CN112037853A - 筛选能够表达期望产物细胞株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法，包括：将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；对所述细胞芯片上的期望产物进行定量检测；分离所述期望产物的表达量高的单克隆。该方法可缩短细胞株构建时间、节约成本、减少工作量。

Description

筛选能够表达期望产物细胞株的方法

相关申请

本申请要求2019年10月30日申请的，申请号为201911044066X，名称为“筛选能够表达期望产物细胞株的方法”的中国专利申请的优先权，在此将其全文引入作为参考。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法。

背景技术

从细胞群中分离能够表达特定分泌物的细胞株的方法是生物领域的常见需求，但现有技术中分离方法常常存在低效率的问题。这样的特定分泌物典型的为蛋白，常常是外源蛋白表达，或者内源异质性的蛋白质，例如抗体。以哺乳动物表达系统为例，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell，CHO细胞)表达系统是重组蛋白、抗体等药物生产的最主要宿主细胞。由于哺乳动物细胞生长慢、培养基成分复杂、生长条件苛刻，筛选表达目标蛋白的稳定和高表达细胞株耗时耗力、细胞培养成本高、技术复杂等因素，致使利用哺乳动物细胞生产蛋白质类药物的成本较高、周期长。快速筛选稳定、高产量的工程细胞株，是目前蛋白类药物研究和生产的主要瓶颈之一。

目前筛选细胞株的方法是利用单个筛选标记来筛选含有目标基因的稳定细胞株，单个筛选标记通常为抗性标记，如二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase，DHFR)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)、各种抗生素抗性基因等。具体来说，将筛选标记基因和目的基因构建到同一载体中，然后转染到宿主细胞中，从而实现两者的共同表达。但往往标记基因和目标基因表达水平相近，有可能筛选到的是只表达标记基因、而不表达目标基因的细胞。因而需要在成千上万个细胞中筛选到稳定的、高表达单克隆细胞。

传统细胞筛选方法步骤较为繁琐，首先需要将目的蛋白表达载体转染至宿主细胞，随后通过筛选药物加压，稳定细胞池形成；采用有限稀释法将稳定细胞池细胞接种到96孔或更多孔细胞培养板，并形成单克隆细胞群，随后进行上清蛋白表达量测定；高表达孔板中的细胞扩大培养至更大的孔板(如24孔板)；24孔板细胞扩至6孔细胞板；将6孔细胞板中细胞扩增至摇瓶中进行悬浮培养；进一步在摇瓶中评估不同细胞克隆的表达量；对摇瓶中表达量高的几个细胞株进一步进行亚克隆，将细胞再次用有限稀释法接种至96孔细胞培养板中；对亚克隆细胞进行新一轮表达量评估，过程同上；最终对筛选的细胞株进行连续传代，评估细胞株表达蛋白水平的稳定性，并根据细胞株表达目的蛋白的水平及细胞表现的稳定性确立候选细胞株。

以上筛选方法往往耗时6个月以上，需要大量人力物力支持。其中有限稀释法获得单细胞克隆，需要经过至少两轮的亚克隆，每一轮亚克隆需要将近3个月的时间；每个克隆需要从96孔或更多孔板扩增至24孔板，并进行表达量评估，有时克隆多达数千个，工作量巨大；将细胞从24孔中进一步扩大至摇瓶培养，摇瓶数量往往达到数百个，需要大量人力成本，且消耗大量的试剂耗材。无法满足大规模产业化生产的需求。

发明内容

本发明涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法，包括：

a)将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；

所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；

b)对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；

当所述期望产物为分泌性物质或附着于细胞膜表面的物质时，所述方法还包括c1和d：当所述期望产物为胞浆非分泌性物质时，所述方法还包括c2和d：

c1)将固相支持物与所述细胞芯片的细胞孔面接触，以使得所述固相支持物上偶联的具有与所述期望产物结合能力的分子捕获所述期望产物形成缀合物；

对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

c2)所述期望产物具有用于显示信号强度的指示剂，对所述指示剂进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

d)分离所述期望产物的表达量高的单克隆。

在本发明中，步骤b)与c)(c1或c2)无先后顺序。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)减少细胞株构建工作量

传统的96孔甚至384孔板两轮筛选单克隆的方法往往要处理成百上千的细胞板，随后利用传统的ELISA方法进行上清蛋白浓度的确定，耗时耗力。本发明利用细胞芯片一次性高通量分离单细胞，并一次性确定所有单细胞的蛋白表达量，大大节省了工作量。

2)缩短细胞株构建时间、节约成本

传统方法构建细胞株需要经过多轮的亚克隆步骤，每增加一轮亚克隆筛选，需要增加2～3个月的时间。而本发明通过细胞芯片方法，将第一轮筛选时间缩短至1天以内，大大节省了时间，节约了人力、物力成本，提高了效率。

3)扩大细胞株筛选范围

以往的细胞株筛选方法利用孔板结合有限稀释法将单细胞分散至培养孔里，但通量较低，几十块96孔板处理的克隆不过几千个，操作时只是将细胞池中的极少数细胞进行筛选，剩余的大多数细胞被丢弃。本发明利用细胞芯片技术，一次操作可以分离多至几十万个细胞克隆，从而大大扩展了细胞筛选的范围，增加了筛选到更高表达量细胞的几率。

4)增强检测的精度

当期望产物为分泌性物质时，由于固相支持物与所述期望产物偶联后相对于对期望产物进行了富集，因而可增大检测时的信噪比，使得筛选结果更为准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是一个实施例的一种细胞图像分割方法的流程示意图；

图2是一个实施例的一种细胞图像分割方法的应用环境图；

图3是一个实施例的一种细胞图像分割方法的各步骤图像处理结果图；

图4是一个实施例的一种细胞图像分割方法的图像分割结果图；

图5是一个实施例的一种细胞图像分割方法的链码方法示意图；

图6是一个实施例的一种细胞图像分割方法的距离变换结果图；

图7是一个实施例的一种细胞图像分割方法的分水岭算法示意图；

图8是一个实施例的一种细胞图像分割装置的结构框图；

图9是一个实施例的一种计算机设备的内部结构图；

图10是一个实施例所拍摄的细胞芯片图；

图11是一个实施例所拍摄的细胞芯片图，箭头所示为具有荧光信号的细胞；

图12是一个实施例所拍摄的细胞芯片图，箭头所示为具有荧光信号的细胞或其具有荧光信号的分泌物。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种筛选能够表达期望产物细胞株的方法，包括：

a)将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；

所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；

b)对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；

当所述期望产物为分泌性物质或附着于细胞膜表面的物质时，所述方法还包括c1和d：当所述期望产物为胞浆非分泌性物质时，所述方法还包括c2和d：

c1)将固相支持物与所述细胞芯片的细胞孔面接触，以使得所述固相支持物上偶联的具有与所述期望产物结合能力的分子捕获所述期望产物形成缀合物；

对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

c2)所述期望产物具有用于显示信号强度的指示剂，对所述指示剂进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

d)分离所述期望产物的表达量高的单克隆。

传统细胞株筛选步骤，所需时间较长，耗费大量人力物力；本发明所述细胞筛选方法，大大缩短时间，节省大量人工。

在一些实施方式中，本发明包含一步或多步洗涤(或称纯化、富集)和/或封闭的步骤，洗涤的方法可以通过一步或多步离心、震荡、超滤或深层过滤等方法进行洗涤可以在例如上述任一步操作结束后进行，封闭可采用脱脂牛奶、牛血清白蛋白、鲑鱼精子等本领域常用的蛋白、核酸或多肽杂交常用的封闭剂。澄清和封闭的作用通常为去除非特异性结合，以达到更高的信噪比。进一步的，所述分子与所述期望产物的缀合基本不能有交叉反应。

通常的，离心的转速可以为约200g～约14000g，例如500g、1000g、1500g、2000g、3000g、4000g、5000g、6000g、7000g、8000g、9000g、10000g、11000g、12000g、13000g。

在一些实施方式中，所述细胞池经过预处理，例如筛选药物加压处理或者调整细胞的培养条件以尽量去除不能表达期望产物的细胞。所述细胞培养条件可同时改变或调整，也可分先后分别改变或调整，也可以有些培养条件同时改变，有些培养条件单独改变。例如，在一些实施方式中，可同时改变细胞培养液的渗透压、乳酸浓度、氨浓度、pH值、溶氧浓度以及搅拌速度，将细胞进行培养，挑选出适应于改变后的培养条件的高耐受细胞株。

在一些实施方式中，所述预处理用于筛选表达期望产物稳定的细胞，或具有其他优良性状的细胞，例如增殖快，抗逆性/抗药性强，对培养基营养成分要求较低等。

在一些实施方式中，所述方法所采用的起始细胞池是生长状态良好的细胞。在一些实施方式中，所述方法所采用的起始细胞池是处于对数生长期的细胞。在一些实施方式中，所述方法所采用的起始细胞可以是正常的未经上述预处理的细胞，也可以是经过一次或多次预处理的细胞。

在一些实施方式中，筛选的周期可以是1～2天，2～4天，3～4天等。

在一些实施方式中，步骤a)中的稀释方法优选为有限稀释法，以使得所述细胞芯片的单个孔位中更容易产生单克隆。

本发明中所称“细胞”可由细菌、原生动物、真菌、病毒及高等生物/高等动植物提取或扩增得到。细胞可经过体外培养，或者从临床样本(包括血浆、血清、脊液、骨髓、淋巴液、腹水、胸腔积液、口腔液体、皮肤组织，呼吸道、消化道、生殖道、泌尿道，眼泪、唾液、血细胞、干细胞、肿瘤)中直接分离得到，胎儿细胞可来自胚胎(如一个或几个拟胚/胚胎)或母体血液，可来自活体或者死亡生物体。样本包括单细胞悬液、石蜡包埋组织切片、穿刺活检组织。

特别的，本发明所采用的细胞可以为哺乳动物细胞提取或扩增得到。

在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述细胞系是由以下各者所构成的群组中选出：

CHO(例如CHO-S和/或CHO-K1)、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。

期望产物

所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞，所述期望产物为分泌性物质、胞浆非分泌性物质或附着于细胞膜表面的物质。

在一些实施方式中，所述胞浆非分泌性物质选自蛋白质、核酸、多糖。

在一些实施方式中，所述分泌性物质选自蛋白质、核酸、多糖以及外泌体。

在一些实施方式中，所述附着于细胞膜表面的物质选自蛋白质和多糖。

在一些实施方式中，所述蛋白质选自酶、激素、神经递质、血清蛋白以及抗体。

在一些实施方式中，所述期望产物为外源表达蛋白，由表达载体于待筛选的细胞中表达得到。

在一些实施方式中，所述表达载体中包含选择性标记、信号标记以及偶联标记中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述选择性标记选自代谢标记、抗生素标记、抗生素抗性基因、除草剂抗性基因、化合物解毒酶基因、糖类代谢酶选择标记基因。

抗生素抗性基因例如新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、氯霉素磷酸转移酶基因(cat)和链霉素磷酸转移酶基因(spt)。

除草剂抗性基因例如epsps基因、bar基因、gox基因等。

化合物解毒酶基因例如来源于甜菜的碱醛脱氢酶(BADH)基因、谷氨酸-1-半醛转氨酶(GSA-AT)基因等。

糖类代谢酶选择标记基因例如木糖异构酶基因、磷酸甘露糖异构酶基因和核糖醇操纵子。

在一些实施方式中，所述偶联标记能够表达的物质为生物素或其衍生物；其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素以及脱硫生物素中的任一种。

细胞芯片和固相支持物

固相支持物优选为薄膜状的。

在一些实施方式中，固相支持物上透光的。

在一些实施方式中，所述固相载体基本允许可见光穿过。

在一些实施方式中，所述透光是指可见光的穿透率为大于等于10％，或大于等于20％，或大于等于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。

如本文所用的术语“基本”、“基本上”及其变体旨在指出描述的特征等于或近似等于值或描述。例如，“基本上平的”表面旨在表示平的或近似平的表面。此外，如上所定义，“基本上相似”旨在表示两个值相等或近似相等。在一些实施方案中，“基本相似的”可表示彼此约10％内，诸如彼此约5％内或彼此约2％内的值。

在一些实施方式中，所述细胞芯片和所述固相支持物独立地选自玻片、膜式基片、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、PVDF膜、硅片、凝胶以及微孔板中的任意一种。

在一些实施方式中，所述细胞芯片或所述固相支持物被高分子所修饰，或表面涂有高分子膜。

在一些实施方式中，所述高分子选自氨基、醛基、环氧树脂、巯基以及聚糖。

在一些实施方式中，所述高分子膜选自聚乙烯醇薄膜、琼脂糖薄膜以及聚乙烯醇-琼脂糖复合薄。

在一些实施方式中，所述细胞芯片或所述固相支持物还具有聚二甲基硅氧烷、聚乙烯以及聚乙二醇衍生物涂层中的至少一种。

上述，例如，当所述期望产物为分泌性物质时，固相支持物可附着能够特异性结合所述分泌性物质的分子(如抗体)，并形成抗原-抗体缀合物，所述缀合物与所述细胞芯片的位置一一对应，抗体上可以标记用于显示信号强度的指示剂，从而对所述缀合物进行检测，即可判断哪一个细胞孔能生成更多的期望产物。

当所述期望产物为细胞膜表面的物质时，固相支持物可直接抓取细胞，并按照上述方法进行定量检测。

在一些实施方式中，步骤b和c1中对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测的步骤可在扫描芯片时同时进行，即扫描芯片时同时获取步骤b和c1中的信息。固相支持物可以是透光或者透明的，当其于所述细胞芯片的细胞孔面接触时，可覆盖在所述细胞芯片的表面，将二者作为一个整体进行扫描。

在一些实施方式中，步骤b和c2可在扫描芯片时同时进行，即扫描芯片时同时获取步骤b和c2中的信息。

对固相支持物的抗体孵育、对固相支持物上非特异性成分的清洗或者对指示剂的检测都更加方便且准确，相对于直接对细胞芯片操作，大大增加了整体操作的便利性。

在一些实施方式中，步骤c1)中将固相支持物与所述细胞芯片的细胞孔面接触的过程中可采用适当的震荡，或者将所述细胞芯片倒扣于所述固相支持物以促进反应。

用于显示信号强度的指示剂

指示剂可与期望产物共表达(例如融合蛋白)，也可通过标记在能够与期望产物杂交或特异性结合的物质上，间接与期望产物结合进而定量。

在本发明中，“指示剂”、“信号标记”可独立地选自荧光蛋白(基因)、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

当所述“指示剂”、“信号标记”与期望物质融合共表达时，则其通常选自荧光蛋白(基因)(此时期望物质通常为蛋白)；荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。绿色荧光蛋白可以采用常见的GFP，也可以采用经过改造后的GFP基因，例如增强型GFP基因EGFP等；蓝色荧光蛋白可以选自EBFP、Azuritc、TagBFP等；黄色荧光蛋白可以选自EYFP、Ypct、PhiYFP等；橙色荧光蛋白可以选自mKO、mOrange、mBanana等；红色荧光蛋白可以选自TagRFP、mRuby、mCherry、mKatc。

当所述“指示剂”、“信号标记”通过间接与期望产物结合进而定量时(例如上述缀合物中所定义的结合方式)，所述“指示剂”、“信号标记”包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光物质包括上述所定义的荧光蛋白、Alexa 350、Alexa405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。

在一些实施方式中，所述放射性同位素包括¹¹⁰In、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁹⁰Y、⁸⁹Zr、⁹⁴mTc、⁹⁴Tc、⁹⁹mTc、¹²⁰I、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、^154-158Gd、³²P、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁵¹Mn、⁵²mMn、⁵⁵Co、⁷²As、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁸²mRb和⁸³Sr中的任一种。

在一些实施方式中，所述酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。

在本发明中，“期望产物”可以为单独的目标物质，也可以为经过偶联的物质，例如本申请中所提到的目标物质与选择性标记、信号标记以及偶联标记中的一种或多种偶联后所得物质。

特别的，当期望产物为经过偶联的物质时，其偶联的位点优选是不破坏其原有生理活性的。

根据本发明，当所述期望产物为分泌性物质时，缀合物可通过分泌型物质与所述分子直接偶联得到，例如典型的，所述分子为所述分泌型物质的抗体，此时对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测可以选择双抗夹心法；又或者，所述分泌型物质本身即为抗体，则所述分子可以为所述分泌型物质的抗原，此时对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测可以选择双抗原夹心法；在上述检测过程中也可利用另一物种的二抗甚至更多级抗体进行信号放大及显示信号，显示信号的方法可基于荧光物质、放射性物质或者染色方法(例如DAB染色、HE染色、Masson染色)。

当所述期望产物为附着于细胞膜表面的物质时，通常缀合物同时与细胞偶联，二者同时被固定与所述固相支持物上，可通过检测所述细胞上的其他特征物质，或直接通过观察细胞内的荧光强度(此时目标物质与信号标记偶联表达)判断所述期望产物的表达量。

在一些实施方式中，所述缀合物通过以下结合方式中的至少一种结合得到：

生物素或其衍生物/链霉亲和素(streptavidin)，生物素或其衍生物/亲和素(avidin)，生物素或其衍生物/中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)，生物素或其衍生物/抗生物素或其衍生物抗体，半抗原/抗体，抗原/抗体，肽/抗体，受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素和多核苷酸/互补的多核苷酸；其中生物素的衍生物为D-生物素、活化生物素、生物胞素、乙二胺生物素、尸胺生物素以及脱硫生物素中的任一种。

在一些实施方式中，所述缀合物为目标物质与所述分子直接缀合得到。

在一些实施方式中，所述缀合物为与所述目标物质偶联的偶联标记与所述分子缀合得到。

根据本发明的描述，本领域技术人员有能力选择合适的方法对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测。

细胞分割的方法及单克隆细胞的孔的确认

在一些实施方式中，步骤b)具体包括：

对所述细胞芯片进行扫描，获取所述细胞芯片中的细胞于明场和/或暗场下的图像，将所述图像中的细胞切割为单细胞图片，对所述单细胞图片进行分析以确认并记录拥有单克隆细胞的孔。

“暗场”此术语是指利于对所述用于显示信号强度的指示剂进行检测的环境。检测的典型形式包括对含有所述指示剂的微球进行拍摄，并可选的包括统计所述指示剂的有无，计算所述指示剂的信号强度等。上述拍摄的方法可以包括但不限于利用致密颗粒的散射光成像、上转换发光成像、化学发光信号分子成像以及荧光成像。在一些实施方式中，暗场为基本没有可见光的环境。例如当所述指示剂为荧光信号时，暗场可以是基本没有可见光，但具有激发光等环境，从而利于荧光的拍摄并延缓荧光的淬灭。

明场和暗场的拍摄通常在同一视野下进行。

在一些实施方式中，将所述图像中的细胞切割为单细胞图片的方法包括：

将所述明场和/或暗场图像灰度化，读取细胞灰度图像；

对所述细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对所述均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；所述形态学操作包括顶帽操作和梯度操作；

通过边缘检测算法检测所述形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

在其中一个实施例中，所述根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像，包括：

当所述二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算所述粘连细胞中的细胞个数；

根据所述粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点；

根据所述最优极小值点，对所述二值化细胞图像进行距离变换，得到距离变换图像；

使用分水岭算法对所述距离变换图像进行分割，得到所述细胞分割图像。

在其中一个实施例中，所述当所述二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算所述粘连细胞中的细胞个数，包括：

对所述二值化细胞图像的链码起始位置进行标记，得到链码起始标记；

对所述二值化细胞图像中链码方向发生改变的位置进行标记，得到链码变化标记；

对所述二值化细胞图像的链码结尾位置进行标记，得到链码结尾标记；

根据所述链码起始标记、所述链码变化标记和所述链码结尾标记，计算所述粘连细胞中的细胞个数。

在其中一个实施例中，所述根据所述粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点，包括：

获取H-minima变换阈值；

根据所述H-minima变换阈值，得到极小值点个数；

通过将所述极小值点个数与所述粘连细胞中的细胞个数进行比较，得到所述最优极小值点。

在其中一个实施例中，所述对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像，包括：

对所述细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像；

通过开运算，去除所述阈值化图像背景中的非细胞区域，得到开运算图像；

通过闭运算，去除所述开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像；

当所述闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对所述闭运算图像进行孔洞填充，得到所述二值化细胞图像。

在其中一个实施例中，所述根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像，包括：

通过在所述二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到细胞轮廓信息；

根据所述细胞轮廓信息，获取包含所述细胞轮廓的最小矩形，得到所述细胞分割图像。

在其中一个实施例中，所述根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像的步骤之后，包括：

从所述细胞分割图像中，采集细胞信息；所述细胞信息包括细胞尺寸和细胞内部结构；

根据所述细胞信息，得到训练样本数据；所述训练样本数据用于细胞特征识别和细胞筛选。

图像分割相关的装置及设备

一种细胞图像分割装置，包括：

输入模块，用于读取细胞灰度图像；

均衡化模块，用于对所述细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

形态学模块，用于对所述均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；所述形态学操作包括顶帽操作和梯度操作；

边缘检测模块，用于通过边缘检测算法检测所述形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

二值化模块，用于对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

分割模块，用于根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现以下步骤：

读取细胞灰度图像；

对所述细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对所述均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；所述形态学操作包括顶帽操作和梯度操作；

通过边缘检测算法检测所述形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现以下步骤：

读取细胞灰度图像；

对所述细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对所述均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；所述形态学操作包括顶帽操作和梯度操作；

通过边缘检测算法检测所述形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

上述细胞图像分割方法、装置、计算机设备和计算机可读存储介质，对读取的细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，能够增强图像对比度，清晰化细胞边缘，以便准确检测细胞边缘。对均衡化图像进行形态学操作，可以进一步清晰化细胞边缘，使检测到的细胞边缘更加准确。通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像，由于细胞边缘图像中不但包含细胞外轮廓，还包含细胞内部轮廓，还进一步对细胞边缘图像进行二值化处理，以去掉细胞内部轮廓。根据得到的二值化细胞图像进行细胞分割，由于没有细胞内部轮廓的干扰，可以得到准确度较高的细胞分割图像，从而实现单细胞图像的准确分割，在后续的深度学习过程中，能够提供海量高质量的训练样本，提高细胞特征识别和细胞筛选的准确度。

期望产物的表达量高的单克隆的分离

在本发明中，步骤d)分离所述期望产物的表达量高的单克隆是指分离在所述细胞芯片中期望产物的表达量排名前n个的单克隆。n为任意正整数，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多个单克隆。

在一些实施方式中，所述缀合物中具有用于显示信号强度的指示剂；

所述方法还包括：

对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测或对所述指示剂进行定量检测之后，在暗场下检测所述细胞分割图像中所述期望产物或所述缀合物中所述指示剂的强度，并对其进行排序。

在一些实施方式中，若所述期望产物的表达量高的单克隆未在步骤b)所确认的孔中，则根据明场和/或暗场下所获取的图像将细胞分割提取出来。

显然，若所述期望产物的表达量高的单克隆在步骤b)所确认的孔中，则直接从该孔中分离该单克隆，或从该孔所对应固相支持物上分离该单克隆(当所述期望产物为附着于细胞膜表面的物质时，如膜蛋白)。

细胞芯片分隔的区室本身可起到细胞定位的作用，可利于单克隆的分离。在一些实施方式中，所述细胞芯片上不同位置的孔列阵具有可供辨识的识别标记。在一些实施方式中，所述固相支持物上具有可供辨识其与细胞芯片上不同孔的接触位置的识别标记。

特别地，上述识别标记可便于显微扫描仪或者显微镜识别。

固相支持物在完成与期望物质的偶联后，可脱离细胞芯片进行检测。优选可以在细胞芯片上进行原位检测，通过仪器识别细胞芯片和/或固相支持物的识别标记读取细胞所在的位置信息，而后再读取缀合物中的信息，如此能够减少操作步骤，避免额外的系统误差和人为误差的引入，并且所得到的缀合物的定量分析信息与位置信息更容易进行比对分析。

在一些实施方式中，所述方法还包括：

对步骤d)所述单克隆进行扩增；和/或筛选出表达所述期望产物能力更稳定的单克隆。

实施例1图像分割方法及设备

在一个实施例中，如图1所示，提供了一种细胞图像分割方法。本实施例提供的细胞图像分割方法，可以应用于如图2所示的应用环境中。在该应用环境中，包括有用户终端202和细胞图像分割服务器204。其中，用户终端202可以但不限于是各种能够获取高倍细胞影像的个人计算机、笔记本电脑、智能手机、平板电脑和便携式可穿戴设备，细胞图像分割服务器204可以但不限于是各种具有图像处理功能的个人计算机、笔记本电脑、智能手机、平板电脑和便携式可穿戴设备。上述的细胞图像分割方法，以应用于图2中的细胞图像分割服务器204为例进行说明，可以包括以下步骤：

步骤S102，读取细胞灰度图像。

其中，细胞灰度图像可以为通过显微镜对细胞拍摄到的仅具有灰度值的影像。例如，细胞灰度图像可以为不同时期的CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢)细胞影像的灰度图。

具体实现中，在观察周期内拍摄不同时期的CHO细胞影像，将细胞影像存储在细胞图像分割服务器204中，当需要进行图像分割处理时，从细胞图像分割服务器204中读取CHO细胞影像的灰度图。

例如，可以在细胞株培养过程中选取5个时间点，分别通过高倍显微镜拍摄CHO细胞影像，得到5幅细胞灰度图像，将这些图像存储在细胞图像分割服务器204中，当需要进行细胞图像分割时，从细胞图像分割服务器204中读取一幅细胞灰度图像。

步骤S104，对细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像。

其中，直方图均衡化操作可以为通过直方图算法对图像中不同元素的对比度进行均衡化的操作。

具体实现中，可以对细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，统计像素中每个灰度值的个数，计算每个灰度值出现的概率，根据概率对灰度值进行映射。通过直方图均衡化操作，可以起到增强图像对比度，清晰化细胞边缘的作用，以便准确检测细胞边缘。

实际应用中，可以通过下列公式实现上述的直方图均衡化操作：

其中，round()函数表示取整操作，对括号中自变量的小数位数进行四舍五入运算，M和N分别为细胞灰度图像中长和宽的像素个数，L表示灰度级数，v为细胞灰度图像中的像素值，cdf_min为累积分布函数的最小值，累积分布函数cdf通过下式计算

其中，p_x(j)表示灰度级为j的像素出现的概率，即像素值为j的图像的直方图，归一化到[0,1]。

例如，对于400×300像素的细胞灰度图像，M＝400，N＝300，采用8比特深度，L为2^8＝256，v为每一个像素点的具体灰度值，可以取0～255之间的任意一个值。针对细胞灰度图像中的每一个像素点，根据公式进行改进直方图均衡化操作，得到均衡化图像。

步骤S106，对均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像。

其中，形态学操作为对相邻的元素进行连接或将相邻元素分离成独立元素的操作，形态学操作可以具体包括顶帽操作和梯度操作。

具体实现中，可以先采用形态学顶帽操作在细胞图像的大幅背景下突出细胞轮廓，然后，采用形态学梯度操作来寻找细胞边缘，通过联合使用形态学顶帽操作和梯度操作，可以确保在后续的边缘检测过程中能够准确提取细胞边缘。

实际应用中，可以令src表示均衡化图像，element表示结构元素，对均衡化图像进行顶帽操作的公式为

dst＝tophat(src,element)＝src-open(src,element)＝src-dilate(erode(src,element))；

其中，open(src,element)表示形态学开运算，对src进行先腐蚀再膨胀操作，dilate(src,element)表示膨胀操作。

然后，对图像dst进行梯度操作，公式为

dst′＝morph_grad(dst,element)＝dilate(dst,element)-erode(dst,element)；

其中，erode(dst,element)表示对dst进行腐蚀操作，得到的图像dst’为形态学图像。

步骤S108，通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像。

其中，边缘检测算法为能够识别形态学图像中最优的细胞轮廓的一种算法，可以为Canny方法。

具体实现中，Canny方法首先通过高斯平滑滤波器对形态学图像进行降噪处理，然后计算图像中每个像素点的梯度强度和方向，通过非极大值抑制(Non-MaximumSuppression)方法消除杂散响应，排除非边缘像素，保留候选边缘，最后通过双阈值(Double-Threshold)确定细胞边缘。上述Canny方法不容易受到噪声干扰，通过使用双阈值能够分别检测到强边缘和弱边缘，当弱边缘和强边缘相连时，输出图像中包含有弱边缘，得到的边缘检测结果准确度较高。

实际应用中，Canny方法可以执行以下步骤：

(1)使用高斯滤波器对形态学图像做平滑处理，滤除噪声，大小为(2k+1)*(2k+1)的高斯滤波器核生成公式为

(2)计算形态学图像中每个像素点的梯度强度和方向；

(3)通过非极大值抑制方法，消除掉边缘检测所带来的杂散响应；

(4)通过双阈值检测确定形态学图像中真实和潜在的边缘；

(5)通过抑制孤立的弱边缘完成边缘检测，得到细胞边缘图像。

步骤S110，对细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像。

其中，二值化处理可以为对细胞边缘图像进行二值化处理，使输出的图像中只包含黑和白两种颜色，可以包括阈值处理、开运算、闭运算和空洞填充。

具体实现中，由于CHO细胞内部较复杂，得到的细胞边缘图像不但包含细胞外轮廓，而且还包含细胞的内部轮廓。为了根据细胞外轮廓进行细胞分割，首先对细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像，例如，设置阈值为100，对于细胞边缘图像中灰度值高于100的像素点，令其灰度值为255，对于灰度值低于或等于100的像素点，令其灰度值为0。对阈值化图像做开运算，去除背景中的非细胞区域，得到开运算图像，然后，对开运算图像做闭运算，去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像。当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，可以对闭运算图像进行孔洞填充，公式为

其中，X₀为全黑且在孔洞处有一个白像素的图像，B表示结构元，A^c表示闭运算图像的补集，⊕表示B结构元对X_k-1做膨胀操作。

步骤S112，根据二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

其中，细胞分割为根据二值化细胞图像中的细胞轮廓，将整个单细胞分割出来，得到的细胞分割图像可以为包含整个单细胞外轮廓的最小矩形。

具体实现中，可以调用opencv库中的findContours函数获取细胞轮廓，调用boundingRect函数获取轮廓最小外界矩形，判断细胞面积，以及存储细胞分割图像。

实际应用中，findContours函数采用遍历每个像素点的像素值的原理进行轮廓查找，其公式为

其中，cv2为opencv的简写，image为输入的二值化细胞图像，cv2.RETR_TREE是一种检索轮廓的模式——建立一个等级树结构的轮廓，cv2.CHAIN_APPROX_SIMPLE表示一种轮廓的近似办法——压缩水平方向，垂直方向，对角线方向的元素，只保留该方向的终点坐标，例如一个矩形轮廓只需4个点来保存轮廓信息，contours存储的每个轮廓的点向量，contours[i]表示第i个轮廓，hierarchy表示轮廓的拓扑信息，contours[i]轮廓的对应的拓扑信息为hierarchy[i][0]～hierarchy[i][3]，分别表示后一个轮廓，前一个轮廓，父轮廓，内嵌轮廓的索引，如果没有对应项，则相应的hierarchy[i]设置为负数。然后遍历轮廓contours[i]。

boundingRect函数的公式为

x,y,w,h＝cv2.boundingRect(contours[i])；

其中x与y分别为轮廓最小外接矩形的左上定点像素坐标，w和h分别为矩形的宽和高，截取该部分，并遍历该区域中像素值为255的像素个数作为该轮廓的面积，然后根据细胞的面积筛选出合适的细胞的轮廓图片，并保存细胞最小外接矩形图。

应该理解的是，虽然图1的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，这些步骤可以以其它的顺序执行。而且，图1中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，这些子步骤或者阶段的执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其它步骤或者其它步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。

上述细胞图像分割方法，对读取的细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，能够增强图像对比度，清晰化细胞边缘，以便准确检测细胞边缘。对均衡化图像进行形态学操作，可以进一步清晰化细胞边缘，使检测到的细胞边缘更加准确。通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像，由于细胞边缘图像中不但包含细胞外轮廓，还包含细胞内部轮廓，还进一步对细胞边缘图像进行二值化处理，以去掉细胞内部轮廓。根据得到的二值化细胞图像进行细胞分割，由于没有细胞内部轮廓的干扰，可以得到准确度较高的细胞分割图像。

图3是一个实施例的一种细胞图像分割方法的各步骤图像处理结果图，其中，图3A为在步骤S102所读取的细胞灰度图像；图3B为经过步骤S104的直方图均衡化处理，得到的均衡化图像；图3C为经过步骤S108的边缘检测，得到的细胞边缘图像；图3D和3E分别为步骤S110二值化处理过程中得到的闭运算图像和二值化细胞图像。

图4是一个实施例的一种细胞图像分割方法的图像分割结果图，对于图3A中的各个单细胞，分割得到包含单细胞轮廓的最小外界矩形，根据该结果可以计算细胞面积，分割结果保存在细胞图像分割服务器中，可以用于在深度学习中进行细胞特征识别和细胞筛选。

在另一个实施例中，上述步骤S112，可以具体包括：当二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算粘连细胞中的细胞个数；根据粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点；根据最优极小值点，对二值化细胞图像进行距离变换，得到距离变换图像；使用分水岭算法对距离变换图像进行分割，得到细胞分割图像。

其中，粘连细胞为二值化细胞图像中两个或多个相互粘连的单细胞。

其中，链码方法为基于Freeman链码，对细胞粘连图像进行标记的方法，图5B给出了当两个单细胞粘连时的链码示意图。

其中，最优极小值点为H-minima变换方法中当极小值点个数等于粘连细胞个数时的极小值点。

具体实现中，当存在粘连细胞时，获取二值化细胞图像中细胞粘连部分的Freeman链码，根据图5A，当采用8连通链码时，像素点的8个方向从右正方向为0开始计数，逆时针依次增加，图5B中的Freeman链码依次为455677567011231233。

对Freeman链码进行改进，步骤如下：

(1)选取起始位置，加入标记‘B’，如图5B所示；

(2)逆时针方向遍历，当相邻的两个链码方向不同时，例如，前一个链码的方向为左上、正左、左下，后一个链码的方向在右上、正右、右下，或者前一个链码方向为左上、正上、右上，而下一个链码方向为左下、正下、右下，则在两个链码中插入‘C’，如图5B中的灰色圆点所示；

(3)遍历到链码结尾处加入标记‘E’，如图5B所示。

基于改进的Freeman链码，图5B的链码输出为B4556C77C56C70112C3C12C33E，根据实验可以得出，在‘B’和‘E’之间，每增加一个粘连细胞，需要标记的‘C’增加4个，令N_C为改进的Freeman链码中‘C’的个数，可以计算粘连细胞中的细胞个数为

根据所得到的粘连细胞个数，确定H-minima变换中的h阈值，可以随机选取h阈值，每个h阈值对应一个极小值点的图像，当图像中极小值点个数等于粘连细胞个数时，可以确定h阈值为当前选取的h阈值，根据确定的h阈值得到最优的极小值点，然后生成极小值像素点集合。

接下来，通过距离变换将二值化细胞图像转换为距离变换图像。采用欧氏距离变换计算二值化细胞图像中非零像素点到极小值点的最小距离，作为该点变换后的值，距离公式如下：

其中(x，y)是像素值非零点的坐标，(i，j)为极小值点坐标。经过距离变换得到的距离变换图像为灰度图，如图6所示，其中黑色部分为两个细胞，白色区域为“盆地”的边缘，可以将两个细胞分割开来。

最后，采用分水岭算法对距离变换图像进行分割，通过调用opencv中connectedComponents函数获取距离变换图像的masker标签，其中前景(细胞部分)标签为1，背景为0，从标签为1的地方开始漫水，让水漫起来找到最后的边界，将该边界存储为数据，根据该数据对粘连细胞进行分割，得到如图7所示的细胞分割图像。

上述细胞图像分割方法，针对二值化细胞图像中存在粘连细胞的情况，通过链码方法，准确获得粘连细胞中的细胞个数，根据细胞个数确定H-minima变换方法中的最优极小值点，根据最优极小值点，对二值化细胞图像进行距离变换得到距离变换图像，距离变换图像实现了对于粘连细胞的分离，使用分水岭算法对距离变换图像进行分割，可以从粘连细胞图像中准确分割出单细胞图像。

在另一个实施例中，上述步骤S112，可以还包括：对二值化细胞图像的链码起始位置进行标记，得到链码起始标记；对二值化细胞图像中链码方向发生改变的位置进行标记，得到链码变化标记；对二值化细胞图像的链码结尾位置进行标记，得到链码结尾标记；根据链码起始标记、链码变化标记和链码结尾标记，计算粘连细胞中的细胞个数。

具体实现中，如图5所示，在传统的Freeman链码方法基础上，首先确定链码起始位置，在链码起始位置引入标记‘B’，然后进行逆时针方向遍历，当相邻的两个链码方向不同时，可以确定链码方向发生改变的位置，将其标记为‘C’，最后，当遍历到链码结尾处时，确定链码结尾位置，加入标记‘E’。统计‘B’和‘E’之间的‘C’的个数N_C，由于每增加一个粘连细胞，标记‘C’增加4个，可以计算粘连细胞中的细胞个数为

由于步骤S112的上述处理过程在前述实施例中已有详细说明，在此不再赘述。

上述方法对二值化细胞图像的链码起始位置、链码方向发生改变的位置和链码结尾位置分别进行标记，根据标记计算粘连细胞中的细胞个数，便于在后续步骤中使用距离变换方法对粘连细胞进行分离，以及使用分水岭算法从粘连细胞图像中准确分割出单细胞图像。

在另一个实施例中，上述步骤S112，可以还包括：获取H-minima变换阈值；根据H-minima变换阈值，得到极小值点个数；通过将极小值点个数与粘连细胞中的细胞个数进行比较，得到最优极小值点。

其中，H-minima变换阈值为H-minima变换方法中的h阈值。

具体实现中，可以随机选取h阈值，每个h阈值对应一个极小值点的图像，当图像中极小值点个数等于粘连细胞个数时，可以确定h阈值为当前选取的h阈值，根据确定的h阈值得到最优的极小值点，然后生成极小值像素点集合。由于步骤S112的上述处理过程在前述实施例中已有详细说明，在此不再赘述。

上述方法根据H-minima变换阈值得到最优极小值点，便于在后续步骤中使用距离变换方法对粘连细胞进行分离，以及使用分水岭算法从粘连细胞图像中准确分割出单细胞图像。

在另一个实施例中，上述步骤S110，可以具体包括：对细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像；通过开运算，去除阈值化图像背景中的非细胞区域，得到开运算图像；通过闭运算，去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像；当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对闭运算图像进行孔洞填充，得到二值化细胞图像。

具体实现中，设置一个阈值对细胞边缘图像进行二值化处理，例如，设置阈值为100，对于细胞边缘图像中灰度值高于100的像素点，令其灰度值为255，对于灰度值低于或等于100的像素点，令其灰度值为0。然后进行开运算操作，去除背景中的非细胞区域，以及进行闭运算操作去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到的图像如图3D所示的闭运算图像，当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，例如，图3D细胞内部的黑色点状区域，对闭运算图像进行孔洞填充，得到如3E所示的二值化细胞图像。由于步骤S110的上述处理过程在前述实施例中已有详细说明，在此不再赘述。

上述方法通过阈值处理将细胞边缘图像中的细胞与背景区分开来，便于后续分割细胞图像，开运算可以去除背景区域中的非细胞区域，避免对背景进行错误分割，闭运算可以去除细胞的内部边缘，当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对闭运算图像进行孔洞填充，便于后续针对细胞外边缘得到准确的细胞分割图像。

在另一个实施例中，上述步骤S112，可以还包括：通过在二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到细胞轮廓信息；根据细胞轮廓信息，获取包含细胞轮廓的最小矩形，得到细胞分割图像。

具体实现中，对于如图3E所示的二值化细胞图像，可以调用opencv库中的findContours函数，通过遍历每个像素点的像素值进行轮廓查找，得到细胞轮廓信息，然后，使用boundingRect函数获取轮廓最小外界矩形，判断细胞面积，以及存储细胞分割图像。由于步骤S112的上述处理过程在前述实施例中已有详细说明，在此不再赘述。

上述方法在二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到的细胞轮廓信息较准确，根据此细胞轮廓信息获取包含细胞轮廓的最小矩形，得到的细胞分割图像准确度较高。

在另一个实施例中，上述步骤S112之后，还可以包括：从细胞分割图像中，采集细胞信息；细胞信息包括细胞尺寸和细胞内部结构；根据细胞信息，得到训练样本数据；训练样本数据用于细胞特征识别和细胞筛选。

其中，细胞信息为单个细胞的尺寸和内部结构等信息。

具体实现中，可以从图4所示的细胞分割图像中采集每个单细胞的尺寸，以及蛋白表达参数等信息，对采集到的信息进行分类整理，得到训练样本数据，当需要使用深度学习等方法进行细胞特征识别或细胞筛选时，基于训练样本数据进行训练，根据需要实现的功能不同，可以建立细胞特征识别模型或细胞筛选模型，基于建立的模型进行细胞特征识别或细胞筛选。

上述方法从细胞分割图像中采集细胞信息，由于细胞分割图像准确度较高，采集到的细胞信息也具有较高的准确度，将该信息作为训练样本，基于该训练样本使用深度学习进行细胞特征识别和细胞筛选，结果具有较高的准确性和较低的运算时间。

在一个实施例中，如图8所示，提供了一种细胞图像分割装置800，包括：输入模块802、均衡化模块804、形态学模块806、边缘检测模块808、二值化模块810和分割模块812，其中：

输入模块802，用于读取细胞灰度图像；

均衡化模块804，用于对细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

形态学模块806，用于对均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；

边缘检测模块808，用于通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

二值化模块810，用于对细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

分割模块812，用于根据二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，分割模块812，包括：当二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算粘连细胞中的细胞个数；根据粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点；根据最优极小值点，对二值化细胞图像进行距离变换，得到距离变换图像；使用分水岭算法对距离变换图像进行分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，分割模块812，还包括：对二值化细胞图像的链码起始位置进行标记，得到链码起始标记；对二值化细胞图像中链码方向发生改变的位置进行标记，得到链码变化标记；对二值化细胞图像的链码结尾位置进行标记，得到链码结尾标记；根据链码起始标记、链码变化标记和链码结尾标记，计算粘连细胞中的细胞个数。

在一个实施例中，分割模块812，还包括：获取H-minima变换阈值；根据H-minima变换阈值，得到极小值点个数；通过将极小值点个数与粘连细胞中的细胞个数进行比较，得到最优极小值点。

在一个实施例中，二值化模块810，包括：对细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像；通过开运算，去除阈值化图像背景中的非细胞区域，得到开运算图像；通过闭运算，去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像；当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对闭运算图像进行孔洞填充，得到二值化细胞图像。

在一个实施例中，分割模块812，还包括：通过在二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到细胞轮廓信息；根据细胞轮廓信息，获取包含细胞轮廓的最小矩形，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，分割模块812，还包括：从细胞分割图像中，采集细胞信息；细胞信息包括细胞尺寸和细胞内部结构；根据细胞信息，得到训练样本数据；训练样本数据用于细胞特征识别和细胞筛选。

关于细胞图像分割装置的具体限定可以参见上文中对于细胞图像分割方法的限定，在此不再赘述。上述细胞图像分割装置中的各个模块可全部或部分通过软件、硬件及其组合来实现。上述各模块可以硬件形式内嵌于或独立于计算机设备中的处理器中，也可以以软件形式存储于计算机设备中的存储器中，以便于处理器调用执行以上各个模块对应的操作。

上述提供的细胞图像分割装置可用于执行上述任意实施例提供的细胞图像分割方法，具备相应的功能和有益效果。

在一个实施例中，提供了一种计算机设备，该计算机设备可以是终端，其内部结构图可以如图9所示。该计算机设备包括通过系统总线连接的处理器、存储器、网络接口、显示屏和输入装置。其中，该计算机设备的处理器用于提供计算和控制能力。该计算机设备的存储器包括非易失性存储介质、内存储器。该非易失性存储介质存储有操作系统和计算机程序。该内存储器为非易失性存储介质中的操作系统和计算机程序的运行提供环境。该计算机设备的网络接口用于与外部的终端通过网络连接通信。该计算机程序被处理器执行时以实现一种空气传感器的室内定位方法。该计算机设备的显示屏可以是液晶显示屏或者电子墨水显示屏，该计算机设备的输入装置可以是显示屏上覆盖的触摸层，也可以是计算机设备外壳上设置的按键、轨迹球或触控板，还可以是外接的键盘、触控板或鼠标等。

本领域技术人员可以理解，图9中示出的结构，仅仅是与本申请方案相关的部分结构的框图，并不构成对本申请方案所应用于其上的计算机设备的限定，具体的计算机设备可以包括比图中所示更多或更少的部件，或者组合某些部件，或者具有不同的部件布置。

在一个实施例中，提供了一种计算机设备，包括存储器和处理器，存储器中存储有计算机程序，该处理器执行计算机程序时实现以下步骤：

读取细胞灰度图像；

对细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；

通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：当二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算粘连细胞中的细胞个数；根据粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点；根据最优极小值点，对二值化细胞图像进行距离变换，得到距离变换图像；使用分水岭算法对距离变换图像进行分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：对二值化细胞图像的链码起始位置进行标记，得到链码起始标记；对二值化细胞图像中链码方向发生改变的位置进行标记，得到链码变化标记；对二值化细胞图像的链码结尾位置进行标记，得到链码结尾标记；根据链码起始标记、链码变化标记和链码结尾标记，计算粘连细胞中的细胞个数。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：获取H-minima变换阈值；根据H-minima变换阈值，得到极小值点个数；通过将极小值点个数与粘连细胞中的细胞个数进行比较，得到最优极小值点。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：对细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像；通过开运算，去除阈值化图像背景中的非细胞区域，得到开运算图像；通过闭运算，去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像；当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对闭运算图像进行孔洞填充，得到二值化细胞图像。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：通过在二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到细胞轮廓信息；根据细胞轮廓信息，获取包含细胞轮廓的最小矩形，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，处理器执行计算机程序时还实现以下步骤：从细胞分割图像中，采集细胞信息；细胞信息包括细胞尺寸和细胞内部结构；根据细胞信息，得到训练样本数据；训练样本数据用于细胞特征识别和细胞筛选。

在一个实施例中，提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，计算机程序被处理器执行时实现以下步骤：

读取细胞灰度图像；

对细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；

通过边缘检测算法检测形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：当二值化细胞图像中存在粘连细胞时，通过链码方法计算粘连细胞中的细胞个数；根据粘连细胞中的细胞个数，得到H-minima变换方法中的最优极小值点；根据最优极小值点，对二值化细胞图像进行距离变换，得到距离变换图像；使用分水岭算法对距离变换图像进行分割，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：对二值化细胞图像的链码起始位置进行标记，得到链码起始标记；对二值化细胞图像中链码方向发生改变的位置进行标记，得到链码变化标记；对二值化细胞图像的链码结尾位置进行标记，得到链码结尾标记；根据链码起始标记、链码变化标记和链码结尾标记，计算粘连细胞中的细胞个数。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：获取H-minima变换阈值；根据H-minima变换阈值，得到极小值点个数；通过将极小值点个数与粘连细胞中的细胞个数进行比较，得到最优极小值点。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：对细胞边缘图像进行阈值处理，得到阈值化图像；通过开运算，去除阈值化图像背景中的非细胞区域，得到开运算图像；通过闭运算，去除开运算图像中的细胞内部边缘，得到闭运算图像；当闭运算图像中仍然存在细胞内部边缘时，对闭运算图像进行孔洞填充，得到二值化细胞图像。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：通过在二值化细胞图像中查找细胞轮廓，得到细胞轮廓信息；根据细胞轮廓信息，获取包含细胞轮廓的最小矩形，得到细胞分割图像。

在一个实施例中，计算机程序被处理器执行时还实现以下步骤：从细胞分割图像中，采集细胞信息；细胞信息包括细胞尺寸和细胞内部结构；根据细胞信息，得到训练样本数据；训练样本数据用于细胞特征识别和细胞筛选。

本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，所述的计算机程序可存储于一非易失性计算机可读取存储介质中，该计算机程序在执行时，可包括如上述各方法的实施例的流程。其中，本申请所提供的各实施例中所使用的对存储器、存储、数据库或其它介质的任何引用，均可包括非易失性和/或易失性存储器。非易失性存储器可包括只读存储器(ROM)、可编程ROM(PROM)、电可编程ROM(EPROM)、电可擦除可编程ROM(EEPROM)或闪存。易失性存储器可包括随机存取存储器(RAM)或者外部高速缓冲存储器。作为说明而非局限，RAM以多种形式可得，诸如静态RAM(SRAM)、动态RAM(DRAM)、同步DRAM(SDRAM)、双数据率SDRAM(DDRSDRAM)、增强型SDRAM(ESDRAM)、同步链路(Synchlink)DRAM(SLDRAM)、存储器总线(Rambus)直接RAM(RDRAM)、直接存储器总线动态RAM(DRDRAM)、以及存储器总线动态RAM(RDRAM)等。

实施例2筛选高表达Aflibercept产物的细胞的方法

1.制备具有12万孔的细胞芯片，每孔为50μM边长的立方体，将芯片放置于25×75mm免洗载玻片上；

2.将摇瓶培养的表达Aflibercept产物的稳定细胞池计数，取10万个细胞重悬于600μL培养基(BalanCD Growth A CHO medium，Irvine Scientific公司)中，均匀滴加在细胞芯片上；

3.将载玻片连同芯片放置于10cm无菌培养皿中，周围添加无菌水保湿，随后将整个培养皿放置于细胞培养箱中37度5％CO₂培养过夜；

4.将上述载玻片连同细胞芯片取出擦干，放置于显微镜上进行区域扫描拍照，物镜为20倍放大倍数，总共得到1786张图片(图10)；

5.将以上图片中的细胞进行切割，得到单个细胞图片89300个；

6.对89300张单个细胞图片进行图像预处理，统一填充图片大小到224×224，再放大图片大小到448×448进行归一化处理。输入预处理后的细胞图片数据到回归模型进行预测，回归网络模型包括四个部分，分别提取细胞图片的不同层级的特征，将4个网络结构提取的图片特征输出并进行特征融合，然后将其输入到一个全连接层，输出最终预测表达量结果。

7.每个细胞对应一个预测表达量输出，最终获取预测表达量结果，并将结果进行排序，最终选取排序前50的细胞进行后续实验。

实施例3筛选高表达Bevacizumab-GFP产物的细胞的方法

1.制备具有12万孔的细胞芯片，每孔为50μM边长的立方体，将芯片放置于25×75mm免洗载玻片上；

2.将摇瓶培养的表达Bevacizumab-GFP产物的稳定细胞池计数，取10万个细胞重悬于600μL培养基(BalanCD Growth A CHO medium，Irvine Scientific公司)中，均匀滴加在细胞芯片上；

3.将载玻片连同芯片放置于10cm无菌培养皿中，周围添加无菌水保湿，随后将整个培养皿放置于细胞培养箱中37度5％CO₂培养过夜；

4.将上述载玻片连同细胞芯片取出擦干，放置于显微镜上进行区域扫描拍照，物镜为10倍放大倍数，扫描明场和GFP两个通道，获得明场、GFP以及两通道重叠图片各620张(图11)；

5.对输入图片进行预处理，对其进行缩放使图片大小等于2048*1536，并进行归一化处理；

6.使用CNN特征提取器作用在图像预处理后的图片数据，得到620个40*60的特征图；

7.对上述特征图在进行3*3的卷积，输出两个分支，第一个分支在经过1*1的卷积的作用输出特征图上每个像素点是否为背景的概率，若不是背景则第二个分支输出该特征图像素点对应在大图的的区域坐标[x,y,w,h]；

8.根据7中的到的候选区域，选取非背景概率最大的10000张，利用非极大值抑制得到2000个候选区域；

9.根据8得到的候选区域特征图进行归一化处理，输入到CNN网络，输出两个分支，第一个分支输出候选区域的细胞类别(1个，2个，3个，4个，背景)的评分，第二分支根据候选区域坐标进行边框回归得到更精细化的坐标[x,y,w,h]；

10.根据9得到的细胞类型评分，选取细胞类型为(1个，2个，3个，4个)且评分大于0.8的细胞和对应的坐标；

11.利用在10中的得到的灰度细胞大图的细胞类型和坐标，在荧光细胞大图上选取同样坐标的细胞区域，在荧光大图中选取的每个细胞区域找出各自荧光像素值最小值，每个细胞区域的所有荧光像素值减去各自荧光像素最小值在进行累加得到每个细胞区域的总荧光值；

12.根据11得到的每个细胞区域的总荧光值和细胞类型，根据总荧光除以细胞类型得到每个细胞区域的单个细胞荧光值并进行排序。

实施例4筛选高表达Aflibercept产物的细胞的方法

1.制备具有12万孔的细胞芯片，每孔为50μM边长的立方体，将芯片放置于25×75mm免洗载玻片上；

2.将摇瓶培养的表达Aflibercept产物的稳定细胞池计数，取10万个细胞重悬于600μL半固态培养基中(CloneMedia CHO Growth A，Molecular Devices公司)，另外加入60μL(CloneDetect荧光染料，Molecular Devices公司)，混匀后均匀滴加在细胞芯片上；

3.将载玻片连同芯片放置于10cm无菌培养皿中，周围添加无菌水保湿，随后将整个培养皿放置于细胞培养箱中37度5％CO₂培养过夜；

4.将上述载玻片连同细胞芯片取出擦干，放置于显微镜上进行区域扫描拍照，物镜为10倍放大倍数，扫描明场和GFP两个通道，获得明场、GFP以及两通道重叠图片各620张(图12)；

5.对输入图片进行预处理，对其进行缩放使图片大小等于2048*1536，并进行归一化处理；

6.使用CNN特征提取器作用在图像预处理后的图片数据，得到620个40*60的特征图；

7.对上述特征图在进行3*3的卷积，输出两个分支，第一个分支在经过1*1的卷积的作用输出特征图上每个像素点是否为背景的概率，若不是背景则第二个分支输出该特征图像素点对应在大图的的区域坐标[x,y,w,h]；

8.根据7中的到的候选区域，选取非背景概率最大的10000张，利用非极大值抑制得到2000个候选区域；

9.根据8得到的候选区域特征图进行归一化处理，输入到CNN网络，输出两个分支，第一个分支输出候选区域的细胞类别(1个，2个，3个，4个，背景)的评分，第二分支根据候选区域坐标进行边框回归得到更精细化的坐标[x,y,w,h]；

10.根据9得到的细胞类型评分，选取细胞类型为(1个，2个，3个，4个)且评分大于0.8的细胞和对应的坐标；

11.利用在10中的得到的灰度细胞大图的细胞类型和坐标，在荧光细胞大图上选取同样坐标的细胞区域，在荧光大图中选取的每个细胞区域找出各自荧光像素值最小值，每个细胞区域的所有荧光像素值减去各自荧光像素最小值在进行累加得到每个细胞区域的总荧光值；

12.根据11得到的每个细胞区域的总荧光值和细胞类型，根据总荧光除以细胞类型得到每个细胞区域的单个细胞荧光值并进行排序。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.筛选能够表达期望产物细胞株的方法，其特征在于，包括：

a)将细胞池稀释后接种于细胞芯片中；

所述细胞池中含有能够表达期望产物的细胞；

b)对所述细胞芯片进行扫描，确认并记录拥有单克隆细胞的孔；

当所述期望产物为分泌性物质或附着于细胞膜表面的物质时，所述方法还包括c1和d：当所述期望产物为胞浆非分泌性物质时，所述方法还包括c2和d：

c1)将固相支持物与所述细胞芯片的细胞孔面接触，以使得所述固相支持物上偶联的具有与所述期望产物结合能力的分子捕获所述期望产物形成缀合物；

对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

c2)所述期望产物具有用于显示信号强度的指示剂，对所述指示剂进行定量检测，以确定芯片上每一个拥有单克隆细胞的孔的所述期望产物的表达量；

d)分离所述期望产物的表达量高的单克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)具体包括：

对所述细胞芯片进行扫描，获取所述细胞芯片中的细胞于明场和/或暗场下的图像，将所述图像中的细胞切割为单细胞图片，对所述单细胞图片进行分析以确认并记录拥有单克隆细胞的孔。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述图像中的细胞切割为单细胞图片的方法包括：

将所述明场和/或暗场图像灰度化，读取细胞灰度图像；

对所述细胞灰度图像进行直方图均衡化操作，得到均衡化图像；

对所述均衡化图像进行形态学操作，得到形态学图像；所述形态学操作包括顶帽操作和梯度操作；

通过边缘检测算法检测所述形态学图像中的细胞边缘，得到细胞边缘图像；

对所述细胞边缘图像进行二值化处理，得到二值化细胞图像；

根据所述二值化细胞图像进行细胞分割，得到细胞分割图像。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述缀合物中具有用于显示信号强度的指示剂；

所述方法还包括：

对所述缀合物中的所述期望产物进行定量检测或对所述指示剂进行定量检测之后，在暗场下检测所述细胞分割图像中所述期望产物或所述缀合物中所述指示剂的强度，并对其进行排序。

5.根据权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，若所述期望产物的表达量高的单克隆未在步骤b)所确认的孔中，则根据明场和/或暗场下所获取的图像将细胞分割提取出来。

6.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述分泌性物质选自蛋白质、核酸、多糖以及外泌体；

所述附着于细胞膜表面的物质选自蛋白质和多糖。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蛋白质选自酶、激素、神经递质、血清蛋白以及抗体。

8.根据权利要求1～4、7任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞芯片上不同位置的孔列阵具有可供辨识的识别标记。

9.根据权利要求1～4、7任一项所述的方法，其特征在于，所述固相支持物上具有可供辨识其与细胞芯片上不同孔的接触位置的识别标记。

10.根据权利要求1～4、7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

对步骤d)所述单克隆进行扩增；和/或

筛选出表达所述期望产物能力更稳定的单克隆。

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