CN111979316B - 血浆microRNA在预测肺腺癌脑转移中的用途及其应用 - Google Patents
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Abstract
血浆microRNA在预测肺腺癌脑转移中的用途及其应用。本发明发现hsa‑mir‑6850‑5p与肺腺癌中的脑转移具有显著相关性,且在肺腺癌的脑转移中发挥重要作用,因此本发明通过检测hsa‑mir‑6850‑5p的含量水平用于预测肺癌患者发生脑转移的风险。本发明还发现,hsa‑mir‑6850‑5p能够提高肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,且肺腺癌细胞可能通过外泌体将hsa‑mir‑6850‑5p分泌到细胞外。本发明基于上述发现提供了相应检测或治疗试剂盒。
Description
背景技术
肺癌是世界范围内发病率最高的一种癌症。肺癌传统上分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)两种类型,前者大约占肺癌总病例的80%,后者约20%。依据世界卫生组织2015年关于肺部肿瘤的分类,确定非小细胞肺癌分为腺癌(adenocarcinoma)、鳞状细胞癌(squamous cellcarcinoma,SSC)、大细胞癌(large cell carcinoma,LCC)三种主要类型(Travis WDet.al,2015)。
远端器官的转移是绝大多数肺癌患者死亡的主要原因。肺癌常见的转移器官包括肺、中枢神经系统、颈部淋巴结、骨、肾上腺、肝等部位(Oktay et.al,2018)。在一项对933例经过手术切除的I期非小细胞肺癌患者的研究中,有17.8%的患者在手术切除后发生远端转移,其中肺腺癌患者占54.7%,在这些患者中有29.2%患有脑转移(Hung et.al,2010)。另一项对748例手术切除的肺腺癌患者的回顾性分析研究显示,有182例出现远端转移,51.1%发生对侧肺转移、44.5%发生脑转移、39%发生骨转移、8.9%发生肝转移(Hunget.al,2016)。以上研究表明,在早期的肺腺癌患者中,存在较高的复发脑转移风险,而且脑转移的发生也会导致患者生存期的缩短。
前已述及,在肺癌的患者中,有很大比例出现了手术切除后脑转移,脑转移的发生会对患者的预后产生严重影响。目前已有部分研究对肺癌脑转移产生的机制和治疗方法进行阐述。例如,有研究表明,肺腺癌患者的年龄、KPS(Karnofsky Performance Status)、颅外转移的存在、脑转移的数量以及EGFR和ALK阳性均与预后相关(Sperduto et.al,2017)。还有研究报道,在肺腺癌中EGFR突变和野生型患者初次诊断时脑转移的频率无显著差异;而治疗后,带有EGFR突变的患者更可能发生脑转移(Luo et.al,2017)。在一项对原位肺腺癌组织与脑转移灶组织比较研究中发现,与K-ras突变相比,肺腺癌中EGFR突变的状态在原发和转移部位之间相对一致,但仍有少数肺腺癌病例表现出EGFR突变状态的不一致。如果来自转移或复发部位的组织可用于评估靶向治疗,则建议重复分析EGFR突变(Rau et.al,2016)。
虽然已有较多的关于肺癌脑转移的机制研究,但其发生的根本原因和机制尚未解释清楚。另一方面,针对肺癌术后脑转移的预测研究也较少。因此,本申请期望从血浆中寻找能够预测或指示肺癌发生脑转移风险的标志物。
发明概述
本发明通过肺腺癌患者手术前血浆中的标志物,预测肺腺癌患者脑转移的风险。
具体地,本发明在患者术后复发脑转移相关的microRNA发现阶段,采用了术后复发脑转移与未复发脑转移的肺腺癌患者作为样本,通过microRNA芯片筛选在二者血浆中差异表达的microRNA,共筛选到4个在复发脑转移患者中表达上调的microRNA,四个表达下调的microRNA。通过对差异表达的microRNA进行靶基因预测与功能富集分析和信号通路富集分析,结果显示,下调的靶基因富集到了较多的与肿瘤相关的信号通路,提示其可能具有肿瘤抑制的功能。随后将预测到的靶基因与TCGA中发生淋巴结转移和远端转移相关的差异表达基因取交集,再进行功能富集与信号通路富集分析,结果显示,表达上调的microRNA富集到与脑膜、后脑、小脑发育相关的基因,提示表达上调的microRNA可能与肺腺癌的脑转移具有相关性。
本发明还进一步确认筛选到的差异表达的microRNA是否与肺腺癌患者术后复发脑转移相关,对筛选得到的差异表达的microRNA在更多的患者中进行验证。同样采用肺腺癌患者术前采集血浆,将患者依据预后信息分为未复发组、肺部复发组、复发远端转移组(不含脑转移)、复发脑转移组四个小组,发现在复发脑转移小组中,血浆中hsa-mir-6850-5p的含量显著高于其他三个小组,其他三个小组之间则无显著性差异,说明血浆中hsa-mir-6850-5p的含量与肺腺癌术后脑转移复发具有显著相关性。
本发明同时选取了I期与IV期且伴随脑转移的肺腺癌患者血浆作为样本,研究hsa-mir-6850-5p在肺腺癌的脑转移中发挥作用。结果显示,在IV期且伴随脑转移患者血浆中hsa-mir-6850-5p的含量显著高于I期患者,说明hsa-mir-6850-5p在肺腺癌的脑转移中发挥重要作用。
此外,本发明还进一步对hsa-mir-6850-5p的功能进行研究,发现hsa-mir-6850-5p能够显著的促进肺腺癌细胞A549的增殖、迁移和侵袭能力,表明其对肿瘤的发展具有促进作用。本发明同时还检测了肺腺癌细胞对hsa-mir-6850-5p的分泌能力,发现在A549与H2347细胞分泌的外泌体中,hsa-mir-6850-5p的含量均显著高于细胞中的含量,说明肺腺癌细胞通过外泌体将hsa-mir-6850-5p分泌到细胞外环境中,从而发挥作用。
本公开内容的示例性技术方案如下:
检测microRNA的试剂在制备用于预测肺癌患者中发生脑转移的风险的试剂盒中的用途。
前述项的用途,其中所述microRNA为hsa-mir-6850-5p。
前述项的用途,其中所述肺癌为非小细胞肺癌。
前述项的用途,其中所述非小细胞肺癌为肺腺癌。
前述项的用途,其中所述脑转移发生在手术治疗前或手术治疗后。
前述项的用途,其中所述试剂盒通过检测所述microRNA的含量实现肺癌患者脑转移风险的预测。
前述项的用途,其中hsa-mir-6850-5p水平上调时指示患者发生脑转移的可能性高。
前述项的用途,其中检测所述microRNA的含量是通过qPCR方法实现。
microRNA在制备用于抑制肺癌进展的药物的用途,其中所述microRNA为hsa-mir-6850-5p。
前述项的用途,其中所述肺癌为非小细胞肺癌,优选为肺腺癌。
前述项的用途,其中所述进展包括肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。
前述项的用途,其中所述脑转移发生在手术治疗前或手术治疗后。
一种预测肺癌患者中发生脑转移风险的试剂盒,其包含检测hsa-mir-6850-5p含量的试剂。
前述项的试剂盒,其中所述肺癌为非小细胞肺癌,优选为肺腺癌。
前述项的试剂盒,其中所述脑转移发生在手术治疗前或手术治疗后。
一种抑制肺癌进展的药物,其含有抑制hsa-mir-6850-5p的组分。
前述项的药物,其中所述肺癌为非小细胞肺癌,优选为肺腺癌。
前述项的药物,其中所述进展包括肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。
前述项的药物,其中所述脑转移发生在手术治疗前或手术治疗后。
附图说明
图1各样本microRNA表达量散点图。使用seaborn库(python3.6)对标准化的microRNA数据绘制散点图,查看数据的分布集中趋势。对单变量图使用核密度估计曲线表示,并绘制每个点图的线性回归曲线。
图26例样本的主成分分析图。其中,红色代表3例复发脑转移患者;蓝色代表3例未复发转移患者。用标准化后的microRNA芯片数据分析。使用sklearn库(python 3.6)的PCA函数进行计算。
图3 microRNA差异表达火山图。其中,红色代表没有差异表达的microRNA;蓝色代表差异表达的microRNA。筛选条件:变化倍数大于等于1.2,p值小于等于0.05。
图4差异表达microRNA聚类热图。以皮尔森相关系数作为样本和microRNA间的距离进行聚类。并对每个microRNA的表达量进行标准化。
图5上调microRNA预测的靶基因GO富集分析。以p调节值小于0.05为条件,选取各组富集结果的前10个进行展示。
图6下调microRNA预测的靶基因GO富集分析。以p调节值小于0.05为条件,选取各组富集结果的前10个进行展示。
图7上调microRNA预测的靶基因KEGG信号通路分析。以p调节值小于0.05为条件,对富集结果进行展示。
图8下调microRNA预测的靶基因KEGG信号通路分析。以p调节值小于0.05为条件,选取富集结果的前30个进行展示。
图9 TCGA非小细胞肺癌淋巴结转移相关差异表达基因筛选。a.淋巴结转移相关差异表达基因MA-plot;b.淋巴结转移相关差异表达基因火山图。
图10 TCGA非小细胞肺癌远端转移相关差异表达基因筛选。a.远端转移相关差异表达基因MA-plot;b.远端转移相关差异表达基因火山图。
图11用TCGA中与转移相关的基因筛选靶基因。用韦恩图对三组基因列表进行匹配。a.表达上调的microRNA预测的靶基因与TCGA中非小细胞肺癌转移相关的基因;b.表达下调的microRNA预测的靶基因与TCGA中非小细胞肺癌转移相关的基因。
图12上调microRNA预测的与转移肿瘤转移相关的靶基因GO富集分析。以p调节值小于0.05为条件,选取各组富集结果的前10个进行展示。
图13下调microRNA预测的与转移肿瘤转移相关的靶基因GO富集分析。以p调节值小于0.05为条件,选取各组富集结果的前10个进行展示。
图14下调microRNA预测的与转移肿瘤转移相关的靶基因KEGG富集分析。以p调节值小于0.05为条件,选取富集结果的前10个进行展示。
图15不同预后的肺腺癌患者的生存曲线。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。生存时间以月表示。
图16 hsa-mir-6850-5p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。**:p值小于等于0.01;*:p值小于等于0.05。
图17 hsa-mir-642b-3p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图18 hsa-mir-7847-3p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图19 hsa-mir-6752-5p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图20 hsa-mir-634在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含
图21 hsa-mir-6861-3p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图22 hsa-mir-4749-3p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图23 hsa-mir-3675-3p在不同预后的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:30月内未复发转移组;第2组:肺部复发;第3组:其他部位复发转移(不包含脑);第4组:复发脑转移。
图24 hsa-mir-6850-5p在I期肺腺癌患者与IV期且发生脑转移的肺腺癌患者中的表达情况。第1组:I期患者;第2组:IV期患者且伴有脑转移。*:p值小于等于0.05。
图25 hsa-mir-6850-5p转染效率检测。细胞转染24小时后,提取细胞总RNA检测hsa-mir-6850-5p的表达水平。**:p值小于等于0.01。
图26 hsa-mir-6850-5p对A549细胞增殖的影响。将细胞接种于96孔板后,分别在24h、48h、60h、72h检测其增殖变化。*:p值小于等于0.05。
图27 hsa-mir-6850-5p对A549细胞迁移能力的影响。a.hsa-mir-6850-5p模拟物处理的A549细胞与对照模拟物处理的A549细胞的迁移状态。b.hsa-mir-6850-5p模拟物处理的A549细胞与control模拟物处理的A549细胞迁移穿过小室数量统计。**:p值小于等于0.01。
图28 hsa-mir-6850-5p对A549细胞侵袭能力的影响。a.hsa-mir-6850-5p模拟物处理的A549细胞与对照模拟物处理的A549细胞的侵袭状态。b.hsa-mir-6850-5p模拟物处理的A549细胞与对照模拟物处理的A549细胞侵袭通过Matrigel并穿过小室的数量统计。*:p值小于等于0.05。
图29不同肺腺癌细胞及其外泌体中hsa-mir-6850-5p含量。a.A549细胞与A549外泌体中hsa-mir-6850-5p的表达量。b.H2347细胞与H2347外泌体中hsa-mir-6850-5p的表达量。**:p-值小于等于0.01。
具体实施方式
实施例1:肺腺癌患者术后脑转移相关的血浆microRNA
本研究中将血浆中的microRNA作研究对象。在脑转移相关的血浆microRNA的发现阶段,使用患者手术前采集的血浆,依据术后随访信息将肺腺癌患者分为24个月内复发脑转移与未复发两组进行筛选。依据样本质量(是否溶血)、年龄、分期、淋巴结转移、家族史等信息,筛选得到6例相对应的肺腺癌患者血浆样本。从6例患者血浆中提取小RNA后,采用Aglient Human miRNA芯片对其进行检测,用于筛选差异表达的microRNA。
一、材料、仪器设备和方法
1.肺腺癌患者血浆样本
依据患者的年龄、分化、分期、家族史等信息,筛选6例肺腺癌患者的血浆作为研究对象,其中3例24个月内复发脑转移患者,3例未复发脑转移患者。两组患者平均年龄、采集血浆时的分期等相接近,均无家族史,性别均为两名男性、一名女性。患者的详细信息见表1。
2.microRNA检测芯片
对血浆中microRNA的检测采用安捷伦公司的Agilent Human miRNA V21.0(8*60K,货号G2534-60015)芯片,可检测2549个人成熟的microRNA,对样本总RNA起始量要求仅100ng,不需要分离microRNA,检测下限小于0.1amol,可以有效区分成熟的microRNA与前体microRNA。
3.主要试剂
对血浆中的microRNA提取,采用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute Serum/Plasma miRNA Isolation kit(货号:DP503),包括:裂解液MZA、漂洗液RW、去蛋白液MRD、RNase-Free ddH2O、RNase-Free吸附柱miRelute(含2mL收集管)、RNase-Free离心管(1.5mL)。
芯片杂交试剂:Gene Expression Wash Pack(Agilent,货号5188-5327),miRNAcomplete Labeling and Hyb Kit(Agilent,货号5190-0456),miRNA Spike In Kit(Agilent,货号5190-1934)。
4.实验方法
4.1血浆中小RNA的提取
1)从-80℃冰箱中取出冻存血浆,置于冰上融化,融化后的血浆若存在沉淀,则应以2,000g4℃,离心20min,以除去沉淀。
2)取不多于200μL的血浆于RNase-Free离心管中,加入900μL裂解液MZA,涡旋30s至完全匀浆,颠倒混匀。
3)室温放置5min,使得核酸与蛋白质的复合物完全分离。
4)每管加入200μL氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置5min。
5)13,400g,4℃,离心15min,样品会分成3层:黄色的有机相,白色的中间层和无色的水相,RNA主要在水相中,将水相转移到新的RNase-Free离心管中,进行下一步操作。
6)量取转移液(水相)的体积,缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇(如:500μL的转移液加1mL无水乙醇),混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute,室温放置2min,室温13,400g离心30s,离心后弃掉流出液,保留吸附柱miRelute。
7)向吸附柱miRelute中加入700μL去蛋白液MRD(使用前检查是否已加入无水乙醇),室温静置2min,室温、13,400g离心30s,弃废液。
8)向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW(使用前检查是否已加入无水乙醇),室温静置2min,室温13,400g离心30s,弃废液。重复此步一次。
9)室温13,400g离心2min,弃收集管,将吸附柱miRelute在室温放置片刻,以充分晾干。
10)将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free离心管中,向吸附膜中心位置加15-30μL RNase-Free ddH2O,室温放置2min,室温13,400g离心2min。将得到的产物再次转移到吸附膜上,室温放置2min,室温13,400g离心2min,以提高RNA的得率。
4.2 RNA质量检测
用Agilent 2100生物芯片分析系统,检测所提取的RNA的质量及microRNA含量。
4.3芯片杂交
RNA质检合格后,参照芯片标准流程进行样本的标记、芯片的杂交以及洗脱。首先,总RNA经过去磷酸化,样品变性,再进一步用Cyanine-3-CTP(Cy3)标记。标记好的RNA纯化后和芯片杂交,洗脱后利用Agilent Scanner G2505C(Agilent Technologies)扫描得到原始图像。扫描完成后,通过Feature Extraction软件进行数据的抽提,得到原始数据文件。
4.4 microRNA分析方法
原始文件经Genespring标准化后,进行后续分析。通过TargetScan(Release 7.2,March 2018)数据库预测microRNA的靶基因。通过Gene Ontology与KEGG数据库进行功能聚类及通路分析。绘图及数据处理使用R-3.5.0与python3.6。
二、实验结果
1.样本提取效率检测
血浆中的小RNA提取后,应冻存在-80℃冰箱中并尽快使用,以免RNA的降解。在进行芯片检测之前,应确保血浆中的小RNA能够有效地提取,以便后续实验的顺利进行。但是对于血浆、体液、外泌体等特殊样本所制备的RNA来说,每次抽提得到的microRNA含量极低,在一定的样本量范围内,得量通常在5-10ng左右,其检出率、信号值等相比正常样本也会低很多。样本提取后,进行Agilent2100定量分析。本次实验中所提取的血浆中的microRNA的量基本满足此芯片的需求,提取结果见表2。
表2 6例肺腺癌患者血浆小RNA提取结果
2.microRNA芯片鉴定结果
为了筛选能够预测肺腺癌患者术后脑转移复发风险的microRNA,采用了对RNA总量要求较低的Agilent Human miRNA V21.0芯片,对2549个人成熟的microRNA进行检测。芯片的结果显示,每个样本鉴定到的microRNA数目在130到210个左右,中间CV值均在11%以下,说明芯片结果质量可靠。每个样本鉴定到的microRNA数目及中间CV值见表3。
表3 microRNA芯片鉴定结果
随后,用标准化后的microRNA表达数据绘制散点图(pairplot)用以评估两组数据总体的分布集中趋势(图1)。采用标准化后的microRNA表达数据进行主成分分析(Principal component analysis,PCA),查看了六个样本的分布情况。如图2所示,红色代表复发脑转移的三例患者,蓝色代表未复发转移的三例患者,患者分组情况良好。
3.差异表达microRNA的筛选
对microRNA芯片原始数据用Genespring软件进行标准化后计算差异表达的microRNA。由于血浆样本的特殊性,所以在计算差异表达的microRNA之前,需要对标准化后的数据进行过滤,用于比较的每组样本中至少有一组100%标记为Detected的探针留下进行后续分析。利用T检验的p值和倍数变化值进行差异microRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值大于等于1.2且p值小于等于0.05,最终筛选到8个差异表达的microRNA(图3)。其中在复发脑转移患者血浆中表达上调的microRNA有4个,分别是has-miR-6850-5p、has-miR-6752-5p、has-miR-7847-3p、has-miR-642b-3p;在复发脑转移患者中下调表达的microRNA有4个,分别是has-miR-634、has-miR-3675-3p、has-miR-4749-3p和has-miR-6861-3p。随后绘制了8个差异表达的microRNA的聚类热图(图4),用这8个差异表达microRNA可以很好地将样本分为未复发组和复发脑转移组。
4.差异表达的microRNA的靶基因预测及功能分析
为探索筛选到的差异microRNA的潜在功能,首先对筛选到的8个在两组患者中差异表达的microRNA进行靶基因预测。选择Targetscan数据库进行靶基因预测。Targetscan数据库使用了互补位点类型及其他14个特征来构建microRNA靶基因预测模型。对上调与下调的microRNA分别进行靶基因的预测,去除每组预测的重复基因之后,进行功能富集分析。上调的4个microRNA共预测到了4794个靶基因,下调的4个microRNA预测到了8558个基因。
用Gene Ontology数据库进行靶基因的功能富集分析,以p调节值小于0.05为筛选条件,并取聚类的前10位比较。上调的microRNA预测到的靶基因GO富集分析显示这些靶基因参与Wnt信号通路、细胞内转运调节、神经递质转运等生物过程相关,与肌动蛋白细胞骨架、突触、神经细胞体等细胞组成成分有关,具有磷脂和磷脂酰肌醇磷酸结合、转录激活、离子跨膜转运通道激活等分子功能(图5)。下调的microRNA预测到的靶基因GO富集分析显示,这些靶基因涉及上皮形态的发生、轴突发育、RAS蛋白信号转导、腺体和肾脏系统发育、蛋白质在细胞周围定位、调节小GTP酶介导的信号转导等生物过程,其细胞成分的富集则与上调的microRNA预测到的靶基因类似涉及多种突触和神经元的组成,分子功能则DNA转录激活子激活、转录因子激活、离子跨膜转运通道激活、泛素-蛋白转运激活相关(图6)。
信号通路富集分析使用KEGG数据库,同样采取p调节值小于0.05作为筛选条件。如图7、8所示,二者KEGG信号通路的富集显示出较大的差异。上调的microRNA预测到的靶基因仅富集到催产素信号通路、吗啡成瘾和突触小泡循环三条通路;而下调的microRNA预测到的靶基因则富集到较多的肿瘤相关的信号通路,如MAPK信号通路、RAS信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路,以及与乳腺癌、胃癌等多种癌症相关。
5.TCGA数据作为靶基因筛选的参考
由于通过数据库算法所预测到的microRNA靶基因数目过多,导致功能富集的结果存在一定的偏差,因此期望通过公共数据库中与肿瘤转移相关的差异基因来缩小靶基因的范围。选取了513例TCGA数据库中的非小细胞肺癌患者的RNA-Seq数据进行肿瘤转移相关的差异基因筛选,以是否发生淋巴结转移和(或)远端转移为条件分别进行筛选,选用foldchange大于等于1.2、p调节值小于等于0.05作为筛选阈值。在513例患者中,有171例患者发生淋巴结转移,330例未发生淋巴结转移,其余未评估,共筛选到9108个在淋巴结转移患者中表达上调的基因,1093个表达下调的基因(图9)。在513例患者中,有25例发生远端转移,344例未发生远端转移,其余未评估,共筛选到353个在转移患者中表达上调的基因,244个表达下调的基因(图10)。
将两组差异表达的基因合并后,与预测到的靶基因取交集,以此将靶基因的范围缩小为与肿瘤转移相关的基因,随后再进行功能富集分析。对表达上调的microRNA筛选到的靶基因有678个,表达下调的microRNA筛选到的靶基因有1198个(图11)。
对于表达上调的microRNA筛选到的678个靶基因进行功能富集分析,发现除了与轴突发育、突触形成以外,这些靶基因与后脑、脑膜、小脑的发育过程相关,其细胞成分也与胞外基质、突触膜成分等相关,分子功能同样显示出与多种离子通道激活相关。而表达下调的microRNA筛选到的1198个靶基因与膜电位调节、突触信号调节、钙离子转运、多细胞生物信号传导、调节突触后膜电位、传递神经冲动等多个与神经信号传导调节相关生物过程相关,其细胞成分组成也与突触膜成分、离子通道转运复合体相关,富集到的分子功能也与多种通道激活相关(图12、13)。
KEGG信号通路富集分析的结果中,上调microRNA筛选到的678个靶基因并未富集到KEGG中的信号通路;表达下调的microRNA筛选到的1198个靶基因富集到神经活性配体-受体相互作用、cAMP、心肌病、甲状腺激素合成、蛋白质消化吸收、胃酸分泌、尼古丁成瘾等信号通路(图14)。
5.小结
1)通过对3例复发脑转移与3例未复发转移的肺腺癌患者血浆microRNA的分析发现4个在复发脑转移患者中表达上调的microRNA,4个表达下调的microRNA。PCA分析及聚类热图显示,患者的分组情况良好。
2)上调的microRNA预测的靶基因显示出与Wnt信号通路、胞内转运等生物过程相关,下调的microRNA预测到的靶基因则与上皮形态发生、轴突发育、肾脏发育等生物过程相关。对信号通路的富集显示,下调microRNA预测到的靶基因与较多的肿瘤相关信号通路有关,猜测其可能具有肿瘤抑制的功能。
3)上调的microRNA预测到的与转移相关的靶基因富集到了脑膜、后脑、小脑发育相关的生物过程,且与细胞外基质组成相关,提示上调的microRNA可能与肺腺癌的脑转移具有一定的相关性。
实施例2:差异表达microRNA在不同患者中的验证
由于初期筛选所用样本量较小,为了验证初期筛选到的8个差异表达的microRNA是否能够有效预测肺腺癌患者术后复发脑转移的风险,排除不相关microRNA以及假阳性的影响,进一步选取了另外的两组患者手术前采集的血浆进行差异表达的microRNA的验证。为扩大可选择的样本量,将复发转移的时间划定为30个月。第一组患者依据随访信息分成4个组,分为未复发组、肺部复发组、复发远端转移组、复发脑转移组;第二组患者依据其诊断时的分期及是否发生脑转移,划分为I期未发生脑转移与IV期发生脑转移两组。对这两组肺腺患者血浆中的microRNA进行验证,以此筛选与肺腺癌复发脑转移相关的microRNA。
一、材料、仪器设备和方法
1.试验材料
1.1两组肺腺癌患者血浆样本
第一组样本中共38例肺腺癌患者血浆样本,依据术后30个月内复发转移情况,分为未复发转移组9例,肺部复发组4例,复发远端转移(不含脑转移)组12例,复发脑转移组13例。患者详细信息见表4。
第二组样本中共9例肺腺癌患者血浆样本,依据患者诊断时的分期及是否发生脑转移分为两组,为I期未发生脑转移患者6例,IV期发生脑转移患者3例。患者详细信息见表5。
1.2主要试剂
10×Poly(A)Pol Reaction Buffer(NEW ENGLAND BioLabs)、Adenosine 5’Triphosphate 10mm(ATP,NEW ENGLAND BioLabs)、E.cloiPoly(A)Polmerase(NEW ENGLANDBioLabs)、RevertAid First Standard Cdna Synthesis Kit(Thermo)、KAPA SYBR FASTqPCR Master Mix(2×)(KAPA BIOSYSTEM)、ddH2O
1.3反转录引物
反转录所用的反向引物QmiR-RT序列为(5′至3′):
GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCG
1.4 qPCR引物
qPCR引物见表6。
表6 qPCR引物
二、实验结果
1.差异表达microRNA在不同预后情况肺腺癌患者中的验证
对第一组患者进行microRNA的检测,将第一组患者分为未复发转移组(第1组,n=9),肺部复发组(第2组,n=4),复发远端转移(不含脑转移)组(第3组,n=12),复发脑转移组(第4组,n=13)四个小组。首先对这四个小组的患者的生存期绘制生存曲线,如图15,未复发组患者的生存期明显好于其他三组,表明复发转移对患者生存期有较大影响。
qPCR检测的结果显示,hsa-mir-6850-5p在第1组到第4组有逐渐升高的趋势,如图16所示。相对其他三组来说,复发脑转移组中hsa-mir-6850-5p的表达量显著的升高,其他三组之间则无显著性差异,表明hsa-mir-6850-5p的高表达可能是肺腺癌患者术后复发脑转移的重要标志。其他microRN在各组中的表达则无显著性差异(附图17-23)。
2.hsa-mir-6850-5p在I期与IV期脑转移患者中的表达
为进一步验证hsa-mir-6850-5p是否与肺腺癌的脑转移相关,我们选择了一组在诊断时为IV期且发生脑转移的患者(3例)进行验证,并选择I期、无远端转移的患者作为对照(6例)。如图24,qPCR结果显示,hsa-mir-6850-5p在肺腺癌脑转移患者的血浆中表达量显著升高。结果表明,hsa-mir-6850-5p与肺腺癌的脑转移密切相关。
3.小结
1)30月内未复发、肺部复发、复发远端转移(不含脑转移)、复发脑转移组肺腺癌患者的生存曲线分析,表明复发转移是影响患者生存期的重要原因。
2)hsa-mir-6850-5p在上述四组患者血浆中的含量呈现上升的趋势,复发脑转移组较其他组显著上升,表明肺腺癌患者血浆中hsa-mir-6850-5p的升高可能预示患者术后脑转移风险较高。
3)在初治IV期脑转移的患者血浆中的hsa-mir-6850-5p的表达量显著高于I期患者,表明hsa-mir-6850-5p在肺腺癌脑转移过程中发挥重要的作用。
实施例3:hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞的作用
前期实验表明,hsa-mir-6850-5p在肺腺癌复发脑转移与IV期伴随脑转移患者的血浆中高表达,表明hsa-mir-6850-5p在肺腺癌的脑转移中发挥重要的作用。为进一步了解hsa-mir-6850-5p在肺腺癌脑转移过程中的影响,进一步检测了hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞的影响。使用hsa-mir-6850-5p模拟物处理肺腺癌细胞系A549,检测肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化,用以说明hsa-mir-6850-5p在肺腺癌细胞中发挥的功能,并且检测了肺腺癌细胞对hsa-mir-6850-5p的分泌能力,来表明血浆中hsa-mir-6850-5p的可能来源。
一、材料、仪器设备和方法
1.试验材料
1.1细胞系
肺腺癌细胞系A549、H2347:RPM1640培养基,添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素,37℃、5%CO2培养。
1.2主要试剂
RPMI1640培养基(GIBCO,ThermoFisher)、Opti-MEM(GIBCO,ThermoFisher)、胎牛血清(PAN)、Penicillin/Streptomycin Sol(Life technologies)、Trypsin 0.25 EDTA(Life technologies)、二甲基亚砜(sigma)、生理盐水、Lipofectamine 2000(invitrogen)、TRIzolTM Reagent(Life Technologies)、CCK8、基质胶Matrigel Matrix(Biosciences)、苏木素-伊红染色液(珠海贝索)、氯仿、异丙醇、无水乙醇、DEPC水、ExoQuick-TCTM Exosome Precipitation Solution(System Biosciences)。
1.3反转录引物以及qPCR引物
同实施例2
1.4 microRNA模拟物
Hsa-mir-6850-5p模拟物:
Sense(5’-3’):GUGCGGAACGCUGGCCGGGGCG
Anti sense(5’-3’):CCCCGGCCAGCGUUCCGCACUU
microRNA模拟物s双链阴性对照:购于吉玛基因,基于线虫C.elegans的micoRNA设计的,已经通过BLASTN比对所有的人、小鼠以及大鼠的基因组序列以及microRNA序列。
1.5主要设备
全波长微孔扫描仪(Bio-Rad)、显微镜(Olympus)、CO2培养箱(Thermo)、Nanodrop、超净台、高速离心机(Bakeman)、超速离心机(Bakeman)。
二、实验方法
1.microRNA模拟物转染
1、转染前一天铺六孔板,依据细胞增殖速度确定细胞量,1×105-4×105个细胞每孔,保证第二天转染时细胞密度在60-70%之间。
2、转染试剂准备:
250μL Opti-MEM加10μL(0.1μg/μL)micrcoRNA模拟物,混匀,静置5min;
250μL Opti-MEM加5μL Lipofectamine 2000,混匀,静置5min;
将二者混合后,静置20min。
3、弃掉六孔板中培养基,生理盐水洗涤两次,每孔中加入1.5mLRPMI1640培养基(10%FBS,无双抗)。
4、加入混合好的转染试剂,37℃培养箱,培养4h。
5、将培养基置换为RPMI1640培养基(10%FBS,1%Penicillin/Streptomycin)继续培养6-12h后进行下一步实验。
2.细胞与exosome总RNA提取
1)将培养的细胞弃掉培养基,生理盐水洗涤两次后加入TRIzol,每10cm培养皿加入2-3mL TRIzol,细胞刮刮取产物并转移至1.5mL离心管。若为提取exosome总RNA,则直接向exosomechen淀中加入适量TRIzol并转移至1.5mL离心管中。
2)将离心管涡旋振荡至完全均匀,室温静置5min。
3)每1mL TRIzol,加入200μL氯仿,剧烈震荡15s,室温静置5min。
4)4℃,12,000g离心15min,将上层水相转移至新的1.5mL离心管中,避免吸入白色沉淀,防止蛋白污染。
5)加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置10min。
6)4℃,12,000g离心10min,RNA沉淀位于底部。
7)弃上清,加入1mL75%乙醇(DEPC H2O配置)洗涤。
8)4℃,7,500g离心5min,弃上清。
9)重复步骤7-8一次。
10)提取的RNA晾干后,加入20-40μL DEPC H2O,溶解后置于冰上并进行浓度测定和后续实验,也可短期冻存于-80℃。
3.总RNA加尾
同实施例2
4.反转录合成cDNA以及qPCR检测
同实施例2
5.细胞增殖测定
1)转染后的细胞消化并计数,稀释至1×104/mL。
2)将细胞悬液分别加入96孔板中,每孔200μL细胞悬液(2000细胞)每个处理至少4个平行,并加入无细胞的培养基作为空白对照,共平行处理4张96孔板。
3)将96孔板置于培养箱中分别培养24、48、60、72h。
4)配置CCK8检测试剂,每100μL培养基加入10μL CCK8溶液
5)吸净96孔板中的培养基,每孔中加入200μL配置好的溶液,培养箱中孵育2h。
6)酶标仪测定OD450吸光度,实验结束后计算增殖曲线。
6.细胞迁移实验
1)转染后的细胞,换用RPMI1640培养基(无血清、无双抗)饥饿处理12-24h,消化重悬并转移至15mL离心管中,1,000rpm离心5min。
2)弃掉离心后上清,用生理盐水洗涤一次,1000rpm离心5min。
3)弃掉离心后上清,用适当体积PRMI1640培养基(无血清、无双抗)重悬并计数。
4)向Transwell下层小室中加入600μL RPMI1640培养基(20%血清、1%双抗)。
5)将重悬的细胞接种于Transwell上层小室中,每孔2×104细胞,200μL。上层小室放入时注意不能产生气泡。
6)37℃培养24h。
7)培养结束后,取出上层小室,弃掉培养基,并用棉签轻柔擦除小室中的的细胞,注意不能蹭到小室膜的下表面。
8)将小室置于新的24孔板中,向下层小室加入700μL 4%多聚甲醛,固定30min。
9)取出小室,置于苏木素染液中染色20min。
10)缓慢冲洗小室,置于伊红染液中染色20min。
11)缓慢冲洗小室并充分晾干,拍照计数
7.细胞侵袭实验
1)转染前4-6h,以预冷的RPMI1640培养基(无血清、无双抗)按1:7稀释Matrigel。
2)向Transwell上层小室中各加入40μL稀释后的Matrigel,轻敲小室侧壁使其均匀铺在小室膜上,37℃培养箱放置4-6h使其凝固。
3)转染后的细胞,换用RPMI1640培养基(无血清、无双抗)饥饿处理12-24h,消化重悬并转移至15mL离心管中,1,000rpm离心5min。
4)弃掉离心后上清,用生理盐水洗涤一次,1000rpm离心5min。
5)弃掉离心后上清,用适当体积RPMI1640培养基(无血清、无双抗)重悬并计数。
6)向Transwell下层小室中加入600μL 1640培养基(20%血清、1%双抗)。
7)将重悬的细胞接种于Transwell上层小室中,每孔1×105细胞,200μL。上层小室放入时注意不能产生气泡。
8)37℃培养48h。
9)培养结束后,取出上层小室,弃掉培养基,并用棉签轻柔擦除小室中的的细胞与Matrigel,注意不能蹭到小室膜的下表面。
10)将小室置于新的24孔板中,向下层小室加入700μL 4%多聚甲醛,固定30min。
11)取出小室,置于苏木素染液中染色20min。
12)缓慢冲洗小室,置于伊红染液中染色20min。
13)缓慢冲洗小室并充分晾干,拍照计数。
8.外泌体(exosome)提取
1)贴壁细胞培养至60-70%时换用1640培养基(10%exosome-free FBS,l%双抗),培养24h。
2)收取培养基转移至50mL离心管中,300g离心10min,取上清转移至高速离心管中。
3)16,500g,4℃离心30min,取上清。
4)将上清以0.22μm滤器过滤,转移至超速离心管中,配平至小数点后两位。
5)120,000g,4℃离心2h。
6)弃上部溶液至1mL,吹匀后转移至15mL离心管中,按5∶1比例加入ExoQuick-TC,4℃孵育12-24h。
7)1,500g,4℃离心30min,弃上清至100μL左右。
8)1,500g,4℃离心2min,弃尽上清。
9)收取的exosome可直接加入TRIzol冻存,用于后续RNA的提取。
三、实验结果
1.hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞增殖的影响
为检测hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞的影响,我们使用hsa-mir-6850-5p模拟物转染A549细胞系,并在转染24h后检测了转染的效率。如图25所示,hsa-mir-6850-5p模拟物转染后,A549细胞系中hsa-mir-6850-5p含量显著升高。
用hsa-mir-6850-5p模拟物转染A549细胞系后,在24h、48h、60h、72h分别用CCK8进行检测,查看其增殖变化。如图26所示,hsa-mir-6850-5p模拟物处理的A549细胞在48h内表现出了增殖能力的升高,在72h,hsa-mir-6850-5p模拟物处理的细胞增殖显著高于阴性对照组。表明hsa-mir-6850-5p能够显著促进肺腺癌细胞的增殖能力。
2.hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞迁移的影响
我们随后用hsa-mir-6850-5p模拟物转染A549细胞并检测其迁移能力的变化。将细胞以RPMI1640无血清、无双抗培养基重悬后接种于Transwell小室中,对穿过膜的细胞进行染色并统计结果。如图27所示,hsa-mir-6850-5p模拟物转染的A549细胞迁移的数量明显多于对照组。说明hsa-mir-6850-5p可以促进肺腺癌细胞的迁移能力。
3.hsa-mir-6850-5p对肺腺癌细胞侵袭的影响
在迁移实验结果的基础上,我们对hsa-mir-6850-5p能否引起肺腺癌细胞侵袭能力的改变进行检测。以hsa-mir-6850-5p模拟物转染A549细胞后,接种到铺有Matrigel的Transwell小室中,检测其穿过Matrigel和小室膜的能力,以此来评估其侵袭能力的改变。如图28所示,hsa-mir-6850-5p模拟物处理后的A549细胞侵袭能力显著增强,说明hsa-mir-6850-5p可以提高肺腺癌的侵袭能力。
4.肺腺癌细胞分泌hsa-mir-6850-5p能力
为了解血浆当中hsa-mir-6850-5p的可能来源,我们查看了肺腺癌细胞系分泌hsa-mir-6850-5p的能力。我们提取了两种肺腺癌细胞系所分泌的外泌体,与其分泌细胞内的hsa-mir-6850-5p含量进行比对。如图29所示,两种细胞系分泌的外泌体中hsa-mir-6850-5p的含量,均显著高于细胞系本身,说明肺腺癌细胞能够通过exosome将hsa-mir-6850-5p分泌到细胞外的环境当中,以此影响血浆中hsa-mir-6850-5p的含量变化。
5.小结
1)hsa-mir-6850-5p可以显著促进A549细胞的增殖,提高其迁移和侵袭的能力,显示出hsa-mir-6850-5p对肿瘤的促进作用。
2)两种肺腺癌细胞分泌的外泌体中hsa-mir-6850-5p的含量显著高于细胞中的含量,说明肺腺癌细胞可能通过外泌体将hsa-mir-6850-5p分泌到细胞外部环境。
Claims (2)
1.检测microRNA的试剂在制备用于预测肺腺癌患者中发生脑转移风险的试剂盒中的用途,其中所述microRNA为hsa-mir-6850-5p,所述试剂盒是通过qPCR检测患者血浆中hsa-mir-6850-5p的含量来实现肺腺癌患者脑转移风险的预测,其中所述hsa-mir-6850-5p在肺腺癌伴随脑转移患者血浆中的表达量相对于未发生脑转移患者中的表达量显著升高。
2.如权利要求1所述的用途,其中所述脑转移发生在手术治疗前或手术治疗后。
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