CN112011589A - 一种病原微生物显色剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脂质体技术领域，具体公开了一种病原微生物显色剂及其制备方法与应用。本发明的制备病原微生物显色剂的方法，所述病原微生物显色剂为羧基荧光素脂质体，所述羧基荧光素脂质体的制备原料包括胆固醇、TCDA和经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱；所述经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱、所述胆固醇和所述TCDA的摩尔比为4：(1.5‑2.5)：(2‑3)。本发明有效提高了细菌显色物质的保存时间，其结构稳定性高，制备简便，粒径小，显色效果稳定。

Description

一种病原微生物显色剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及脂质体技术领域，具体地说，涉及一种病原微生物显色剂及其制备方法与应用。

背景技术

人类生存的世界里，存在着很多肉眼看不到的微生物，如真菌、细菌等。公共场所的微生物污染是普遍而严重的，调查和试验表明，污染在环境表面和公共用品上的微生物不仅可以存活，而且可以存活很长时间，这就为致病性微生物的传播提供了机会。此外，人体伤口初期，微生物含量通常会维持在一个很低的水平，较低的微生物含量不会明显阻碍伤口的愈合，这种情况一般不需要临床干预治疗，但随着微生物的繁殖，尤其是致病菌的扩大繁殖，当微生物数量增加到宿主不能通过自身免疫进行清除时，组织就会被侵袭，临床感染开始。因此，抓好环境和伤口微生物的控制是预防传染病和临床感染的重要措施。

目前公共场所的消毒方式主要是通过定期、定时的方式进行，大多数未对消毒后的物品和空气进行取样检测，存在消毒不彻底和消毒时效未知等缺点，进而增加了公共区域传染疾病的风险。不同的公共场所，存在人流量的区别，同一公共场所也存在不同时间段人流量不同的差异，因此用同一种消毒方式进行公共场所的消毒，必然存在有些场所消毒产品使用过度，造成消毒产品的严重浪费；而有些区域反而存在消毒不彻底和不及时的现象。而对于伤口，目前临床上鉴定细菌感染的方法通常是使用棉签刮取伤口分泌物进行培养，然后鉴别伤口处的细菌种类和数量，这种方法不仅耗时(24～48h)，而且受限于医务人员的专业知识与技能，对于非医院产生的伤口，不能及时辨别微生物的生长情况，增加了临床感染的风险。

因此，提供一种可有效显示出病原微生物数量的方法对于指导消毒杀菌很有必要。2015年巴斯大学报道了一种细菌显色敷料的制备方法，2018东华大学在巴斯大学研究的基础上对细菌显色物质进行了进一步的研究，虽然在细菌显色物质制备过程中增加了一些稳定剂，但稳定性仍然达不到商业应用的标准。

因此，有必要提供一种新的病原微生物显色剂来解决现有技术的问题。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种稳定性佳、粒径小的病原微生物显色剂。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种制备病原微生物显色剂的方法，所述病原微生物显色剂为羧基荧光素脂质体，所述羧基荧光素脂质体的制备原料包括胆固醇、TCDA和经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱；所述经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱、所述胆固醇和所述TCDA的摩尔比为4:(1.5-2.5)：(2-3)。

本发明对脂质体类细菌显色物质进行了大量研究，发现其整体稳定性差，保质期短。虽然现有技术中有通过添加稳定剂以改善脂质体稳定性的方案，但其稳定性的提升有限，仍无法满足市场商品化需求。为此，本发明进行了多方探索，最终发现当将作为脂质体制备主要原料之一的二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)先进行氧化，再与胆固醇和TCDA(10,12-三聚二烯酸)以特定比例配合，可既使得后续加入的羧基荧光素与DPPC发生紧密交联，又可不因改变了DPPC的亲水亲油性，而影响其与胆固醇和TCDA的成膜反应，制备得到的羧基荧光素脂质体更加稳定，在使用中破裂显色效果理想。

本发明中所述的病原微生物为能分泌外毒素的病原微生物，例如，可为能分泌外毒素的真菌或细菌。所述外毒素为溶血素、脂酶等可裂解脂质体的蛋白质。

本发明中，所述羧基荧光素脂质体的制备原料还包括羧基荧光素，所述经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱与所述羧基荧光素的摩尔比为1：(0.05-0.1)，优选为1：0.05，既可以使荧光素与氧化后的DPPC充分交联，达到预期的显色效果，又不会造成原料的浪费。

所述羧基荧光素为5-羧基荧光素、6-羧基荧光素或5，6-羧基荧光素中的一种或多种。

本发明对DPPC的氧化方式进行了进一步研究，发现当采用酸性氧化剂，尤其是高锰酸钾、高氯酸、过氧化氢或硝酸时综合效果优于其他氧化剂。尤其是当采用弱氧化剂进行DPPC改性时，荧光素与其的交联效果不佳，进而明显影响产品的稳定性。

从而本发明中，用于氧化所述二棕榈酸磷脂酰胆碱的氧化剂选用高锰酸钾、高氯酸、过氧化氢或硝酸中的一种或多种。

本发明中，所述氧化剂与所述二棕榈酸磷脂酰胆碱的摩尔比为1：(50-100)，既可以有效的进行氧化，对DPPC进行充分改性，以获得足够的预期产物，又不会有氧化剂残留问题。

本发明中，在制备所述病原微生物显色剂时，先进行二棕榈酸磷脂酰胆碱的氧化，所述氧化在超声震荡下进行，反应温度为-4℃-0℃，超声震荡的时间为4-8h，超声震荡的功率为800-1200W。

本发明特别对DPPC的氧化步骤进行了研究，发现当对氧化反应进程进行特定控制后(具体采用特定低温条件，配合特定强度的超声震荡)，可以使DPPC上的氧化改性位点均匀分布，避免过于集中，且又可使得氧化反应充分进行，进而提升后续产品的稳定性。

本发明中，将经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱与胆固醇、TCDA混合、干燥成膜后，与羧基荧光素的溶液混合震荡，在微波加热下进行交联。优选，微波功率为500-900W，交联时间为10-12min。本发明中交联反应的溶剂可为水或低浓度(40～60mmol/L)的乙醇溶液或PBS缓冲溶液。

本发明当采用上述反应条件时，可使得DPPC与荧光素更易发生紧密的交联反应，均一性好，交联时间短，效果好，提高了产品的结合度、均一性和稳定性。

本发明中，在所述交联后，通过电喷雾法制备所述病原微生物显色剂；电喷雾时，施加电压为10-12kV，接收距离为10-20cm。

本发明还提供一种病原微生物显色剂，其由上述方法制备得到。

优选，所述病原微生物显色剂的粒径为70-100nm。

本发明另提供一种上述病原微生物显色剂在病原微生物检测中的应用，所述病原微生物为能分泌外毒素的细菌或真菌。

本发明在应用时，将病原微生物显色剂喷洒到需要控制微生物数量的物体或伤口表面，当病原微生物含量达到一定数量(其分泌的外毒素足以使脂质体破裂)时，物体或伤口表面会显示颜色，颜色亮度会随微生物的数量增加而增加，当使用消毒和抑菌产品后，微生物的数量降低，荧光亮度会随之降低，从而，负责公共场所消毒的工作人员可根据显色剂的颜色辨别是否需要进行消毒；受伤人员或医务人员可以根据颜色变化确认是否需要使用抑菌产品或进行其他临床干预。本发明可以有效的反映病原微生物的数量，从而指导消毒作业，减少消毒产品的过度使用，解决消毒不彻底和消毒不及时等问题，进而能有效的预防传染病的传播；且也可用于观察伤口的感染情况，为伤口得到及时有效的处理提供依据，既避免了药物滥用带来的危害，也减少了因为伤口处理不及时导致的感染。此外，显色剂的使用间接反应了公共场所的安全状况，可增加人们的安全感。

本发明的有益效果至少在于：

针对现有技术细菌显色物质稳定性差的问题，本发明提供了一种稳定性高，制备简便，粒径小，显色效果稳定的病原微生物显色剂，改善了细菌显色物质实际应用的局限性，有效提高了细菌显色物质的保存时间，为工业生产和实际应用提供了技术支撑。

本产品适用于公共场所和公共用品卫生服务单位，也适用于家庭室内物品和表皮伤口。具体可适用于：医疗卫生机构内的公共场所和公共用品、文化娱乐场所、浴业服务单位、宾馆、饭店、酒吧、茶馆、公共交通工具和环境、购物场所、社区活动场所、学校、图书馆和书店、幼托机构、体育场所和公共健身器材、美发美容店、擦伤、烫伤等。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供了一种本发明的病原微生物显色剂及其制备方法。

具体制备步骤如下：

用50％乙醇配制100mmol/L的DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)，取400μl，加50μl0.2％高锰酸钾溶液，反应温度-4℃；超声震荡，超声功率800W；反应时间5h，反应结束恢复至室温后添加200μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)胆固醇和300μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)TCDA混合，通过旋转蒸发的方式进行干燥成膜，然后加入80μl含有40mmol/L 5-羧基荧光素的PBS缓冲液，充分震荡混合，通过微波加热进行交联，微波功率500W，交联时间为10min；将交联后的样品放入连接高压发生器装置的容器里，施加10kV电压，在距离15cm处接收，将接收的显色物质放入1％的甘油溶液中保存。

实施例2

本实施例提供了一种本发明的病原微生物显色剂及其制备方法。

具体制备步骤如下：

用50％乙醇配制100mmol/L的DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)，取400μl，加50μl0.1％高氯酸溶液，反应温度0℃；超声震荡，超声功率1000W；反应时间4h，反应结束恢复至室温后添加200μl(100mmol/L用50％乙醇配制)胆固醇和300μl(100mmol/L用50％乙醇配制)TCDA混合，通过旋转蒸发的方式进行干燥成膜，然后加入50μl含有40mmol/L 6-羧基荧光素的PBS缓冲液，充分震荡混合，通过微波加热进行交联，微波功率900W，交联时间为10min；将交联后的样品放入连接高压发生器装置的容器里，施加10kV电压，在距离15cm处接收，将接收的显色物质放入1％的甘油溶液中保存。

实施例3

本实施例提供了一种本发明的病原微生物显色剂及其制备方法。

具体制备步骤如下：

用50％乙醇配制100mmol/L的DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)，取400μl，加50μl0.3％过氧化氢溶液，反应温度0℃；超声震荡，超声功率1000W；反应时间6h，反应结束恢复至室温后添加200μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)胆固醇和300μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)TCDA混合，通过旋转蒸发的方式进行干燥成膜，然后加入80μl含有40mmol/L 5-羧基荧光素的PBS缓冲液，充分震荡混合，通过微波加热进行交联，微波功率500W，交联时间为10min；将交联后的样品放入连接高压发生器装置的容器里，施加10kV电压，在距离15cm处接收，将接收的显色物质放入1％的甘油溶液中保存。

实施例4

本实施例提供了一种本发明的病原微生物显色剂及其制备方法。

具体制备步骤如下：

用50％乙醇配制100mmol/L的DPPC(二棕榈酸磷脂酰胆碱)，取400μl，加50μl0.5％硝酸溶液，反应温度0℃；超声震荡，超声功率1200W；反应时间8h，反应结束恢复至室温后添加200μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)胆固醇和300μl(100mmol/L，用50％乙醇配制)TCDA混合，通过旋转蒸发的方式进行干燥成膜，然后加入50μl含有40mmol/L 6-羧基荧光素的PBS缓冲液，充分震荡混合，通过微波加热进行交联，微波功率500W，交联时间为10min；将交联后的样品放入连接高压发生器装置的容器里，施加10kV电压，在距离15cm处接收，将接收的显色物质放入1％的甘油溶液中保存。

对比例1

本对比例按照实施例1的方法进行病原微生物显色剂的制备，区别仅在于，DPPC溶液的用量为550μl，氧化后的DPPC、胆固醇和TCDA的摩尔比为5.5:2:2.5，5-羧基荧光素的添加量对应调整为100μl。

对比例2

本对比例按照实施例2的方法进行病原微生物显色剂的制备，区别仅在于，用于氧化DPPC的氧化剂改为50μl0.1％的次氯酸。

对比例3

本对比例按照实施例3的方法进行病原微生物显色剂的制备，区别仅在于，氧化DPPC时在常温条件下进行。

对比例4

本对比例按照实施例4的方法进行病原微生物显色剂的制备，区别仅在于，交联荧光素时未进行微波处理。

实验例1

本实验例对实施例1-4制备得到的显色剂微球的粒径进行了测试。具体用激光粒径仪测定微球粒径分布。

用激光测定仪测量的微球粒径及累计数据见表1。

表1

实施例	粒径范围(nm)
		1	70～90
2	80～100
		3	70～90
4	70～90

根据表1可知，本发明显色微球的粒径集中在100nm以下，粒径相对较小。

实验例2

本实验例对实施例1-4、对比例1-4制备得到的显色剂微球的完整性进行测定。

具体对显色剂微球刚制备完成(放置前)和常温放置一个月后，微球的完整性进行测定。测定方法为：用显微镜观察，多个视野中微球的完整性，每个实施例、对比例产品的总观察数量分别为100个微球(每个视野中微球数量为10个，共观察10个视野)，具体数据见表2。完整度＝每个视野中完整的微球数量之和/总观察数量*100％。

表2

根据表2可知，室温放置一个月后，本实施例1-4的微球破损率增加的极少，本发明通过优化制备工艺，有效提高了产品常温下的稳定性。对比例1、2、3、4，由于工艺上的差异，稳定性都有不同程度的减弱。

实验例3

本实验例对实施例1-4、对比例1-4制备得到的显色剂微球的放置后的显色效果进行测定。

用相同浓度的微生物与常温保存一个月的显色剂相互作用，用多功能酶标仪测量保存前后荧光强度的差异，用以证明显色剂的显色效果稳定性。

选取的细菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌。用接种环刮取单菌落于100mL相应的培养基中，37℃、120r/min振荡培养24h。各取1个月保存前后的显色剂50μL与150μL细菌混合液(三种菌液体积比为1:1:1)混合均匀，移入96孔板中，孵育60min后用多功能酶标仪测定518nm处的荧光强度，其中显色剂作为阴性对照组。每个样品重复6次，测平均值，结果见表3。

表3

通过表3可知，实施例1-4放置一个月的显色剂显色效果与未放置的无明显差异，本发明制备的显色剂稳定性较好；对比例1-4由于微球完整性有不同程度的破损，所以荧光强度也相对减弱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种制备病原微生物显色剂的方法，所述病原微生物显色剂为羧基荧光素脂质体，其特征在于，所述羧基荧光素脂质体的制备原料包括胆固醇、TCDA和经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱；所述经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱、所述胆固醇和所述TCDA的摩尔比为4：(1.5-2.5)：(2-3)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述羧基荧光素脂质体的制备原料还包括羧基荧光素，所述经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱与所述羧基荧光素的摩尔比为1：(0.05-0.1)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于氧化所述二棕榈酸磷脂酰胆碱的氧化剂为高锰酸钾、高氯酸、过氧化氢或硝酸中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氧化剂与所述二棕榈酸磷脂酰胆碱的摩尔比为1：(50-100)。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，在制备所述病原微生物显色剂时，先进行二棕榈酸磷脂酰胆碱的氧化，所述氧化在超声震荡下进行，反应温度为-4℃-0℃，超声震荡的时间为4-8h，超声震荡的功率为800-1200W。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，将经氧化后的二棕榈酸磷脂酰胆碱与胆固醇、TCDA混合、干燥成膜后，与羧基荧光素的溶液混合震荡，在微波加热下进行交联；优选，微波功率为500-900W，交联时间为10-12min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述交联后，通过电喷雾法制备所述病原微生物显色剂；电喷雾时，施加电压为10-12kV，接收距离为10-20cm。

8.一种病原微生物显色剂，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的方法制备得到。

9.根据权利要求8所述的病原微生物显色剂，其特征在于，所述病原微生物显色剂的粒径为70-100nm。

10.权利要求8或9所述的病原微生物显色剂在病原微生物检测中的应用，所述病原微生物为能分泌外毒素的细菌或真菌。