CN112021315A - 一种非治疗目的的杀灭细菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，所述方法是在含有待灭细菌的菌液中加入辅助剂，得到菌液处理液，所述辅助剂为吲哚、2‑甲基吲哚或5‑甲基吲哚，然后将所述菌液处理液进行摇床培养。采用本发明的方法可以大幅度杀灭多种细菌，将有效降低细菌产生耐药的风险，且随着处理时间的延长，杀菌效果越好。

Description

一种非治疗目的的杀灭细菌的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种非治疗目的的杀灭细菌的方法。
背景技术
细菌耐药是目前全球面临的重大公共健康问题，也是造成慢性感染和治疗后感染复发的主要原因。细菌耐药威胁着人类生命安全健康，是造成人类财产损失的重要因素，在动物源性细菌中，细菌的耐药性也造成兽医公共卫生的重大挑战。从第一例抗生素青霉素的发现以来，70多年间，抗生素一直是临床上用于治疗细菌感染的关键药物。但长期使用抗生素诱导细菌产生耐药性，抗生素的滥用也使得耐药性日渐严重，造成耐药菌株甚至是“超级细菌”的出现。由于细菌对多种抗生素产生耐药性，导致能治疗耐药菌感染的药物越来越少。原有抗生素的杀菌效力降低，新抗生素开发难度大、时间长，过去30年间FDA批准上市的新抗生素降低了90％，因此从现有化合物中筛选出具有广谱抗菌活性的药物至关重要。
随着抗生素在全球范围内的广泛使用，抗生素的滥用造成耐药菌感染的情况逐年增加。近年来，相继有报道称耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐多药肺炎链球菌造成院内感染的情况逐年增加。金黄色葡萄球菌可引起慢性和复发性感染，包括骨髓炎、心内膜炎和复发性脓肿等。除金黄色葡萄球菌外，多种革兰氏阳性菌是致病菌，如粪肠球菌，化脓性链球菌，表皮葡萄球菌等。革兰氏阴性细菌中大肠杆菌为条件致病菌，结核分枝杆菌可感染宿主细胞形成结核结节。肺炎克雷伯菌常引起呼吸道感染、尿路感染、肝/胆道感染、败血症、脑膜炎和腹膜炎。多药耐药的铜绿假单胞菌不仅对β-内酰胺类抗生素耐药，而且对碳青霉烯类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素也有广泛的耐药性。这种多药耐药的铜绿假单胞菌极易感染血液系统，以及骨髓或器官移植等免疫功能高度低下的患者，最终导致败血症和肺炎，难以治愈。此外，志贺氏菌是人类肠道疾病中最常见的病原菌，可引起腹泻等多种疾病。因此，寻找新型具有广谱杀菌活性的抗菌剂杀灭病原菌是很有必要的。
吲哚是一种芳香杂环化合物，其结构由一个苯环和一个吡咯环并合而成，既是化学合成的中间体，也是一类广泛用于医药、农药、香料染料等领域的添加剂。作为化学药物的结构骨架，以吲哚为核心开发出众多具有高活性的化合物，如抗菌，抗病毒、镇痛、抗肿瘤等。2003年上市的达托霉素是以吲哚为核心开发的抗感染药物，可治疗复杂性皮肤和皮肤结构感染，也可治疗由金黄色葡萄球菌引起的血液感染。因此以吲哚为核心合成的其他吲哚类化合物也可能具有杀菌作用，筛选其他吲哚类化合物测试其抗菌活性是寻找新型抗菌剂途径之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非治疗目的的杀灭细菌的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，在含有待灭细菌的菌液中加入辅助剂，得到菌液处理液，所述辅助剂为吲哚、2-甲基吲哚或5-甲基吲哚，然后将所述菌液处理液进行摇床培养。
所述摇床培养温度为37℃，时间为1-5小时。
所述辅助剂在菌液处理液中的终浓度为1mM-8mM。
所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、MRSA、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、化脓性链球菌中的一种，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌中的一种。
实验证明，利用本发明的方法可以杀灭多种细菌。针对金黄色葡萄球菌，5mM 2-甲基吲哚与5mM 5-甲基吲哚的杀菌效率为3个数量级；7mM 2-甲基吲哚与6mM 5-甲基吲哚的杀菌效率为6个数量级，针对MRSA，8mM 2-甲基吲哚与7mM 5-甲基吲哚均能达到3个数量级杀菌效率；其他类型细菌经此方法处理后，特别是经5-甲基吲哚处理后均有不同程度的杀伤。由此表明，利用本发明的方法可以杀灭多种细菌，且5-甲基吲哚具有广谱杀菌活性。
附图说明
图1为吲哚及其衍生物的添加浓度与存活菌落数之间的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，MRSA(ATCC43300)，表皮葡萄球菌(CMCC26069)，粪肠球菌(ATCC29212)，化脓性链球菌(ATCC19615)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(BW25113)，铜绿假单胞菌(PAO1)，志贺氏菌(24T7T)，肺炎克雷伯菌(KP-D367)，结核分枝杆菌(ATCC25177)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1吲哚、2-甲基吲哚、5-甲基吲哚作为杀菌剂杀灭不同种类细菌
1、活化细菌：金黄色葡萄球菌ATCC 25923(S.aureus ATCC 25923)，吸取保存于-80℃冰箱中的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的20％甘油菌液1μl，加至1ml LB液体培养基中，于37℃摇床(250rpm)培养到平台期，将得到的菌液稀释1000倍后接种于50ml LB液体培养基中，37℃摇床(250rpm)培养到平台期(24h)，得到金黄色葡萄球菌培养液。
2、用二甲亚砜(DMSO)分别配制吲哚、2-甲基吲哚和5-甲基吲哚的母液浓度为1M，再用DMSO稀释母液配置配制工作液浓度为200mM，整个配制过程应避光。
3、取37.5ml步骤1得到的平台期金黄色葡萄球菌培养液，分装于75个无菌玻璃管中，每管分装有500μl菌液；
将这75个装有菌液的玻璃管随机分为4组，即空白组、吲哚组、2-甲吲哚基组、5-甲基吲哚组；
空白组3个装有菌液的玻璃管记为A1、A2和A3；
向吲哚组中的每个玻璃管中添加吲哚，吲哚在菌液中的含量设置浓度为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM；每个浓度均设置3个玻璃管，将3个玻璃管分别记为I-X-1，I-X-2和I-X-3(X为相应吲哚浓度，如1mM吲哚三组平行试验，分别标记为I-1-1，I-1-2和I-1-3)；
向2-甲基吲哚组中的每个玻璃管中添加2-甲基吲哚，2-甲基吲哚在菌液中的含量设置浓度为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM；一个浓度3个玻璃管，将3个玻璃管分别记为2MI-X-1，2MI-X-2和2MI-X-3(X为相应吲哚浓度，如1mM 2-甲基吲哚三组平行试验，分别标记为2MI-1-1，2MI-1-2和2MI-1-3)；
向5-甲基吲哚组中的每个玻璃管中添加5-甲基吲哚，5-甲基吲哚在菌液中的含量设置浓度为1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM；一个浓度3个玻璃试管，将3个离心管分别记为5MI-X-1，5MI-X-2和5MI-X-3(X为相应吲哚浓度，如1mM 5-甲基吲哚三组平行试验，分别标记为5MI-1-1，5MI-1-2和5MI-1-3)。
4、将步骤3的玻璃管置于37℃，250rpm摇床中避光孵育3h。
5、将避光孵育3h后的菌液取出，取100ul菌液离心(10000g，2min)，去除上清液，然后用100μl的100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体，洗涤两次后，再利用100μl的100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)重悬菌体。
6、步骤5完成后，将得到的菌液按照每次10倍的梯度用100mM灭菌磷酸盐缓冲液(pH为7.4)稀释，稀释梯度为10、102、103、104、105，每个稀释度取4μl菌液点滴在LB固体培养基六方格平板上，置于37℃温箱培养12小时后，观察细菌死亡情况，进行菌落计数，计算金黄色葡萄球菌经处理后的存活率，并绘制辅助剂浓度-存活菌落数曲线。
7、重复上述步骤3、步骤4、步骤5、步骤6三次，取三组实验存活菌落数平均值，计算金黄色葡萄球菌经处理后的存活率，并绘制辅助剂浓度-存活菌落数曲线。
8、其他种类细菌处理步骤同上；除粪肠球菌(ATCC29212)使用MRS培养基外，其他9个种类细菌均使用LB培养基。使用LB培养基的革兰氏阳性细菌为：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，MRSA(ATCC43300)，表皮葡萄球菌(CMCC26069)，化脓性链球菌(ATCC19615)；使用LB培养基的革兰氏阴性细菌为：大肠杆菌(BW25113)，铜绿假单胞菌(PAO1)，志贺氏菌(24T7T)，肺炎克雷伯菌(KP-D367)，结核分枝杆菌(ATCC25177)。
结果如图1、表1和表2所示。
表1杀灭99.9％的细菌所用辅助剂的浓度
Figure BDA0002688096070000041
表2杀菌至检测下限所用辅助剂的浓度
Figure BDA0002688096070000042
注：杀菌效率＝1-经杀菌剂处理后的存活菌落数/未经杀菌剂处理的存活菌落数
杀菌效率为99.9％所用杀菌浓度为：杀菌效率刚好大于99.9％相应的杀菌剂浓度。
杀菌至检测下限所用杀菌剂的浓度为：杀菌效率达99.9999％相应的杀菌剂浓度。
结果显示，将辅助剂(吲哚及其衍生物)加入到菌液中处理3h，与未添辅助剂相比，5mM的2-甲基吲哚与5-甲基吲哚可将金黄色葡萄球菌的死亡率提高3个数量级。进一步增加辅助剂浓度，7mM 2-甲基吲哚与6mM 5-甲基吲哚可将平台期金黄色葡萄球菌杀灭至检测下限。从上表可知，不同种类的细菌对吲哚及其衍生物的敏感性不同，杀灭3个数量级所用的辅助剂浓度不同。三种杀辅助剂的杀菌效率分别为吲哚>2-甲基吲哚>5-甲基吲哚，未添加辅助剂组没有明显杀菌效果。

Claims (5)

1.一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，其特征在于：在含有待灭细菌的菌液中加入辅助剂，得到菌液处理液，所述辅助剂为吲哚、2-甲基吲哚或5-甲基吲哚。
2.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，其特征在于：将所述菌液处理液进行摇床培养。
3.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，其特征在于：所述摇床培养温度为37℃，时间为1-5小时。
4. 根据权利要求1所述的一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，其特征在于：所述辅助剂在菌液处理液中的终浓度为1 mM -8mM。
5.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的杀灭细菌的方法，其特征在于：所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、MRSA、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、化脓性链球菌中的一种，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌中的一种。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110585198A (zh) * 2019-05-27 2019-12-20 中国海洋大学 吲哚在制备抑制黄单胞菌科细菌抗生素耐药性药物中的应用

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