CN112005305A - 用于识别扰动因子与皮肤病症相关基因之间的关联的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种经改进的关联性映射方法，所述方法用于识别与实例相关联的潜在护肤剂和与皮肤色素沉着过度病症相关联的基因之间的关联。所述系统包括其上存储有多个实例的非暂态计算机可读介质，以及与皮肤病症相关联的偏向基因表达标记。所述偏向病症标记是通过基准标记过滤非偏向病症标记来构建的。

Description

用于识别扰动因子与皮肤病症相关基因之间的关联的系统和 方法
技术领域
本公开总体上涉及使用偏向关联性映射技术来识别潜在护肤剂的系统和方法。更具体地，本公开涉及通过用来自基准材料的基因表达标记数据来使转录基因选择偏向，从而提高用于识别潜在护肤剂的关联性映射技术的准确性。
背景技术
皮肤病症包括在发展中国家治疗的一些最常见的美容疾病，这已经形成数十亿美元的美容护肤行业。通常治疗的皮肤病症包括：细纹和/或皱纹，色素沉着过度，不均匀的皮肤色调，灰黄，暗沉，发红，阻隔性较差(例如，由于一层或多层皮肤变薄、弹性降低和/或回弹性降低)，毛孔粗大，油腻、发亮和/或暗沉的外观，粉刺，干燥，发痒，片状皮肤，以及剥落或脱屑不良。不同的皮肤病症与多种多样的触发因素、生物学机制、环境因素和临床表现相关联，这使得识别合适的活性剂和治疗方法的研究复杂化。例如，皮肤色素产生和分布的紊乱可以根据紫外线辐射暴露的强度和持续时间、生活方式习惯、实足年龄、内分泌功能和疾病状态而发生。
尽管进行美容治疗的皮肤病症普遍存在，并且为识别其原因开展了广泛的研究工作，但造成许多皮肤病症的潜在机制仍不清楚。特定病症的发病机理是多因素的并不罕见，并且与皮肤病症相关联的复杂病因可以受到每种病症独特的遗传因素和环境因素的组合的影响。因此，在本领域中持续需要能够帮助识别用于治疗特定皮肤病症的活性物质的系统和方法。
最近，已发现一种称为关联性映射或″CMap″的技术是用于识别新护肤活性物质的有用的高通量筛选工具。CMap是一种计算机模拟的假设生成和测试工具，用于将基因调节与活性剂联系起来。2000年，随着T.R.Hughes等人发表的开创性论文(″FunctionalDiscovery via a Compendium of Expression Profiles″Cell 102，109-126(2000))，此后不久由Justin Lamb等人发起的关联性映射项目(″Connectivity Map：Gene ExpressionSignatures to Connect Small Molecules，Genes，and Disease，″Science，第313卷，2006)，率先提出了以下一般概念：即，可以准确地确定先前未表征的基因的功能性，并且可以通过映射在经药物治疗的细胞的基因表达谱数据库中的联系来识别药物试剂的潜在靶标。
美国专利号9,434,993和美国专利公布号2015/0292018、2013/0261007、2013/0259816、2013/0261006、2013/0261024A1和2017/0343534公开了使用CMap来识别用于治疗与不健康的角质组织相关联的各种病症的潜在活性物质的系统和方法的示例。用于识别潜在护肤剂的CMap技术通常依赖于使用通过基于统计模型从基因表达谱中选择代表性基因而生成的转录基因表达数据。基因表达标记可以使用从其中存在皮肤病症(例如，色素沉着过度斑点)的皮肤活检样本或其他皮肤组织样本获得的信使RNA(″mRNA″)表达谱来生成。这通常称为″病症标记″。作为替代，基因表达标记可以使用来自用一种或多种基准活性物质(即，已知在受试细胞中引起特定效应的活性物质)处理的细胞的mRNA表达谱来生成。这通常称为″基准标记″。
使用病症或基准基因表达标记，使用者可以查询已经用于处理代表性细胞系的材料文库，并测量所得的mRNA表达谱。活性物质及其对应的谱在CMap数据库中表示为CMap实例。测试试剂逆转皮肤病症的有效性或测试试剂的作用与基准的相似性按其CMap分数进行排名，这些CMap分数是通过检查测试试剂对标记中的基因的调节方式来计算的。如果参考标记来自病症标记，则需要与该标记具有相反相关性分数的材料(即，逆转与感兴趣的皮肤病症相关联的转录变化的材料)。如果参考标记来自基准标记，则需要与参考标记具有最高正相关性的材料，因为使用者正在沿着与基准相同的方向寻找活性。
美容领域中的当前CMap技术的一个缺点是，使用病症标记的成功率可能比使用基准标记的成功率差得多。造成这种情况的一个原因可能是，使用具有多种细胞类型的组织样本来生成基因表达标记可能将″噪声″引入到系统中。也就是说，并非病症标记中的每个转录变化都可以与病症的涉及治疗调节的属性直接相关。
因此，需要通过用来自基准标记的数据使病症标记偏向来提高用于识别潜在的皮肤活性物质的CMap技术的准确性。
发明内容
本文公开了一种提高用于识别潜在护肤剂的关联性映射方法的可预测性的方法。该方法包括从皮肤组织样本构建病症标记和基准标记。然后使用计算机算法通过基准标记来过滤病症标记，以提供偏向病症标记。偏向病症标记包括多个上调基因和多个下调基因，这些基因全部具有等于或小于0.1的p值。偏向病症标记用于查询实例的数据库，其中每个实例与护肤剂相关联。为每个实例生成关联性分数，并且当实例的关联性分数与偏向病症标记具有负相关性时，将与数据库中的实例相关联的护肤剂识别为潜在护肤剂。
附图说明
图1是从测试样本构建病症标记的一个示例的示意图。
图2是从对照样本构建基准标记的一个示例的示意图。
图3是本发明系统的示例的示意图。
图4是实例的一个示例的示意图。
图5、图6和图7展示了对关联性分数进行关联和等级排序的示例。
具体实施方式
CMap技术可以用于识别潜在的新护肤剂，但使用病症标记时的成功率通常不如使用基准标记时的成功率高。不受理论的限制，据信，由于样本中存在多于一种类型的细胞(例如，角质细胞、成纤维细胞、黑素细胞)，所以从皮肤组织样本获得的病症标记可能将″噪声″引入到基因表达标记中。也就是说，并非病症标记中的每个转录变化都可以与病症的涉及治疗调节的属性直接相关。相比之下，基准标记通常获自可商购获得的细胞系(例如，tert-角质细胞、BJ成纤维细胞、B16黑素瘤细胞)，这些细胞系可以提供与感兴趣的皮肤病症的治疗调节更为相关的基因表达标记。令人惊讶地，现在已经发现，用基准标记数据使病症标记偏向可以提高使用CMap技术识别的潜在护肤剂将有效地治疗感兴趣的皮肤病症的可能性。因此，本发明改善了先前的CMap系统的可预测性。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员所通常理解的含义相同的含义。如本文所用，单数形式″一个″、″一种″和″该″旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地指明并非如此。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中所公开的任何范围均应当理解为包括范围本身，还包括其中包含的任何数值，以及端点。所有数值范围是包括端值在内的更窄的范围；所描述的范围上限和下限是可互换的，以进一步形成没有明确描述的范围。
说明书中对″实施方案″或类似方法的引用意指与该实施方案结合描述的具体材料、特征、结构、和/或特性包括在至少一个实施方案、任选多个实施方案中，但这并不意味所有实施方案包括所描述的材料、特征、结构、和/或特性。此外，材料、特征、结构、和/或特性可以任何合适的方式结合在不同的实施方案中，并且材料、特征、结构、和/或特性可以省略或替换所描述的。因此，除非另外说明或声明不相容，否则尽管未在组合中明确地例示，本文所述的实施方案和方面可以包括其他实施方案和/或方面的元件或部件或者可以与其他实施方案和/或方面的元件或部件组合。
本文的系统、方法和装置可以包括本文所述的基本组分以及任选成分、基本上由或由本文所述的基本组分以及任选成分组成。当提及转录谱时，″基本上由......组成″意味着转录谱仅包括与选自主题基因表达标记或基因表达谱的特定基因的转录相关的数据，不同的是它可以包括不会实质上改变受权利要求书保护的方法或系统的基本特征和新颖特征的附加数据(例如，元数据)。本文所公开的基因和蛋白质对应于截至2018年5月22日它们各自已知的序列。
″基准试剂″意味着已知在皮肤组织上诱导或引起已知效果(阳性或阴性)的护肤剂或护肤剂的组合。在各种实施方案中，基准试剂的作用是对感兴趣的细胞类型或组织的稳健的、期望的作用。可能适用于本文的基准护肤剂的一些非限制性示例包括：烟酰胺、间苯二酚、曲酸、熊果苷、脱氧熊果苷、维生素C化合物、维生素E化合物、巯基化合物、鞣花酸、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、衣霉素、蛋白酶抑制剂、N-十一碳烯酰基苯丙氨酸、类视色素(反式视黄酸、视黄醇、视黄醛等)、己脒定、醋酸氟轻松、对苯二酚、维甲酸、氢化可的松、植物甾醇、甘草次酸、氨甲环酸、洋甘菊提取物、水杨酸、α-羟基酸、α-酮酸和一磷酸腺苷，醋酸氟轻松、对苯二酚和维甲酸的混合物，以及它们的组合。基准护肤剂的特别合适的示例是
Figure BDA0002735280620000051
品牌护肤霜，其处方可从Galderma获得，该护肤霜含有醋酸氟轻松(0.01％)、对苯二酚(4％)和维甲酸(0.05％)的混合物。
″基准标记″意味着使用从已经用基准护肤剂处理的皮肤组织或皮肤细胞获得的基因表达谱数据构建的基因表达标记。
″计算机可读介质″是指以任何方法或技术实现的用于存储诸如计算机可读指令、数据和数据结构、数字文件、软件程序和应用程序或其他数字信息等信息的任何非暂态电子存储介质。计算机可读介质的一些非限制性示例包括专用集成电路(ASIC)、光盘(CD)、数字通用光盘(DVD)、随机存取存储器(RAM)、同步RAM(SRAM)、动态RAM(DRAM)、同步DRAM(SDRAM)、双倍数据速率SDRAM(DDRSDRAM)、直接RAM总线RAM(DRRAM)、只读存储器(ROM)、可编程只读存储器(PROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)，以及可移除的闪存存储器设备(例如，记忆棒或拇指驱动器)。
″关联性图谱″和″CMap″是可互换的，并且广义地指用于识别细胞表型或皮肤病症、基因表达与扰动因子(perturbagen)之间的关系的装置、系统、制品和方法。
关联性分数是指表示实例与查询相关的程度的派生值。
″对照样本″意味着未患有主题皮肤病症和/或尚未用扰动因子处理的匹配样本(例如，用于生成对应的测试样本的转录数据的相同的细胞和/或组织类型)。对照基因表达谱也可以源于预测算法或来自群体研究的计算指数。对照样本可以针对种族、性别、年龄、地理位置和/或种族起源进行匹配。
″数据架构″通常是指包括有组织的数据集合的一种或多种数字数据结构。在一些实施方案中，数字数据结构可以作为数字文件(例如，电子表格文件、文本文件、文字处理文件、数据库文件等)存储在计算机可读介质上。在一些实施方案中，数据架构以数据库的形式提供，该数据库可以由数据库管理系统(DBMS)管理，该数据库管理系统用于访问、组织和选择存储在数据库中的数据(例如，实例和基因表达标记)。
″皮肤病学可接受的载体″意味着适合局部施加于角质组织的载体。皮肤病学可接受的载体可以是很多种形式，诸如，简单的溶液(水基或油基)、固体形式(例如，凝胶或棒状物)和乳液。
″差异表达″意味着在两个实验条件之间观察到的表达水平的在统计上显著的差异或变化。例如，当表达水平的差异在统计上显著(例如，p≤0.1或p≤0.05)时，在测试样本中相对于对照样本上调的基因被差异表达。又如，当表达水平的差异在统计上显著时，在测试样本中相对于对照样本下调的基因被差异表达。
″有效量″是指皮肤组合物的足以显著诱导对皮肤的积极有益效果(诸如与感兴趣的皮肤病症相关的健康、外观和/或感觉有益效果)，但又足够低以避免严重的副作用(即，在技术人员合理判断的范围内提供合理的效险比)的量。
″基因表达谱″或″基因表达谱分析实验″是指使用任何合适的谱分析技术测量生物样本中多个基因的表达。例如，几千个基因的mRNA表达可使用微阵列技术来测定。出现的其他可以使用的技术包括RNA-Seq或利用NextGen测序技术的全转录组测序。
″基因表达标记″意味着具有表示皮肤病症或对扰动因子的生物学应答的表达模式的合理衍生的基因列表或多个基因列表。基因表达标记通常包括其表达相对于正常或对照状态增加(上调)和/或减少(下调)的基因的组合，该组合可以充当感兴趣的表型的代表。一般来讲，经修饰的细胞表型(例如，响应于暴露于扰动因子或生物攻击而观察到的表型，或与皮肤病症相关联的表型)的基因表达标记可以被描述为在经修饰的细胞表型中相比于对照(即，野生型或未受影响的细胞表型)差异表达的一组基因。基因表达标记可以源于各种数据来源，包括但不限于体外测试、体内测试、数据库信息，以及它们的组合。在各种实施方案中，与基因表达标记相关联的数据包括表示差异表达基因的″标识符″的排序列表。示例性标识符包括但不限于基因名称、基因符号、微阵列探针组ID值，以及它们的组合。任选地，基因表达标记包括表示感兴趣的病症的多个上调基因的标识符的第一列表和第二列表
″实例″意味着来自基因表达谱分析实验的数据，在该实验中，皮肤细胞被给予扰动因子。在一些实施方案中，该数据包括表示作为基因表达谱分析实验的一部分的基因的标识符列表。标识符可以包括基因名称、基因符号；微阵列探针组ID，或任何其他标识符。在一些实施方案中，实例可以包括来自微阵列实验的数据，并且包括通过它们相对于对照的差异表达程度来排序的微阵列探针组ID的列表。该数据还可以包括元数据，包括但不限于与扰动因子、基因表达谱分析测试条件、皮肤细胞和微阵列中的一者或多者相关的数据。
″微阵列″广义地指能够对生物样本进行基因表达谱分析的核酸、寡核苷酸、蛋白质、小分子、大分子和/或它们的组合在基底上的任何有序阵列。微阵列的非限制性示例购自Affymetrix，Inc.、Agilent Technologies，Inc.、Illumina，Inc.、GE Healthcare，Inc.、Applied Biosystems，Inc.、Beckman Coulter，Inc.等等。
″扰动因子″意味着在皮肤组织中引起生物学应答，导致基因表达从正常或野生型基因表达转移的化学或物理刺激。任何物质、化学物质、化合物、小分子或大分子、活性物质、天然产物(例如，趋化因子)、提取物以及它们的组合都可以用作扰动因子。″扰动因子″还包括生成差异基因表达数据的任何其他刺激，诸如，紫外线辐射、热、渗透应力、pH、微生物、病毒、重组细胞因子或生长因子，或者小干扰RNA。扰动因子可以是护肤剂，但又不必是护肤剂。在一些实施方案中，将扰动因子施加于皮肤细胞并测量基因表达。所得的转录数据可以被存储，例如，作为数据架构中的实例。
″查询″是指用作关联性图谱的输入并且多个实例与之进行比较的数据。查询可以包括与皮肤病症或实例相关联的基因表达标记。CMap可以用扰动因子、基因表达标记、皮肤疾病、主题标记、或者被包括在数据架构中的任何数据特征或数据特征的组合或关联来查询。
″护肤剂″意味着可以安全且有效地摩擦、倾倒、喷洒、喷涂、引入或以其他方式局部施加于皮肤以引起皮肤状况(例如，健康、感觉和/或外观)的所需变化的任何物质，及其任何组分。护肤剂的一些非限制性示例可以在下列来源中找到：与美国国立卫生研究院相关联的PubChem数据库，美国个人护理产品协会的成分数据库，由美国个人护理产品协会出版的2010年国际化妆品成分词典手册第13版，SkinDeep数据库。护肤剂的其他非限制性示例包括植物性药材(即，源于植物的根、茎皮、叶、种子或果实中的一者或多者的材料)。另一个类别的护肤剂是维生素化合物及其衍生物和组合，诸如维生素B3化合物、维生素B5化合物、维生素B6化合物、维生素B9化合物、维生素A化合物、维生素C化合物和/或维生素E化合物(例如，视黄醇、视黄酯、烟酰胺、叶酸、泛醇、抗坏血酸、生育酚和生育酚乙酸酯)。护肤剂的其他非限制性示例包括糖胺、植物甾醇、己脒定、羟基酸、神经酰胺、氨基酸和多元醇。
″皮肤病症″意味着任何感兴趣的皮肤表型，包括与疾病、生物学紊乱、营养不良、年龄和感染相关联的异常表型。
本文公开了用于构建偏向基因表达标记的装置、系统和方法，该偏向基因表达标记与其非偏向对应物相比，可以用于提高CMap查询的可预测性。偏向基因表达标记可以用于预测测试试剂对感兴趣的皮肤病症的影响。根据本发明的方法构建非偏向基因表达标记通常包括：(a)测量测试样本(例如，皮肤组织样本、原代细胞或皮肤细胞系)中的基因表达；(b)通过将(a)的基因表达测量结果与对照样本的基因表达测量结果进行比较，来识别在测试样本中差异表达的基因；(c)计算表示在(b)中识别的差异基因表达的显著性的基因表达一致性值；(d)基于差异表达基因的基因表达一致性值创建这些差异表达基因的排序列表；(e)用来自基准试剂的基因表达测量结果来使差异表达基因的排序列表偏向。应当理解，可以使用可编程计算机来执行该方法中的一个或多个步骤。用于测量基因表达、识别差异表达基因、计算基因表达一致性值、创建基因标识符的排序列表和一般关联性映射技术的方法、系统和装置的一些非限制性示例描述于美国专利号9,434,993和美国专利公布号2013/0261007和2017/0343534中。
在某些实施方案中，使用计算机来查询具有偏向基因表达标记的存储的皮肤实例的数据架构。每个皮肤实例都与护肤剂相关联。该查询包括将偏向基因表达标记与每个存储的皮肤实例进行比较。计算机模拟方法有利于识别诱导统计上显著数量的与感兴趣的皮肤病症相关联的基因的表达的统计上显著的变化的护肤剂，这导致识别用于治疗皮肤病症的新美容剂或已知美容剂的新用途。虽然本公开通常涉及皮肤色素沉着病症(例如，色素沉着过度、老年斑、雀斑、黄褐斑)，但是应当理解，本发明的方法和系统可以应用于任何感兴趣的皮肤病症。
本文还提供了用于配制护肤组合物的方法。该方法通常包括访问存储在计算机可读介质上的多个实例、访问存储在计算机可读介质上的偏向基因表达标记、将偏向基因表达标记与多个实例进行比较、将关联性分数分配给多个实例中的每一个实例，以及通过将皮肤病学可接受的载体与至少一种护肤剂混合来配制护肤组合物，所述至少一种护肤剂与具有负相关性(即，负关联性分数)的实例相关联。
测量基因表达
本文的方法和系统利用从生物样本获得的基因表达测量结果。此类生物样本的一些非限制性示例包括从人类受试者获得的皮肤组织样本(例如，全厚度皮肤活检样本)、原代细胞(即，从人类组织分离的经培养细胞)和细胞系(即，已经连续传代了长时间段并且已经获得了同质基因型和表型特征的经培养细胞)。基因表达可以以多种方式检测和/或测量，诸如，使用表示基因表达的生物分子(″生物标志物″)。通常用于基因表达测量的生物标志物包括蛋白质、核酸、多核苷酸(例如，微RNA、mRNA和cDNA)、蛋白质片段或代谢物，以及/或者由基因转录物编码的蛋白质编码的酶活性产物。用于测量基因表达的特别合适的生物标志物是由感兴趣的基因编码的mRNA。在一些实施方案中，可能期望将由一个或多个感兴趣的基因编码的mRNA逆转录成cDNA并测量cDNA。mRNA或cDNA样本通过下列方式测量：将核酸与对由一种或多种感兴趣的基因编码的mRNA或cDNA特异的寡核苷酸杂交，这些寡核苷酸任选地固定在基质上(例如，作为阵列或微阵列)，然后测量核酸与探针的结合水平，例如使用微阵列读取器来测量由杂交的生物标志物产生的荧光。在一些实施方案中，可能期望在杂交之前扩增mRNA或cDNA，例如通过聚合酶链反应(PCR)。
图1展示了从皮肤组织样本构建基因表达谱的方法的一个示例。皮肤组织样本可以通过本领域已知的任何合适的方法(例如，活组织检查)从人类供体获得。在一些实施方案中，经由例如激光捕获显微切割将皮肤组织样本分离成一种或多种组成部分(例如，基底上、基底和真皮)，以提供测试样本60和62。在该示例中，从测试样本60和62以及对照样本66提取mRNA，然后逆转录成cDNA。如果即将进行双色微阵列分析，则用不同的荧光染料(例如，红色和绿色)标记cDNA，或者可以准备好cDNA用于单色微阵列分析。如果需要，可以处理多个重复样品。将cDNA与包含多个基因探针82(例如，介于10,000个与50,000个之间)的微阵列80共杂交。由扫描仪84扫描微阵列80，该扫描仪激发荧光染料并测量荧光量。可以与扫描仪或独立装置集成在一起的计算机86分析荧光数据，以确定基因的表达水平。表达水平可以包括：i)上调(即，来自测试样本的cDNA(测试cDNA)与探针的结合比来自对照样本的cDNA(对照cDNA)大；ii)下调(即，对照cDNA与探针的结合比测试cDNA大)；iii)表达而非差异表达(即，对照cDNA的结合与测试cDNA类似)；和iv)没有可检测的信号或噪声。上调的基因和下调的基因被称为差异表达的基因。差异表达的基因可以进行等级排序并被存储为数字文件88。
微阵列和常规的微阵列分析技术是已知的，并且设想可以使用任何合适的微阵列技术和相关联技术。例如，Affymetrix GeneChipTM技术和Illumina BeadChipTM技术可能特别适用于在本文的方法和系统中对基因表达进行定量。
计算基因表达一致性值
可以影响基因表达标记的质量的一个因素是该标记中包含的基因的数量。关于美容数据架构和关联性图谱，太少的基因可能导致对于最高得分实例不稳定的标记。换句话讲，基因表达标记的细微变化可能导致最高得分实例中的显著差异。相反，太多的基因可能趋于部分掩盖主要的生物学应答，并且将包括更高比例的由于随机机会而达到统计截止值的基因，从而向该标记添加不期望的噪声。因此，可能期望对基因表达谱应用合适的统计过滤器(例如，来自t检验、ANOVA、相关系数或其他基于模型的分析的p值)，以将基因的数目定制为合适大小的基因表达标记。与适当的对照相比，将基因表达标记限制为符合一些合理的截止值以满足统计学显著性的基因，对于允许选择作为感兴趣的皮肤病症的特征的基因很重要。使用统计方法比使用倍数变化值更可取，后者不考虑测量结果周围的噪声。t统计值可能特别适用于选择标记中的基因，因为它可以指示基因表达变化的方向性(即，上调或下调)以及统计学显著性。作为一个示例，可以选择p值作为统计度量，并且可以选择p≤0.05或p≤0.1的截止值。所得的p值可以用于表示基因表达一致性值，它可以进行等级排序，作为表示差异表达的基因的标识符列表。标识符的排序列表可以任选地与标识符的数字排名相关联，该数字排名对应于标识符在排序列表中的排名(例如，1至N，其中N是列表中的基因的数目)。
不受理论的限制，据信，当对皮肤病症的基因表达分析产生统计学p值小于0.05的介于约2,000个与4,000个之间的基因，以及p值小于0.001的大约1000个基因时，指示非常强的生物学应答。中等强度的生物学应答可能产生统计学p值小于0.05的大约800至2000个基因，以及p值小于0.001的大约400至600个基因。在这些情况下，包含介于100个与600个之间的基因的基因表达标记似乎适用于预测推定的护肤剂。较弱的生物学可以更好地由包含较少基因(诸如介于约20个与约100个之间的基因)的基因表达标记来表示。
构建偏向基因表达标记
常规的CMap技术通常涉及用基因表达标记查询实例数据库，该基因表达标记是使用从表现出感兴趣的皮肤病症的皮肤组织获得的基因表达谱数据构建的(″病症标记″)。该方法的一个挑战是确保用于构建标记的基因反映了感兴趣的皮肤病症的主要和关键生物学，而不包括非信息性基因。现在已经发现，用来自基准标记的基因表达数据来使病症标记偏向可以提高CMap查询关于识别用于治疗主题皮肤病症的潜在护肤剂的可预测性。
构建偏向基因表达标记通常涉及通过基准标记过滤病症标记，以从病症标记中识别和/或移除对用基准试剂治疗无响应或在相反方向上被调节的基因。因此，通过基准标记过滤病症标记通常将导致最顶部的上调基因或下调基因中的一些基因从病症标记中移除，并且/或者在正常情况下不会出现在顶部的上调基因或下调基因中的基因被添加到标记中。然后可以将过滤后剩余的最重要的基因用作偏向标记。在一些实例中，偏向基因表达标记可以包括顶部的200个上调基因和顶部的200个下调基因(例如，各自有介于50个与300个之间的基因，或各自有介于100个与250个之间的基因)。
感兴趣的皮肤病症的基因表达谱可以包括介于1000个与5000个之间的经显著调节的基因，其中的一些或全部用于构建病症标记。经显著调节的基因在上调基因与下调基因之间可以均匀分布、也可以不均匀分布。病症标记中的每个经显著调节的基因均通过基准标记进行过滤。在一些实施方案中，如果病症标记中的基因在基准标记中未被显著调节，或者如果该基因在基准标记中未被沿相反方向显著调节，则将该基因从病症标记中移除。在一些实施方案中，如果调节方向对应于皮肤病症的改善，则基于主题基因的已知功能，在基准标记中沿相同方向被显著调节的病症标记中的基因可以被包括在偏向病症标记中。在通过基准标记过滤之后保留在病症标记中的基因可以用作偏向病症标记。然而，可能期望例如仅选择顶部的50、100、150、200或250个上调基因和顶部的50、100、150、200或250个下调基因来用于偏向病症标记。
基准标记可以通过使皮肤细胞(例如，角质细胞或成纤维细胞)与基准皮肤试剂(例如，
Figure BDA0002735280620000121
品牌护肤霜)接触并测量相对于对照(即，尚未用基准皮肤试剂处理的相同类型的皮肤细胞)的差异基因表达水平来构建。被选择用于构建基准标记的皮肤细胞的类型取决于用来在CMap数据库中生成相关实例(即，将利用偏向病症标记来查询的实例)的细胞类型。例如，如果将使用偏向病症标记来查询由角质细胞生成的实例，则使用角质细胞(例如，可商购获得的人tert-角质细胞细胞系)来构建基准标记。作为替代，如果将使用偏向病症标记来查询由成纤维细胞生成的实例，则使用成纤维细胞(例如，来自ATCC(Manassas，VA)的人BJ成纤维细胞细胞系)来构建基准标记。可以对所得的基准表达谱进行合适的统计分析，以识别显著上调和下调的基因(例如，p≤0.1或p≤0.05)，以用于构建基准标记。显著上调和下调的基因可以例如根据p值进行等级排序，并被存储为数字文件。
图2展示了构建偏向基因表达标记288的方法的一个示例。在该示例中，通过用基准试剂处理皮肤测试细胞260来获得基准标记。在该示例中，从经处理的皮肤测试细胞260和皮肤对照细胞262提取mRNA，然后逆转录成cDNA。如果即将进行双色微阵列分析，则用不同的荧光染料(例如，红色和绿色)标记cDNA，或者可以准备好样本用于单色微阵列分析。如果需要，可以处理多个重复样品。将cDNA与包含多个基因探针282的微阵列280共杂交。由扫描仪84扫描微阵列80，该扫描仪激发荧光染料并测量荧光量。可以与扫描仪或独立装置集成在一起的计算机86分析荧光数据，以确定基因的表达水平。这些表达水平可以与上文参照图1描述的病症标记的那些表达水平相同。病症标记88由计算机86通过基准标记过滤，以生成偏向病症标记288。
本发明的系统、装置和计算机相关方面
本发明方法的各个方面采用了计算机以及基于计算机的系统和装置。图3展示了可以适合与本文的方法一起使用的系统和装置的示例。如图3所展示，系统10包括一个或多个计算机12、14，计算机可读介质16和通信网络18。可以作为硬盘驱动器提供的计算机可读介质16包括数字文件20，诸如数据库文件，该数字文件包括被存储在与数字文件20相关联的数据结构中的多个实例22、24和26。多个实例可以被存储在关系表和索引中，或其他类型的计算机可读介质中。实例22、24和26也可以分布在多个数字文件上，然而，为简单起见，本文描述了单个数字文件20。可以根据下文更详细描述的方法来构建实例。数字文件20可以以很多种格式提供，诸如文字处理文件格式(例如，
Figure BDA0002735280620000131
)、电子表格文件格式(例如，
Figure BDA0002735280620000132
)和/或数据库文件格式。文件格式的一些非限制性示例包括与文件扩展名相关联的那些，诸如*.xls、*.xld、*.xlk、*.xll、*.xlt、*.xlxs、*.dif、*.db、*.dbf、*.accdb、*.mdb、*.mdf、*.cdb、*.fdb、*.csv、*.sql、*.xml、*.doc、*.txt、*.rtf、*.log、*.docx、*.ans、*.pages、*.wps等。
实例22、24和26包括微阵列探针组ID的排序列表，其中N的值等于分析中所使用的微阵列上探针的总数，对于一些微阵列而言，该总数可能超过20,000。适用于本文的微阵列的一些非限制性示例包括AffymetrixTMGeneChipsTM品牌微阵列(例如，HG-U133 Plus 2.0，HG-U219和HG-U133A2.0)和IlluminaTM BeadChipTM品牌微阵列。排序列表可以被存储在数字文件20的数据结构中，并且数据被布置成使得当软件应用程序28读取该数字文件时，重现表示探针组ID的排序列表的多个字符串。尽管优选的是每个实例都包含探针组ID的完整列表，但设想一个或多个实例可以只包含微阵列的所有探针组ID中的一部分。还设想，除了探针组ID的排序列表之外或代替该排序列表，这些实例可以包括其他数据。例如，可以用等效基因名称和/或基因符号的排序列表来代替探针组ID的排序列表。附加数据可以与实例和/或数字文件20一起存储。在一些实施方案中，附加数据被称为元数据，并且可以包括细胞系标识、批号、暴露持续时间和其他经验数据中的一者或多者，以及与实例ID相关联的任何其他描述性材料。排序列表还可以包括与每个标识符相关联的数值，该数值表示该标识符在排序列表中的排名位置。
如图3所展示，计算机可读介质16还可以在其上存储第二数字文件30。第二数字文件30可以包括与一个或多个基因表达谱、病症标记、基准标记和/或偏向病症标记相关联的微阵列探针组ID的一个或多个列表32、34。列表可以被存储在数字文件30的数据结构中，并且数据被布置成使得当软件应用程序28读取该数字文件时，重现表示探针组ID的列表的多个字符串。代替探针组ID，可以用等价的基因名称和/或基因符号(或其他命名法)来代替探针组ID的列表。附加数据可以与基因表达数据和/或数字文件30一起存储，并且这通常被称为元数据，该元数据可以包括任何相关联信息，例如，细胞系或样本来源和微阵列标识。
存储在第一数字文件20和/或第二数字文件30中的数据可以存储在一个或多个可搜索数据库中，所述数据库可以由系统10的使用者访问(例如，经由与数据库管理系统相关联的图形使用者界面)，以访问和检索期望的数据。数字文件20、30可以包括在通信网络18上从存储在与第二计算机14相关联的计算机可读介质38上的数字文件36传输的数据。在一些实施方案中，计算机可读介质16包括具有用于读取、写入或以其他方式管理和/或访问数字文件20、30的计算机可读指令或软件的数字文件28。计算机可读介质16还可以包括软件或计算机可读和/或可执行指令，所述软件或计算机可读和/或可执行指令致使计算设备12执行本文所述方法的一个或多个步骤，包括例如与将存储在数字文件30中的基因表达标记与存储在数字文件20中的实例22、24和26进行比较相关联的步骤。在一些实施方案中，一个或多个数字文件28可以形成用于管理数字文件20、30的数据库管理系统的一部分。数据库管理系统的非限制性示例描述于美国专利号4,967,341和5,297,279中。
计算机可读介质16可以形成计算机12的一部分或以其他方式连接到该计算机。系统10的计算机12、14可以使用有线和/或无线网络通信接口在网络18上的联网环境中操作。例如，通信网络18可以是广域网(WAN)诸如互联网，或者局域网(LAN)。通信网络18可以包括任何必要的硬件，诸如用于无线通信的基站，这些基站包括收发器、用于调制/解调的相关联的电子设备，以及连接到网络的开关和端口。
识别潜在护肤剂并配制护肤组合物
本文所述的偏向病症标记因为其相对于非偏向病症标记而言改进的能力而有用，用于识别扰动因子与扰动因子调节与皮肤病症相关联的基因的能力之间的关联。例如，该偏向病症标记可以用于识别可以潜在地改善皮肤色素沉着病症的外观的护肤剂。实际上，本发明的方法适用于计算机模拟筛选候选护肤剂的大文库，以识别先导候选物的经改进方法，所述先导候选物用于使用例如本文所述的体外方法和离体方法进行进一步评估。
本发明的方法包括查询具有偏向基因表达标记的存储的皮肤实例的数据架构。每个皮肤实例都与护肤剂相关联。在查询中，将偏向病症标记与每个存储的实例进行比较(即，将偏向病症标记列表中的每个基因标识符与每个实例列表中的相同标识符的位置进行比较)。将偏向病症标记与每个存储的实例进行比较包括为这些实例中的每个实例分配关联性分数。在一些实施方案中，当实例具有负关联性分数(表示偏向病症标记与实例之间的负相关性)或正关联性分数(表示偏向病症标记与实例之间的正相关性)时，具体取决于正被调节的基因的功能，与实例相关联的护肤剂可以被识别为用于治疗感兴趣的皮肤病症(即，与偏向病症标记相关联的皮肤病症)的候选物。例如，如果关联性分数对应于指示皮肤病症有所改善的基因表达变化，则护肤剂可能是用于进一步测试和/或结合到护肤组合物中的候选物。
本文的护肤组合物可以通过使用用于制备此类组合物的领域中的技术人员已知的材料、方法和设备将护肤剂与皮肤病学可接受的载体混合来制备。此类方法通常包括在一个或多个步骤中将各成分混合至相对均一的状态，可使用或不使用加热、冷却、施加真空等。优选地制备这些组合物以优化活性物质(例如，己脒定、糖胺、维生素B3、视黄醇丙酸酯、植物甾醇)的稳定性(物理稳定性、化学稳定性、光稳定性)和/或递送。这种优化可以包括适当的pH(例如，小于7)、排除可以与护肤剂络合并因此对稳定性或递送造成负面影响的物质(例如，排除污染性铁)、使用防止络合物形成的方法(例如，适当的分散剂或双隔室包装)、使用适当的光稳定性方法(例如，结合防晒剂、防晒霜，使用不透明包装)等。
本文的护肤组合物可以任选地包含一种或多种常用于美容组合物中的附加成分(例如，着色剂、护肤活性物质、抗炎剂、防晒剂、乳化剂、缓冲剂、流变改性剂、这些物质的组合等)，前提条件是这些附加成分不会不利地改变由本发明组合物提供的皮肤健康或外观有益效果。当掺入组合物中时，附加成分应该适用于与人类皮肤组织接触，而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等等。附加活性物质的一些非限制性示例包括维生素、矿物质、肽和肽衍生物、糖胺、防晒剂、控油剂、颗粒、类黄酮化合物、毛发生长调节剂、抗氧化剂和/或抗氧化剂前体、防腐剂、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、抗炎剂、保湿剂、去角质剂、亮肤剂、免晒美黑剂、润滑剂、抗痤疮活性物质、抗蜂窝炎活性物质、螯合剂、抗皱纹活性物质、抗萎缩活性物质、植物甾醇和/或植物激素、N-酰基氨基酸化合物、抗微生物剂和抗真菌剂。可以适用于本文的附加成分和/或护肤活性物质的其他非限制性示例描述于美国专利公布号2002/0022040、2003/0049212、2004/0175347、2006/0275237、2007/0196344、2008/0181956、2008/0206373、2010/00092408、2008/0206373、2010/0239510、2010/0189669、2010/0272667、2011/0262025、2011/0097286、US2012/0197016、2012/0128683、2012/0148515、2012/0156146和2013/0022557，以及美国专利号5,939,082、5,872,112、6,492,326、6,696,049、6,524,598、5,972,359和6,174,533中。
生成实例，将数据排序
在一些实施方案中，本发明的方法涉及查询实例的数据架构。每个实例都包括从基因表达谱分析实验获得的转录数据或基本上由该转录数据组成，其中生物样本暴露于扰动因子。例如，每个实例都可以包括Affymetrix HG-U219 GeneChip上所有探针组的经等级排序的转录数据，其中微阵列上的每个探针都具有独特的探针组标识符。这些探针组可以通过相对于相同CMap批次中的对照(对照的单一实例/平均值)检测到的基因表达的倍数变化水平来进行等级排序。可能期望对探针组标识符进行等级排序，以反映上调最多到下调最多。用于生成实例的合适方法(包括阈值化以减少信号值中的噪声的方法)公开于授予Binder等人的美国专利号9,434,993以及美国专利公布号2013/0261007和2017/0343534中。
经等级排序的数据可以被存储为实例或基因表达谱。图4展示了实例22的一个示例。探针ID可以根据检测到的基因表达调节水平被分类到经等级排序的列表54中，其中该列表从上调进展到边缘调节，或从无调节进展到下调。如图4所展示，与实例22相关联的数据(或与皮肤病症相关联的基因表达谱)包括探针ID 50和表示其在列表54中的排名的值52(例如，1、2、3、4...N，其中N表示微阵列上探针的总数)。排序列表54通常可以包括大约三个探针ID分组：与上调的基因相关联的第一探针ID分组56、与具有边缘调节或者没有可检测的信号或噪声的基因相关联的第二探针ID分组58，以及与下调的基因相关联的第三探针ID分组59。上调最多的基因在列表54的顶部或顶部附近，并且下调最多的基因在列表54的底部或底部附近。为了说明而示出了这些分组，但是每个实例22的列表可以是连续的，并且受调节基因的数目将取决于例如与实例22相关联的扰动因子的作用强度。可以提供列表54内的其他布置方式。例如，与下调的基因相关联的探针ID可以布置在列表54的顶部。实例22中的该数据还可以进一步包括元数据，诸如护肤剂标识和/或浓度、细胞系或样本来源，以及微阵列标识。
将偏向基因表达标记与实例进行比较
广义地讲，本发明的方法包括查询具有偏向病症标记的所存储实例的数据架构，并且应用统计方法来确定在实例中偏向基因表达标记基因与受调节的基因匹配的强烈程度。当上调基因表达标记列表中的基因富集在实例中的上调基因中，并且下调基因表达标记列表中的基因富集在实例中的下调基因中时，出现正关联性。另一方面，如果基因表达标记的上调基因主要在该实例的下调基因中找到，反之亦然，则将其评定为负关联性。可以使用允许数据可视化的任何合适的软件和计算机硬件向使用者显示所得的经等级排序的实例列表。
关联性分数是上行分数和下行分数的组合，其中上行分数表示基因表达标记的上调基因与实例之间的相关性，而下行分数表示基因表达标记的下调基因与实例之间的相关性。上行分数可以通过将偏向基因表达标记的″上行列表″(即，包含该标记的上调基因的列表)的每个标识符与排序实例列表进行比较来计算，并且下行分数可以通过将基因标记的″下行列表″(即，包含该标记的下调基因的列表)的每个标识符与排序实例列表进行比较来计算。关联性分数的符号通过实例与基因表达标记是正相关还是负相关来确定。当与实例相关联的扰动因子趋于上调标记的上行列表中的基因以及下调下行列表中的基因时，出现正关联性。相反地，当扰动因子趋于逆转向上和向下的标记基因表达变化时，出现负关联性。当上行分数和下行分数具有不同的符号时，关联性分数的量值是上行分数和下行分数的绝对值的总和。高正关联性分数预测扰动因子将趋于诱导与查询基因表达标记相关联的病症，而高负关联性分数预测扰动因子将趋于逆转与查询基因表达标记相关联的病症。在上行分数和下行分数具有相同符号的情况下，分配零分，指示将无法预测扰动因子对皮肤病症具有一致的影响。
图5展示了偏向病症标记90与实例104之间的正关联性的极端示例，其中实例104的探针ID 102从上调最多排序到下调最多。在该示例中，偏向病症标记90的探针ID 100(例如，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8)被布置为上行列表97和下行列表99。如图5所展示，偏向病症标记90的上行列表97中的探针ID 100与实例104的上调最多的探针ID 102具有一一对应的正对应关系，并且偏向病症标记90的下行列表中的探针ID 100与实例104的上调最多的探针ID 102具有一一对应的正对应关系。
图6展示了偏向病症标记94与实例288之间的负关联性的极端示例。实例288的探针ID 202从上调最多排序到下调最多。在该示例中，偏向病症标记94的上行列表93的探针ID 200(例如，X1、X2、X3、X4)与实例288的下调最多的基因精确对应，而下行列表95的探针ID200(例如，X5、X6、X7、X8)与实例288的上调最多的探针ID 202精确对应。
图7展示了中性关联性的极端示例，其中在实例388的上调基因和下调基因中不存在偏向病症标记108的上调基因和下调基因的一致富集，无论是正的还是负的。因此，偏向基因表达标记108(包括上行列表107和下行列表109)的探针ID 300(例如，X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8)关于实例388的探针ID 302的排名而分散。
如图5、图6和图7所展示，关联性分数101、103和105的值可以在从+2(最大正关联性)至-2(最大负关联性)的范围内，并且是上行分数111、113、115和下行分数117、119、121的组合。基因表达标记与由上行分数和下行分数和/或关联性分数表示的实例之间的匹配强度可以通过本领域已知的一种或多种方法导出，这些方法包括但不限于参数方法和非参数方法。参数方法的示例包括皮尔逊相关(或皮尔逊r)和余弦相关。非参数方法的示例包括斯皮尔曼等级(或等级次序)相关、Kendall′s Tau相关和γ统计值。任选地，为了消除所有的谱都在同一个微阵列平台上生成的要求，使用了基于Kolmogorov-Smirnov统计值的非参数的、基于等级的模式匹配策略(参见M.Hollander等人，″Nonparametric StatisticalMethods″；Wiley，New York，第2版，1999)(参见例如第178-185页)。在所有表达谱都源于单个技术平台的情况下，使用常规的相关度量(例如，皮尔逊相关系数)可以获得类似的结果。可能期望使用基于Kolmogorov-Smirnov统计值的基于等级的模式匹配策略，该策略已经针对基因谱分析数据进行了改进，被称为基因集富集分析(GSEA)(参见例如Lamb等人，2006和Subramanian，A.等人，(2005)Proc.Natl.Acad Sci U.S.A，102，15545-15550)。
所显示的实例的经等级排序的列表可以用于识别：(i)与感兴趣的实例相关联的一种或多种扰动因子(从而将查询标记中列出的多个基因的激活或抑制与一种或多种潜在护肤剂关联起来)；(ii)与任何感兴趣的实例相关联的差异表达基因(从而将此类基因与一种或多种扰动因子、感兴趣的皮肤病症或这两者关联起来)；(iii)与任何感兴趣的实例相关联的细胞(从而将此类细胞与差异表达基因、一种或多种扰动因子和感兴趣的皮肤病症中的一者或多者关联起来)；或(iv)它们的组合。与实例相关联的扰动因子可以从存储在数据库中针对该实例的元数据中识别。然而，本领域的技术人员应当理解，实例的护肤剂数据可以可检索地存储在其他装置中并且由其他装置可检索地存储。因为所识别的护肤剂与查询标记中列出的基因的激活或抑制在统计上相关，并且因为查询标记是皮肤病症的代表，所以所识别的扰动因子可以是新护肤剂、已知护肤剂的新用途或用于验证已知护肤剂的已知用途的候选物。
在皮肤病症模型中表征扰动因子活性
在一些实施方案中，本文的方法包括在一种或多种测定法中表征与实例相关联的扰动因子(即，候选护肤剂)的活性，以评估其作为护肤剂的潜在有用性。例如，作为查询具有偏向基因表达标记的实例的数据库的结果而被识别为潜在护肤剂的扰动因子可以进一步经受体外测试(例如，基于细胞的测定或离体组织测定)和/或涉及人类参与者的体内测定(例如，临床研究)，以评估或验证其在治疗感兴趣的皮肤病症中的功效。在一些实施方案中，可以使用分层筛选方法，其中使用本文的经改进的CMap技术识别潜在护肤剂，然后在基于细胞的测定、离体组织测定和/或体内测定中表征所识别的护肤剂的活性。可以用于验证潜在护肤剂的功效的测定(例如，作为分层筛选方法的一部分)的一些非限制性示例包括表型测定，其中黑色素含量作为终点定量，诸如B16小鼠黑素瘤黑色素合成测定、具有黑素细胞组分的重建皮肤模型(例如，来自EPISKIN的SkinEthicTM)，和/或皮肤外植体测定(例如，CuTechTM)。可能期望选择覆盖基准材料所表现出的机械空间的验证测定。例如，已知氢醌抑制黑色素合成，因此可能期望配置或选择具有黑色素产生组分的验证。通过将本文的经改进的CMap技术与证实的体外和/或体内测试相结合，可以提供用于表征潜在护肤剂对感兴趣的皮肤病症的影响的连贯的分层测定系统。在各种实施方案中，将扰动因子的活性与基准进行比较。细胞增殖测定和炎症测定的示例性基准物是氯倍他索，这是一种用于治疗例如湿疹和银屑病的皮质类固醇。
护肤组合物和使用方法
包含有效量的根据本文的方法识别的护肤剂的护肤组合物可以用于通过将该护肤组合物局部施加于需要调节的皮肤目标部分来调节皮肤病症。本发明的方法可以包括识别需要治疗和/或期望进行治疗的皮肤目标部分，以及在治疗期间将护肤组合物施加于角质组织的目标部分。需要治疗的角质组织的目标部分可以基于存在可见病症(例如，色素沉着过度、不均匀的皮肤色调或皱纹)来识别。在一些实例中，皮肤的目标部分可以不表现出病症的可见迹象，但是如果已知这种区域将发展出病症(例如，通常不被衣服覆盖的皮肤表面)，则使用者可能仍然希望将这种区域视作目标。
合适的治疗期包括每日施加、每日施加两次，或者甚至更频繁地以每日为基础施加，持续足够长的时间，以使护肤剂提供期望的有益效果。例如，治疗期可以为护肤剂提供足够的时间以在皮肤病症中提供明显和/或可测量的改善。治疗期可持续至少1周(例如，约2周、4周、8周或甚至12周)。在一些情况下，治疗期将延长至多个月(即，3至12个月)或多年。在一些实例中，含有有效量的护肤剂的护肤组合物可以在至少2周、4周、8周或12周的治疗期期间在一周的大多数天数内施加(例如，一周至少4、5或6天)、一天至少施加一次或甚至一天施加两次。
本文的护肤组合物可以局部施加或全面施加。关于该组合物的施加，术语″局部的″、″局部″、″局部地″意味着将该组合物递送到目标区域而使对不期望治疗的角质表面的递送最小化。虽然本文的某些实施方案设想将组合物局部施加到某一区域，但应当理解，本文的组合物可以更全面地或广泛地施加到一个或多个角质表面。在某些实施方案中，本文的组合物可以用作多步美容方案的一部分，其中本发明的组合物可以在一种或多种其他组合物之前和/或之后施加。
护肤组合物可以通过已知用于施加此类产品的任何合适的方式施加，包括用手、手指和/或工具摩擦、擦拭或轻拍。工具的非限制性示例包括海绵或海绵端涂敷器，药签(例如，棉端药签)，任选地包括泡沫或海绵涂敷器的笔、刷子、擦拭物、以及它们的组合。该组合物可以预先施加于涂敷器，并且例如照此预包装以递送给使用者，或者可以指导使用者在使用之前将该组合物施加于涂敷器。在一些实例中，该组合物可以储存在工具中，例如，在用于该组合物的单独的储存区域中。在该示例中，可以例如通过挤压和/或破坏或通过其他合适的方式将该组合物从储存区域转移到涂敷器。可以通过使涂敷器和该组合物接触皮肤，来将该组合物施加于角质组织。接触可以包括例如轻压、轻拍、摩擦、擦拭或任何其他合适的方式。
本文的护肤组合物包含皮肤病学可接受的载体，并任选地包含美容护肤组合物中通常包含的其他成分。载体可以以按组合物的重量计20％至99.99％(例如，50％至99％、60％至98％、70％至95％，或甚至60％至80％)的量存在。载体可以是含水的或无水的。载体的形式不受特别限制，并且可以是本领域已知的用于期望的应用的任何合适形式(例如，溶液、分散体、乳液以及它们的组合)。″乳液″是指具有水相和油相的组合物。乳液载体包括但不限于水包油乳液、油包水乳液和水包油包水乳液。本文的乳液载体可以包含从0.01％至10％(例如，0.1％至5％)的乳化剂(例如，非离子乳化剂、阴离子乳化剂、阳离子乳化剂，或它们的组合)。合适的乳化剂公开于例如美国专利3,755,560、美国专利4,421,769和McCutcheon的Detergents and Emulsifiers，北美版，第317324页(1986)中。
本发明的组合物可以包含常规用于护肤组合物中的多种任选成分，只要任选成分不会不期望地改变产品的稳定性、美观性或性能即可。任选成分在结合到组合物中时，应当适用于与人类皮肤接触，而在合理的判断范围内没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、变应性应答等。CTFA Cosmetic Ingredient Handbook第二版(1992年)描述了很多种非限制性美容成分和药物成分。本文的组合物可以包含按组合物的重量计0.0001％至50％、0.001％至20％、或甚至0.01％至10％的任选成分。任选成分的一些非限制性示例包括维生素、矿物质、肽和肽衍生物、糖胺、控油剂、类黄酮化合物、抗氧化剂和/或抗氧化剂前体、防腐剂、植物甾醇、蛋白酶抑制剂、酪氨酸酶抑制剂、抗炎剂、保湿剂、润肤剂、湿润剂、去角质剂、亮肤剂、防晒剂、免晒美黑剂、颜料、成膜剂、增稠剂、pH调节剂、遮光剂、着色剂/色料、颗粒、芳香剂、精油、润滑剂、抗痤疮活性物质、抗蜂窝炎活性物质、螯合剂、抗皱活性物质、抗萎缩活性物质、植物甾醇和/或植物激素、N-酰基氨基酸化合物、抗微生物剂、抗真菌剂，以及这些物质的组合。皮肤调理剂的其他非限制性示例可以见于美国专利公布号2010/0272667和2008/0206373以及美国专利号8,790,720中。
实施例
以下实施例展示了针对皮肤色素沉着过度病症构建偏向基因表达标记的方法。在该实施例中提供的偏向基因表达可以用于查询实例数据库，以识别可用于治疗皮肤色素沉着病症的潜在护肤活性物质。
样本采集与处理
经由2mm穿孔活组织检查从77名年龄为20至70岁的人类女性供体收集皮肤组织样本，用作测试样本或对照样本。该实施例中的测试样本是从面部皮肤上存在的色素沉着过度斑点收集的。皮肤科医生将取样的每个色素沉着过度斑点在视觉上分类为以下色素沉着过度病症中的一种：日光性黑子、脂溢性角化病、黄褐斑、雀斑、自然治愈型痤疮病变和发炎后色素沉着过度。对照样本收集自皮肤的不包括色素沉着过度病症(即，不包括色素沉着过度斑点)的相邻部分。使用LCM将皮肤组织样本(即，测试样本和对照样本)分为三个隔室(基底上、基底和真皮)。进一步对真皮隔室进行LCM，以除去毛囊。基底上隔室通常含有约98％的角质细胞。基底隔室通常含有约90％的角质细胞和约10％的黑素细胞。除去毛囊之后，真皮隔室通常含有约70％的成纤维细胞。将基底上层和真皮层用作测试样本，因为在这些隔室中分别存在大量的角质细胞和成纤维细胞。
生成病症谱和对照谱
将来自测试样本和对照样本的基底上隔室的细胞置于单独的容器(12孔板)中，并用350ul/孔的RLT缓冲液(购自Qiagen)裂解。然后将细胞转移到合适的96孔板中，并储存在-20℃。根据制造商的说明，使用
Figure BDA0002735280620000221
组织结合磁珠(购自Beckman Coulter)从RLT缓冲液中分离RNA。根据制造商的说明，使用Affymetrix
Figure BDA0002735280620000231
IVT Plus试剂盒(购自Life Technologies)为每个样本标记0.25ug的总RNA。将所得的经生物素标记和片段化的cRNA与Affymetrix U219
Figure BDA0002735280620000232
品牌微阵列杂交。根据Affymetrix的说明，使用
Figure BDA0002735280620000233
进行对微阵列的清洗、染色和扫描。对测试样本的真皮隔室以及对照样本的基底上隔室和真皮隔室重复这些步骤。
构建病症标记
将如上所述的从测试样本和对照样本的基底上隔室和真皮隔室的微阵列分析获得的基因表达谱用于构建病症标记。通过识别测试样本与其对应的对照样本之间显著差异表达的基因(p≤0.05)并根据p值对上调基因和下调基因进行等级排序来开发病症标记。每种病症标记中包括的来自基底上隔室和真皮隔室的经显著调节的基因的数目示于表1中。
表1-病症标记
Figure BDA0002735280620000234
构建基准标记
使人端粒化角质细胞(tKC)(购自University of Texas，Southwestern MedicalCenter，Dallas，TX)在涂布胶原I的细胞培养瓶和细胞培养板(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)上的含有1X人角质细胞生长补充剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)的
Figure BDA0002735280620000241
培养基中生长。在暴露于基准皮肤试剂之前24小时，将所得的经培养的角质细胞以大约20,000个细胞/cm2的浓度接种到6孔板中。使人皮肤成纤维细胞(来自ATCC，Manassas，VA的BJ细胞系)在普通的细胞培养瓶和细胞培养板(Corning，Lowell，MA)中的补充有10％胎牛血清(HyClone，Logan，UT)的Eagle最低必需培养基(ATCC)中生长。在暴露于基准试剂之前24小时，将经培养的BJ成纤维细胞以12,000个细胞/cm2的浓度接种到6孔板中。接种在孔板中的细胞的数目应当足以产生每孔2至4μg的总RNA。
所有细胞在具有5％CO2的加湿培养箱中在37℃下温育。在t＝-24小时之时，将细胞置于T-75烧瓶中进行胰蛋白酶化，然后接种到6孔板中的基础生长培养基中。在t＝0时，移除培养基并替换为给药溶液。用于测试细胞(即，暴露于基准护肤剂的细胞)的给药溶液包括浓度为按该给药溶液的重量计0.01％(对于角质细胞)和0.1％(对于成纤维细胞)的
Figure BDA0002735280620000243
Figure BDA0002735280620000242
品牌护肤霜。对照细胞的给药溶液与测试细胞的相同，只不过没有基准皮肤试剂。在暴露于给药溶液6小时之后，用350ul/孔的含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)裂解细胞，转移到96孔板中，并在-20℃下储存。
从RLT缓冲液分离来自多批细胞培养物的RNA，并以与如上针对病症标记所述相同的方式生成经处理细胞和对照细胞的基因表达谱。将基准谱与对照谱进行比较，以识别显著差异表达的基因(p≤0.05)，这些基因经等级排序以提供基准标记。
构建偏向病症标记
通过基准标记过滤病症标记中的每个基因，以构建偏向病症标记。如果在该病症标记中存在的基因不存在于基准标记中(即，不表达或未经显著调节)或者未被沿相反方向显著调节，则将该基因从病症标记中移除。一旦来自病症标记的所有基因都通过基准标记过滤，则选择顶部的介于50个与100个之间的上调基因和顶部的介于50个与100个之间的下调基因用作偏向病症标记。每个偏向标记中使用的基因的数量在表2中示出。当然，应当理解，可以选择任何数量的上调基因和/或下调基因用作偏向病症标记。不受理论的限制，据信，查询具有本文的偏向基因表达标记的实例的数据库将产生更可能治疗色素沉着过度的皮肤病症的活性物质的列表。
表2-偏向病症标记
Figure BDA0002735280620000251
查询
使用病症标记和对应的偏向病症标记查询了2658种材料的CMap数据库。已知的亮肤剂紫檀芪的结果在下表3中示出。在该实施例中使用的CMap分数具有+1至-1的范围，其中+1是最高可能的正关联性，而-1是最高可能的负关联性。
表3-潜在护肤剂的CMap分数的比较
Figure BDA0002735280620000252
Figure BDA0002735280620000261
1来自Sabinsa Corp(New Jersey)的
Figure BDA0002735280620000262
2来自ChromaDex，Inc.(California)的
Figure BDA0002735280620000263
从表3中可以看出，偏向病症标记相比非偏向病症标记导致高得多的与实例的负相关性。一般来讲，如果CMap分数的绝对值小于0.4，则不认为它是感兴趣的潜在护肤剂，并且将不被选择用于下一轮测试(例如，体外测试或体内临床测试)。在该实施例中，使用常规标记将不会把紫檀芪识别为用于治疗任何列出的皮肤病症的潜在药剂，而偏向标记的结果表明，紫檀芪可能是用于所有列出的病症的潜在药剂。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为″40mm″的量纲旨在表示″约40mm″。
除非明确排除或以其他方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出多个其他变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有此类变化和修改。

Claims (15)

1.一种用于识别潜在护肤剂的经改进的关联性映射方法，包括：
a)从皮肤组织样本构建病症标记；
b)为所述皮肤组织样本中存在的细胞类型构建基准标记；
c)通过所述基准标记过滤所述病症标记以提供偏向病症标记，其中所述偏向病症标记由多个上调基因和多个下调基因组成，这些基因全部具有等于或小于0.1的p值；
d)查询具有所述偏向病症标记的实例的数据库，其中每个实例与护肤剂相关联；
e)为每个实例生成关联性分数；以及
f)当所述数据库中的实例的所述关联性分数与所述偏向病症标记具有负相关性时，将与所述实例相关联的护肤剂识别为潜在护肤剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中构建所述病症标记包括：
a)从表现出感兴趣的皮肤病症的皮肤的一部分获得人皮肤组织样本；
b)从所述供体获得不表现出所述皮肤病症的人皮肤组织样本；
c)从(a)和(b)中的所述皮肤样本中的每个皮肤样本构建基因表达谱，其中所述基因表达谱各自包含表示所述基因表达谱中的基因的标识符列表；
d)将(c)中的所述基因表达谱互相比较，以识别差异表达的基因；
e)对代表所述差异表达基因的标识符列表进行等级排序；以及
f)从标识符的经等级排序的列表中选择多个上调基因和多个下调基因，以提供所述病症标记。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中构建所述基准标记包括：
a)将多个细胞暴露于基准皮肤试剂，其中所述多个细胞是期望所述基准标记的类型；
b)从所述多个细胞构建基因表达谱；
c)将来自与所述基准护肤剂接触的所述细胞的所述基因表达谱与对照谱进行比较，以识别差异表达的基因；以及
d)对代表所述差异表达基因的标识符列表进行等级排序，以提供所述基准标记。
4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述细胞类型选自由角质细胞、成纤维细胞、黑素细胞和黑素瘤细胞组成的组。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述感兴趣的皮肤病症是皮肤色素沉着过度病症。
6.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述偏向病症标记中的所述多个上调基因和下调基因全部具有等于或小于0.05的p值。
7.根据任一项前述权利要求所述的方法，还包括确定所述数据库中的所述实例中的每个实例的关联性分数，并且如果所述实例具有负关联性分数，则与所述实例相关联的扰动因子被识别为在所述皮肤病症的所述治疗中具有潜在功效的推定皮肤试剂。
8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述基准护肤剂选自烟酰胺、间苯二酚、曲酸、熊果苷、脱氧熊果苷、维生素C化合物、维生素E化合物、巯基化合物、鞣花酸、葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺、衣霉素、蛋白酶抑制剂、N-十一碳烯酰基苯丙氨酸、类视色素、己脒定、醋酸氟轻松、对苯二酚、维甲酸、氢化可的松、植物甾醇、甘草次酸、氨甲环酸、洋甘菊提取物、水杨酸、α-羟基酸、α-酮酸和一磷酸腺苷，醋酸氟轻松、对苯二酚和维甲酸的混合物，以及它们的组合。
9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述偏向病症标记包括50至200个上调基因和50至200个下调基因。
10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中构建所述病症标记和所述基准标记中的至少一者包括：从多个皮肤细胞提取信使RNA(mRNA)，以及将所述mRNA杂交至微阵列。
11.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中构建所述病症标记和所述基准标记中的至少一者包括：从多个皮肤细胞提取mRNA，将所述mRNA逆转录成cDNA，以及将所述cDNA杂交至微阵列。
12.一种制备护肤组合物的方法，包括：
a)根据任一项前述权利要求所述的方法识别护肤剂；以及
b)将所述护肤剂与皮肤病学可接受的载体混合，以提供所述护肤组合物。
13.一种用于实现根据权利要求1所述的方法的系统，包括：
a)计算机可读介质，其上存储有多个实例、所述病症标记和所述基准标记；以及
b)第一计算设备，所述第一计算设备包括致使所述计算设备执行以下操作的计算机可读指令：
i)访问存储在所述计算机可读介质上的所述病症标记和所述基准标记；
ii)通过所述基准标记过滤所述病症标记，以构建所述偏向皮肤病症标记；
iii)访问存储在所述计算机可读介质上的所述实例；
iv)将所述实例中的每个实例与所述偏向皮肤病症标记进行比较，其中所述比较包括将所述偏向皮肤病症标记列表中的每个标识符与所述实例列表中的相同标识符的位置进行比较；以及
v)基于(iv)中的所述比较，将关联性分数分配给所述多个实例中的每个实例。
14.根据权利要求13所述的系统，还包括具有多个探针的微阵列，所述探针经选择以与提取自成纤维细胞或角质细胞的多核苷酸或其衍生物杂交。
15.根据权利要求14所述的系统，还包括微阵列扫描仪，用于扫描所述微阵列并将所述多个杂交探针转换成基因表达数据。
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