0.38)。另外我们在小鼠和食蟹猴动物模型中发现心肌中LARP7也明显下降(图1b&c)。
2.构建LARP7心脏特异的敲除小鼠
我们和上海南方模式生物科技股份有限公司合作构建了LARP7 LoxP转基因小鼠(图2a&b)。通过与Myh6-Cre小鼠(The Jackson Laboratory,011038)杂交，在心脏敲除LARP7：Myh6Cre；LARP7f/f(mCKO，图2c)。
3.敲除LARP7导致心力衰竭
该mCKO小鼠在四个月时超声结果显示射血分数(EF)、缩短分数(FS)较正常小鼠(CTR)明显下降(EF：CTR 70.42VS mCKO 44.93,P＝0.00087；FS：CTR 39.72 VS mCKO22.09,P＝0.0016)，而左心室舒张直径(LVDd)和左心室收缩直径(LVDs) 显著上升(LVDd:CTR 3.58VS mCKO 4.03,P＝0.017；LVDs:CTR 2.13VS mKO 3.12, P＝0.0013)(图3a&b)。宏观解剖发现敲除组心脏体积较对照组明显变大(图3c)，石蜡切片的苏木素-伊红染色结果显示心脏变大主要是由心腔扩张导致的，且伴有心肌壁变薄的现象(图3d)。
RNA-Seq显示心衰标记物在LARP7敲除小鼠中发生显著变化(图3e)。心脏中胶原沉积增加，出现明显的纤维化(图3f&g)。
4.LARP7敲低导致SIRT1蛋白和活性降低，回补SIRT1活性避免心衰的发生
我们采用Western blotting检测发现LARP7敲除小鼠心脏中SIRT1蛋白水平下降(图4 a)。Seahorse发现LARP7敲除小鼠线粒体的氧化呼吸能力下降，回补 SIRT1特异性激动剂SRT1720恢复部分线粒体的最大氧化呼吸能力(图4b&c)。心脏大体解刨证明注射30mg/ml SRT1720可以减轻LARP7敲除小鼠的扩张性心肌病(图 4d)。HE染色证明SRT1720注射阻止了心肌扩张(图4e)。马松染色(Masson’s Trichrome staining)证明SIRT11720减缓心肌的纤维化(图4f)。
5.急性心梗后过表达LARP7能够保护心功能，阻止心衰的发生和发展
采用心脏冠状动脉左前降支的结扎小鼠手术模型模拟急性心梗。在结扎手术前一天分别将编码LARP7的腺相关病毒AAV9-LARP7与对照编码红色荧光tdTamato的腺相关病毒AAV9-cTNT-tdTamato经尾静脉注射给小鼠(图5a&b)。对照病毒 AAV9-tdTamato质粒载体是经过addgene(包装(图5a)；包装方法参看相关已发表文献(doi:10.3791/54787；Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts)。AAV9-LARP7病毒是我实验室以AAV9-cTNT-tdTamato为载体，敲除tdTamato基因，插入LARP7基因，然后按照已发表文献的方法自行构建和包装的(图5a)。AAV9-LARP7可以在心脏中上调LARP7的表达(图5c)。
通过连续一个月每周一次的小动物心动超声对其心功能进行记录，四次心超显示过表达组心功能较对照组增强，减缓心衰的发生和发展(EF：1W CTR 32.85VS LARP7oe34.55，2W CTR 28.14VS LARP7oe 33.26,3W CTR 19.55VS LARP7oe 29.15, 4W CTR15.88VS LARP7oe 25.95；FS：1W CTR 18.47VS LARP7oe 19.27，2W CTR 15.30 VS LARP7oe16.37,3W CTR 11.04VS LARP7oe 14.77,4W CTR 7.66VS LARP7oe 12.59) (图5a&b)。记录其生存情况绘制生存曲线,结果显示接受AAV9-LARP7心梗小鼠的生存率较对照组明显提升，截止手术后30天时生存率分别为：Sham 95.24％, MI+AAV9-tdTamato 45.83％,MI+AAV9-LARP784.21％(图4c)。Masson-Trichrome染色显示，过表达组的心肌梗死面积明显减少，胶原容积分数小于对照组(CTR 0.23 VS LARP7oe 0.15)(图5d&e)。
6.LAPR7是SIRT1去乙酰化酶的特异性激动剂，敲除LARP7降低SIRT1活性导致细胞衰老
LARP7和衰老的关系还有没有研究，我们比较了衰老小鼠和正常小鼠肝脏中LARP7蛋白的表达，发现LARP7在衰老的肝脏组织中表达明显下降(图6a)。采用衰老标志物SA-β-Gal染色发现敲低LARP7的肺纤维细胞衰老明显增加(shFFP
13.58±5.63％vs shLARP7-144.75±1.78％or shLARP7-246.67±11.32％)(图6b&c)。体外去乙酰化实验显示LARP7可以促进SIRT1去乙酰化酶活性(图6d)。相反在体内敲低LARP7导致SIRT1的活性降低(图6e)。而且，LARP7可以促进了SIRT1介导的p65(图6f)和p53(图6f)去乙酰化。P65和p53是主要介导细胞的衰老的分子，LARP7敲除降低了SIRT1去乙酰化酶活性，导致P65和p53乙酰化和转录活性的升高，进而诱导细胞衰老。
7.LARP7减轻APOE敲除小鼠(APOEKO)的动脉粥样硬化的产生
LARP7在动脉粥样硬化斑块中表达明显降低，SIRT1活性降低(图7A)。SIRT1 活性降低和衰老都可以促进动脉粥样硬化的发生，未验证LARP7是否可以阻止或者减缓动脉粥样硬化的发生，我们将APOE敲除小鼠(购自上海南方模式动物中心， NM-KO-190565)和LARP7诱导型全身敲除小鼠(UbcCreERT2；LARP7f/f：LARP7KO；UbcCreERT2购自Jackson lab,008085)进行杂交(APOEKO；LARP7KO)获得双敲除小鼠，然后给予高脂喂养3个月，结果显示APOE；LARP7双敲除小鼠主动脉整体(APOEKO；LARP7WT 41.62±5.5％vs APOEKO；LARP7KO59.49±6.10，图7B)和动脉瓣膜处(APOEKO；LARP7WT 32.35±1.74％vs APOEKO；LARP7KO50.81±2.7％，图7C)的斑块形成明显增加。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明实质内容。

Claims (3)

1.一种以LARP7基因作为靶点基因的药物在制备治疗心衰药物中的用途，所述药物是编码LARP7的腺相关病毒AAV9-LARP7。
2.一种以LARP7基因为靶点的诊断所需抗体在制备早期检测心衰试剂盒中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括级联免疫试剂盒、免疫组化试剂盒。
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