CN112029633A - 用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片 - Google Patents

用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了属于生物医学工程技术领域的一种用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片。本发明的芯片包括基底和流道层，所述流道层分为上下两层，下流道层包括设置N条并行的蛇形流道；上流道层包括构建在每条所述蛇形流道之上的上层流道，所述上层流道的内壁设有向外的凸起，所述凸起间隔设置，使上层流道内的通道呈现为非对称的叶脉状通道。本发明的芯片的蛇形流道及非对称的脉状结构，会使截面流场分布不均匀从而易形成涡流，影响流场内部粒子的轨迹。粒子在其中的流动形式因流场的影响而呈现波浪式前进的特点。这大大增加了细胞与修饰有抗体的流道表面的接触几率，显著提高了细胞的捕获效率。

Description

用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控 芯片
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞捕获的微流控芯片。
背景技术
癌症一直被认为是威胁人类健康的第一大杀手，在与癌症相关的死亡案例中，癌症的转移占据着90％以上的比重，因此成为了亟待解决的世界性难题。循环肿瘤细胞是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，近年来被认为是引发恶性肿瘤转移的重要原因，也因此成为了液体活检的重要生物标志物，它可以在早期诊断、疗效评估、药物开发等方面发挥重要作用。然而，循环肿瘤细胞在外周血中的含量极低，(每毫升中仅有10-100个循环肿瘤细胞)，这就限制了循环肿瘤细胞在下游分析研究方面的发展潜能。因此，在进行循环肿瘤细胞检测之前将其从血样中高效率的富集出来成为了循环肿瘤细胞临床应用的重点和难点。
近些年来，在循环肿瘤细胞富集方面已经取得很大进展，很多产品已实现商品化。目前的方法基于原理可分为两类：主动式富集和被动式富集。主动式富集方法主要依赖肿瘤细胞与血细胞在外加场作用下(如声表面波、光镊、免疫磁珠等)物理特性的差异来实现。但是这些方法中外加场对于细胞活力及核酸的损伤无法避免，这也将对下游肿瘤细胞核酸分析造成不利影响。被动式富集方法主要依靠流体动力学原理，即由于惯性迁移效应的存在，不同大小的细胞在封闭流场中的聚焦位置不同而实现的分选，主要包括惯性微流控方法和确定性侧向位移法。这些方法可以实现超高通量分选，极大的节省了临床时间，同时结构简单、制造方便、对细胞完全没有伤害，因此在临床应用方法体现了巨大的发展潜能。然而，由于循环肿瘤细胞和部分体积较大的白细胞之间尺寸差异不明显，因此回收纯度较低。
除此之外，近年来的研究主要集中在提高癌细胞的捕获效率方面，除了关注细胞的捕获率之外，将捕获的细胞无伤害的释放也越来越成为下游临床应用，如细胞体外培养、RNA分析等领域的关注重点。随着纳米技术的快速发展，基于纳米颗粒自组装的生物平台为循环肿瘤细胞的捕获和释放提供了新的思路。在之前的研究中，已报道的生物芯片结构有人字形、花瓣形、波浪形，通过设计不同的流道类型为流道中的流场增加了不确定性，也为抗体的固定提供了更高的自由度，大大增强了细胞表面抗原与纳米尺度的偶联分子之间的拓扑结构。对于细胞释放方法的研究，最初采用的方法是单纯利用流体的界面张力和流体剪切力，机械地冲击以释放捕获的细胞，这种方法虽然简单，但释放效率较低，且极高的流量对于细胞本身的形态及活性也会造成伤害。另外，有研究采用外部刺激法促进细胞释放，如改变温度、利用紫外光照射、电化学刺激等，这些方法在提高释放效率方面有着重要的意义，但细胞仍面临着外加场对于活性的不可逆伤害。为避免外加场的伤害，近期的研究提出了不借助外加场的释放方法，如竞争性配体法、酶降解法等。这些方法虽然避免了外加场刺激对于细胞的伤害，但在逐层偶联的过程中一些化学分子，如抗体、核酸适配体等将跟随释放的细胞到下游进行后续分析，这可能会导致后续如核酸分子检测、质谱分析等操作出现假阳性的问题。
发明内容
为此，本发明的目的之一在于克服现有技术中的上述问题，提供一种可用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片，特异性抗体通过稳定的Au-S键逐层组装到芯片表面。
为此，技术方案为：
一种用于循环肿瘤细胞捕获的微流控芯片，包括基底和流道层，所述流道层设置入口和出口，其特征在于，所述流道层分为上下两层，
下流道层包括设置N条并行的蛇形流道；
所述N条为N大于等于4，例如N为8、12、16、20、32、64，或者，例如N为5、7、9、15、25或35。
上流道层包括构建在每条所述蛇形流道之上的上层流道；
所述上层流道的走向和宽度与之相应的蛇形流道相同，所述上层流道的内壁设有向外的凸起，所述凸起间隔设置，使上层流道内的通道呈现为非对称的叶脉状通道；
所述入口和出口分别与所述蛇形流道相连。
上述微流控芯片中，所述蛇形流道的通道宽度为300-500μm，例如，300μm、350μm、400μm、450μm、500μm；蛇形弯曲部分的弯曲角度为120°-150°，例如，130°或140°；流道高度为50μm-100μm，例如，60μm、70μm、80μm、90μm、100μm；所述的蛇形弯曲部分的弯曲角度，即蛇形弯曲部分与水平的夹角。
所述蛇形流道中的一个弯曲单元的内弦长度为500μm-650μm，外弦长度为840μm-1000μm。所述内弦长度，即弯曲部分的流道的内壁的水平跨度，外弦长度，即弯曲部分的流道的外壁的水平跨度。
上述微流控芯片中，所述上层流道的叶脉状通道的主通道的宽度为30-50μm，叶脉状通道的侧道的宽度为30-50μm，侧道与主通道的夹角为120°-150°；同侧相邻侧道之间的距离为30-100μm，主通道两侧的侧道交叉非对称分布。
上述微流控芯片中，所述入口或出口的宽度为300-500μm，例如，300μm、350μm、400μm、450μm、500μm。
上述微流控芯片中，所述基底与流道层互相键合封装而成，所述流道层的材料为聚二甲基硅氧烷、环烯烃类共聚物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种；所述基底为二氧化硅、硅片或硅化玻璃。
上述微流控芯片中，还包括对流道层的流道内表面进行修饰，所述修饰包括：
对流道内表面进行硅烷化修饰；然后修饰金颗粒层，并在所述金颗粒层上修饰功能基团。
所述金颗粒层通过将纳米胶体金通入流道覆盖形成，金颗粒粒径为5-10nm。
上述微流控芯片中，所述功能基团为硫基分子，或者进一步活化所述硫基单分子之上的羧基。
所述硫基单分子的修饰可以为6-硫基-1-己醇和11-巯基十一烷酸共同修饰。
上述微流控芯片中，所述对流道层的流道内表面进行修饰的方法，可以包括：
在流道中预先通入硅烷化偶联剂(APTMS、水和甲醇的硅烷化混合溶液)，使得流道表面实现硅烷化；
将纳米金胶体持续通入流道中，金颗粒在缓慢的流道过程中不断沉积于流道，从而在预处理后的流道表面形成一层颗粒均匀、致密分布的纳米金层；
将11-巯基十一烷酸(MUA)和6-硫基-1-己醇(MCH)溶解于乙醇中并持续通入流道中，通过硫化作用均匀地自组装于金颗粒表面，从而在金表面功能化一层分子膜；
将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的纯水溶液持续通入流道中，通过NHS和EDC的联用，进一步高效活化MUA尾部的羧基为胺活性酯。
上述微流控芯片中，在所述流道层的通道内表面修饰抗体或适配体。
修饰的方法，可以包括：
将含有抗体的缓冲溶液通入流道中，并可与活化后的NHS的酯基产生稳定的酰胺键而被牢固地固定在流道表面。
本发明的目的之二在于提供上述微流控芯片在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
本发明的目的之三在于提供一种循环肿瘤细胞捕获的方法，包括以下步骤：
将细胞悬浮液通入上述微流控芯片的流道中，在细胞充满流道后停止通液，孵育；
释放时，将胰蛋白酶通入流道中，孵育，并在出口处收集释放后细胞。
上述方法中，所述孵育的时间为10-12分钟，之后便在出口处收集释放的细胞。
上述方法中，在出口处收集释放后细胞的容器中应预先放有带有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(PS)的DMEM培养基以避免因胰蛋白酶长时间作用对于细胞表面产生的不可逆伤害。
本发明的芯片，可选的制备方法为：光刻法、湿法刻蚀法、等离子刻蚀法、模塑法、软刻蚀法或LIGA法等。
本发明的优点在于：
(1)与传统的单层细胞捕获芯片相比，本发明在单层芯片上引入非对称的脉状结构，在双层芯片结构中，截面流场分布不均匀，易形成涡流，从而影响流场内部粒子的轨迹。粒子在其中的流动形式因流场的影响而呈现波浪式前进的特点。这大大增加了细胞与修饰有抗体的流道表面的接触几率，显著提高了细胞的捕获效率。
(2)本发明的芯片进一步通过基于纳米金颗粒的自组装方法，使抗体的识别位点更充分地暴露在抗原面前，提高了细胞与流道结合的牢固程度；
(3)本发明的方法中，利用本发明的芯片进行捕获，并选择胰蛋白酶作为细胞的释放剂可以避免基于其他温控、电控、光控等方法中外加场对于细胞活性的损伤，同时也可在释放过程中将偶联的化学分子(如抗体、核酸适配体等)完全去除，避免了这些化学分子对后续循环肿瘤细胞进行分子研究的影响。
附图说明
图1为本发明用于循环肿瘤细胞捕获和释放的微流控芯片的平面结构图。
图2为本发明用于循环肿瘤细胞捕获和释放的微流控芯片的局部结构图。
图3为本发明中流道内MCF-7细胞捕获效果图。
图4为本发明中经胰蛋白酶释放后流道内MCF-7细胞效果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。
以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。
实验例1用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片
如图1所示，用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片，包括基底和流道层，流道层分为上下两层：
下流道层为16条并行的蛇形流道，上层流道的走向和宽度与之相应的蛇形流道相同，上层流道的内壁设有向外的凸起，凸起间隔设置，使上层流道内的通道呈现为非对称的叶脉状通道。
下层蛇形流道的宽度为300μm，每一个弯曲流道单元内外的长度分别为500μm和840μm，弯曲的角度为120°，流道高度为50μm。
上层流道的叶脉状通道的主通道的宽度为50μm，叶脉状通道的侧道的宽度为50μm，侧道与主通道的夹角为120°；同侧相邻侧道之间的距离为50μm，主通道两侧的侧道交叉非对称分布，上层流道的高度为50μm。
16条并行的流道相互独立，样本由同一个宽度为300μm的入口流入，并汇集到同一个宽度为300μm出口处。
实验例2用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片的制备方法
在本实例中，循环肿瘤细胞以乳腺癌细胞MCF-7细胞为例。
用于乳腺癌细胞MCF-7高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片由基底层与流道层互相键合封装而成，流道层的材料采用聚二甲基硅氧烷，同时还可用环烯烃类共聚物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种；所述基底层采用用二氧化硅、硅片或硅化玻璃。
主要制作过程如下：
(1)芯片模具采用4英寸硅片作为光刻基底，首先用丙醇、无水乙醇、去离子水分别超声清洗10min，用氮气吹干后，在干燥箱中烘烤20min；
(2)将适量SU-8光刻胶倾倒在硅片表面，打开匀胶机设置一级和二级转速，获得50μm光刻胶薄膜；
(3)设置前烘温度梯度为65℃和95℃，烘烤时间分别为3min和6min，静置硅片使其冷却至室温；
(4)将下层掩模板与硅片基底放在光刻机上，设置紫外线曝光时间，使其充分曝光；
(5)曝光后的基底放在烘胶台上烘烤，中烘温度为65℃烘烤2min，随后在95℃的烘胶台上烘烤7min，冷却至室温；
(6)将硅片放入SU-8显影液中显影，使未受到曝光的光刻胶被去除，从而将下层掩模板的图案转移到基底上。显影后用异丙醇清洗基底上残留的显影液；
(7)再一次旋涂SU-8光刻胶，设置匀胶机一级和二级转速，获得100μm光刻胶薄膜；
(8)设置前烘温度梯度为65℃和95℃，烘烤时间分别为3min和6min，静置硅片使其冷却至室温；
(9)将上层掩模板与硅片基底放在光刻机上，设置紫外线曝光时间，使其充分曝光；
(10)曝光后的基底放在烘胶台上烘烤，中烘温度为65℃烘烤4min，随后在95℃的烘胶台上烘烤10min，冷却至室温；
(11)将硅片放入SU-8显影液中显影，使未受到曝光的光刻胶被去除，从而将上层掩模板的图案转移到基底上。显影后用异丙醇清洗基底上残留的显影液；
(12)将PDMS预聚物按10:1质量比混合，搅拌均匀后倾倒在模具表面。利用真空泵中抽气30min，以去除搅拌时PDMS预聚物中的气泡。用干燥箱在65℃下加热烘干120min后冷却至室温，将固化后的PDMS切片，从硅片上轻轻揭下；
(13)利用打孔器在PDMS入口和出口的位置进行打孔。打孔后的芯片用异丙醇、酒精、去离子水分别超声清洗4min，氮气吹干，备用；
(14)将清洗过的芯片与玻片一起经过氧等离子照射后快速对准贴合完成芯片制作。
实验例3用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片的修饰方法
在本实例中，循环肿瘤细胞以乳腺癌细胞MCF-7细胞为例，芯片的修饰步骤如下：
(1)首先，在键合好的PDMS密闭流道中预先通入硅烷化偶联剂APTMS：水：甲醇体积比例为1:1:3的硅烷化混合溶液，使得流道表面实现硅烷化从而易于与纳米金颗粒进行偶联；
(2)将纳米金胶体(可通过柠檬酸钠还原法制备)持续通入流道中，金颗粒在缓慢的流道过程中不断沉积于流道，从而在预处理后的流道表面形成一层颗粒均匀、致密分布的纳米金层；
(3)将11-巯基十一烷酸(MUA)和6-硫基-1-己醇(MCH)以1:3的比例溶解于乙醇中并持续通入流道中，通过硫化作用均匀地自组装于金颗粒表面，从而在金表面功能化一层分子膜；
(4)将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的纯水溶液持续通入流道中，通过NHS和EDC的联用，进一步高效活化MUA尾部的羧基为胺活性酯，以利于后续抗体的连接；
(5)将可与上皮细胞粘附分子(EpCAM)结合的抗体的1xPBS溶液通入流道中，该抗体可以特异性识别多数循环肿瘤细胞，并可与活化后的NHS的酯基产生稳定的酰胺键而被牢固地固定在流道表面；
(6)将PH＝8.5的乙醇胺溶液通入流道中以除去多余的羧基。
实验例4用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片的捕获和释放方法
在本实例中，循环肿瘤细胞以乳腺癌细胞MCF-7细胞为例，具体是细胞捕获和释放过程如下：
(1)将培养箱中培养的乳腺癌细胞MCF-7细胞经消化作用后制成以PBS缓冲液为溶剂的单细胞悬液(细胞浓度约为1.25×106cells/mL)备用；
(2)进行通液试验时，将细胞样本以10μL/min的流速通入流道中，在细胞充满流道后停止通液并孵育10-12min以利于细胞被充分捕获；
(3)进行释放实验时，将胰蛋白酶通入流道中并在出口处收集释放后细胞的容器中预先放有带有10％胎牛血清(FBS)和1％双抗(PS)的DMEM培养基以避免因胰蛋白酶长时间作用对于细胞表面产生的不可逆伤害。
结果如图3-4所示，修饰有抗体的芯片对细胞的捕获效率可达到90％以上。同时，相较于单纯通PBS来释放细胞的方法，经胰蛋白酶孵育12分钟以上后释放效率也从30％左右大大提升至90％以上，体现了胰蛋白酶的高效释放能力。最后，经胰蛋白酶处理的细胞仍保持着较高的活性，可进行后续的贴壁生长和增殖分化，其表面的蛋白也在12小时后完全恢复。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于循环肿瘤细胞高效捕获及释放的双层脉状功能化微流控芯片，包括基底和流道层，所述流道层设置入口和出口，其特征在于，所述流道层分为上下两层，
下流道层包括设置N条并行的蛇形流道；
上流道层包括构建在每条所述蛇形流道之上的上层流道；
所述上层流道的走向和宽度与之相应的蛇形流道相同，所述上层流道的内壁设有向外的凸起，所述凸起间隔设置，使上层流道内的通道呈现为非对称的叶脉状通道；
所述入口和出口分别与所述蛇形流道相连。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述蛇形流道的通道宽度为300-500μm，蛇形弯曲部分的弯曲角度为120°-150°，流道高度为50μm-100μm。
3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述蛇形流道中的一个弯曲单元的内弦长度为500μm-650μm，外弦长度为840μm-1000μm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述上层流道的叶脉状通道的主通道的宽度为30-50μm，叶脉状通道的侧道的宽度为30-50μm，侧道与主通道的夹角为120°-150°；同侧相邻侧道之间的距离为30-100μm，主通道两侧的侧道交叉非对称分布，所述上层流道的高度为30-50μm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述基底与流道层互相键合封装而成，所述流道层的材料为聚二甲基硅氧烷、环烯烃类共聚物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的一种或几种；所述基底为二氧化硅、硅片或硅化玻璃。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，还包括对流道层的流道内表面进行修饰，所述修饰包括：
对流道内表面进行硅烷化修饰；然后修饰金颗粒层，并在所述金颗粒层上修饰功能基团。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，所述功能基团为硫基分子，或者进一步活化所述硫基单分子之上的羧基。
8.根据权利要求1-7任一项所述的微流控芯片，其特征在于，在所述流道层的通道内表面修饰抗体或适配体。
9.权利要求1-8任一项所述的微流控芯片在循环肿瘤细胞捕获中的应用。
10.一种循环肿瘤细胞捕获的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞悬浮液通入权利要求1-8任一项所述的微流控芯片的流道中，在细胞充满流道后停止通液，孵育；
释放时，将胰蛋白酶通入流道中，孵育，并在出口处收集释放后细胞。
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CN110093254A (zh) * 2019-06-06 2019-08-06 上海海洋大学 一种用于快速捕获或检测细胞的微流控芯片及方法
CN210030640U (zh) * 2018-12-11 2020-02-07 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 用于全血中稀有细胞筛选的微流控芯片

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