CN112014453A - 一种基于环形变构dna电化学反应检测微囊藻毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，该方法将DNA探针连接在金电极上，然后将中间插入微囊藻毒素适配体的环状DNA序列与金电极上的DNA探针混合孵育形成复合物；其中，环形DNA序列的两个末端分别与金电极上的DNA探针互补；加入样品溶液与复合物进行共孵育，然后依次加入T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶，再通过检测加入离子后金电极的电流信号的强弱，实现对目标物的定量检测。本方法制备简单，反应快速，对样品的要求不高，具有较高的灵敏度和特异性，有利于快速的检测出微囊藻毒素的含量。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析检测方法，更具体为一种基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法。
背景技术
氮和磷等营养元素污染可引起水体富营养化，使藻类疯狂增长，形成水华。这些藻类可产生大量的藻毒素。其中微囊藻毒素(MC-LR)分布最广，毒性最强，这使得其严重威胁到人类的生命健康。核酸适配体在生物传感器研究中具有广阔的应用前景。核酸适配体是一种短的单链核酸，能与目标分子紧密结合，具有很高的灵敏度。与抗体相比，适配体具有合成简单、易于操作、批间一致性好、易于标记、成本低、稳定性高等优点。而通过巧妙的设计DNA，在外界的刺激下使得DNA探针的构象发生变化，这种变构DNA可以催化接下来的反应。研究表明，这种变构探针的特异性强，可以降低电化学反应中由于非特异性变构引起的假阳性反应。
电化学在生物传感方面具有小型化、设备简单、操作方便、成本低廉等优点，这使得其成为生物分析中一种很有吸引力的方法。通常，电化学DNA传感器是通过一些离子的氧化还原反应，而引发的电流的变化。这种方法根据离子发生氧化还原的量来引发电流的变化，产生不同的电流。根据所产生的电流的量来判断目标物的含量。
现有微囊藻毒素的分析检测方法繁琐，花费时间较长，而且最终的实验结果可能会出现假阳性反应，所以需要进一步探索分析方法。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种简便快速的检测微囊藻毒素的方法，利用含有微囊藻毒素的适配体序列DNA作为识别和启动滚环扩增的反应元件，通过微囊藻毒素诱导环形DNA模板的变构，来调控滚环扩增反应，最后，根据[Fe(CN)6]3-/4-阴离子发生的氧化还原产生的电流量判断微囊藻毒素的含量。
技术方案：本发明所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，将DNA探针连接在金电极上，然后将中间插有微囊藻毒素适配体的环状DNA序列与金电极上的DNA探针混合孵育形成复合物；其中，环形DNA序列的两个末端分别与金电极上的DNA探针互补；加入样品溶液与复合物进行共孵育，然后依次加入T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶，再通过检测加入离子后金电极的电流信号的强弱，实现对目标物的定量检测。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，具体包括如下步骤：
a)将5’端修饰有巯基的DNA探针，加入缓冲液1中，避光室温下共孵育，还原二硫键；
b)将得到的探针溶液与金电极在黑暗条件下进行孵育2-4h；
c)将b)所得产物浸没于11-巯基-1-十一醇溶液中进行过夜钝化；
d)将含有环形DNA的溶液与c)所得溶液混合孵育20-40min，制备复合物，称为电化学传感器；
e)将上述制得的传感器浸没于缓冲液1中，去除电极上未结合的DNA以及其他分子；
f)将含有不同浓度的目标物的样品溶液与该电化学传感器进行共孵育20-50min；
g)加入T4 DNA连接酶，与电极表面的DNA复合物在缓冲液2共孵育20-40min；
h)将上述制得的传感器与Phi29 DNA聚合酶浸没于缓冲液3中，在20-30℃的条件下反应；
i)在电极表面加入[Fe(CN)6]3-/4-以及KCl，孵育20-30min；
j)使用微分脉冲伏安法在0.05-0.23的电压范围内，以5-15mV的电势下，经过20-30ms的脉冲时间测量不同样品的电流；
k)根据[Fe(CN)6]3-/4-阴离子发生的氧化还原产生的电流量判断目标物的含量。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法：
DNA探针的序列：5’HS-GCTGGAAGCCGAAGGTCG-3’
环状DNA序列：5’P-GCTTCCAGCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGCCGACCTTCG-3’
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，所述缓冲液1为含有三(2-羰基乙基)磷盐酸盐TCEP的Tris-HCl缓冲液。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，所述缓冲液2含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT，pH 7.2-7.7。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，所述缓冲液3含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT，pH 7.2-7.7。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，步骤k)通过绘制测得的电流与电势的关系图来计算。
所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法在检测微囊藻毒素中的应用。
当没有目标物存在时，加入T4 DNA连接酶，使得上述复合物形成闭合结构，在Phi29DNA聚合酶的作用下，滚环扩增反应被激活，由于电极被扩增产物所遮盖，使得[Fe(CN)6]3-/4-阴离子很难到达金电极，难以发生氧化还原反应，最终产生的电流信号很低；然而，当含有目标物微囊藻毒素时，由于适配体与目标物之间的高度亲和力使得所形成的复合物被破坏，最终金电极表面只存在一条短核酸片段，由于大部分的电极被暴露出来，探针构象发生变化，使得滚环扩增无法启动，使得[Fe(CN)6]3-/4-阴离子很容易到达电极，氧化还原反应，使得电流大幅度的增加，如图1所示。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：1、能够克服现有分析检测方法繁琐与耗时的缺点，使得整个检测快速完成并且可以在温和环境下完成，节约了检测人员的时间和精力；2、借助变构DNA探针与滚环扩增相结合的策略，不仅使得检测的灵敏度和选择性大幅度增强，而且该策略节约时间，反应器较为稳定，检测范围达到40pM到1000nM，此外检测限达到了13pM；3、采用变构DNA探针与滚环扩增以及电化学方法相结合，充分发挥了适体的强大识别能力，滚环扩增的信号放大能力以及电化学传感器的操作方便、成本低廉等优点，这无疑对生物分析具有重要的效益价值，在资源贫乏地区或者环境不好的地区，非常适用。
附图说明
图1是该方法的整个策略图；
图2是该方法在含有不同浓度的样品中的电流变化量与浓度的关系图；
图3是该方法的特异性检测，在相同条件下分别检测MC-LR的类似物的结果图。
具体实施方式
药品和试剂：实验中所使用的的所有DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。实验中所用到的缓冲液以及分析纯等均购自于国药集团化学试剂有限公司。
DNA探针的序列：5’HS-GCTGGAAGCCGAAGGTCG-3’
环状DNA序列：5’P-GCTTCCAGCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGCCGACCTTCG-3’
实施例1
(1)将10μL的巯基修饰过的DNA探针溶液混入10mM Tris-HCl缓冲液1中，其中包含：10μM TCEP、10mM EDTA、100mM NaCl，pH 7.4，在黑暗的室温下共孵育1小时，这一步的目的是为了还原二硫键。
(2)将得到的探针溶液与金电极在黑暗条件下进行孵育3h。
(3)将(2)所得产物浸没于10μL的2mM的11-巯基-1-十一醇溶液(11-MCD)中进行过夜钝化。
(4)将含有环形DNA的溶液与(3)所得溶液混合孵育30min，制备电化学传感器。
(5)将上述制得的传感器浸没于缓冲液1中，去除电极上未结合的DNA以及其他分子。
(6)分别取10μL浓度为0pM、60pM、300pM、1000pM、3000pM、10000pM、25000pM、50000pM、300000pM、600000pM、1000000pM、1600000pM的微囊藻毒素样品与该电化学传感器进行共孵育40min。
(7)接着加入5个单位的T4 DNA连接酶，与电极表面的DNA复合物在缓冲液2(50mM的Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM ATP、10mM DTT)共孵育30min。
(8)将上述制得的传感器与一个单位的Phi29 DNA聚合酶浸没于缓冲液3中(50mMTris-HCl、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT)，在25℃的条件下反应。
(9)在电极表面加入3mM[Fe(CN)6]3-/4-以及0.1M KCl，孵育30min。
(10)使用微分脉冲伏安法在0.1-1.2的电压范围内，以10mV的电势下，经过25ms的脉冲时间测量不同样品的电流；
结果：(6)中0pM、60pM、300pM、1000pM、3000pM、10000pM、25000pM、50000pM、300000pM、600000pM、1000000pM、1600000pM的微囊藻毒素样品分别依次对应样品1-12，结果如图2所示。
实施例2
本发明检测方法的选择性实验：重复实施实例1中的步骤，其它条件不变，检测荧光，得到本方法检测目标分子的选择性结果图，如图3所示，MC-LR为微囊藻毒素LR，MC-RR为微囊藻毒素RR，MC-YR为微囊藻毒素YR，从图中可以看出本发明所述方法对目标分子具有良好的选择性。
实施例3
本发明检测方法的回收率实验
根据[Fe(CN)6]3-/4-阴离子发生的氧化还原产生的电流量绘制测得的电流与电势的关系图计算，判断目标物的含量。将样品换成等量的去离子水，并向将样品中分别加入1000、10000、32000pM的微囊藻毒素，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表1。
表1.回收率实验
Claims (7)
1.一种基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，将DNA探针连接在金电极上，然后将中间插有微囊藻毒素适配体的环状DNA序列与金电极上的DNA探针混合孵育形成复合物；其中，环形DNA序列的两个末端分别与金电极上的DNA探针互补；加入样品溶液与复合物进行共孵育，然后依次加入T4 DNA连接酶和Phi 29 DNA聚合酶，再通过检测加入离子后金电极的电流信号的强弱，实现对目标物的定量检测。
2.根据权利要求1所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(a)将5’端修饰有巯基的DNA探针，加入缓冲液1中，避光室温下共孵育，还原二硫键；
(b)将得到的探针溶液与金电极在黑暗条件下进行孵育；
(c)将(b)所得产物浸没于11-巯基-1-十一醇溶液中进行钝化；
(d)将含有环形DNA的溶液与(c)所得溶液混合孵育，制备复合物，称为电化学传感器；
(e)将上述制得的传感器浸没于缓冲液1中，去除电极上未结合的DNA以及其他分子；
(f)将含有不同浓度的目标物的样品溶液与该电化学传感器进行共孵育；
(g)加入T4 DNA连接酶，与电极表面的DNA复合物在缓冲液2共孵育；
(h)将(g)所得产物与Phi29 DNA聚合酶浸没于缓冲液3中，在20-30℃的条件下反应；
(i)在电极表面加入[Fe(CN)6]3-/4-以及KCl，孵育；
(j)使用微分脉冲伏安法，经过20-30ms的脉冲时间测量不同样品的电流；
(k)根据[Fe(CN)6]3-/4-阴离子发生的氧化还原产生的电流量判断目标物的含量。
3.根据权利要求1所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于：
DNA探针的序列：5’HS-GCTGGAAGCCGAAGGTCG-3’
环状DNA序列：5’P-GCTTCCAGCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGCCGACCTTCG-3’。
4.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述缓冲液1为含有三(2-羰基乙基)磷盐酸盐TCEP的Tris-HCl缓冲液。
5.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述缓冲液2含有Tris-HCl、MgCl2、ATP、DTT，pH 7.2-7.7。
6.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，所述缓冲液3含有Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4、DTT，pH 7.2-7.7。
7.根据权利要求2所述的基于环形变构DNA电化学反应检测微囊藻毒素的方法，其特征在于，步骤(k)通过绘制测得的电流与电势的关系图来计算。
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