CN111979087A - 一种pcr微反应室芯片及其进样方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PCR微流控芯片及其进样方法。所述芯片包括芯片本体，设置在芯片本体内的反应杯、混合腔、储油腔以及PCR微反应室阵列；所述PCR微反应室阵列包括底板、盖板、以及设置在底板和盖板之间的中间层；所述中间层上开设有微反应室，所述盖板上开设有油封腔；每个所述微反应室通过喉道与所述油封腔连通；所述喉道的口径小于微反应室的口径，同时喉道的口径小于油封腔的口径。本发明的芯片集核酸洗脱、洗脱液与PCRmix的混合、混合液分流入多个微反应室并彼此隔绝、然后进行核酸扩增反应于一体。

Description

一种PCR微反应室芯片及其进样方法

技术领域

本发明涉及一种PCR微流控芯片及其进样方法，属于微流控芯片技术领域。

背景技术

生物芯片技术在近20年得到了快速发展，尤其是微流控技术/新材料技术以及人工智能技术的快速发展，使得生物芯片技术逐渐走向产业化。

PCR反应大多在实验室以手工方式进行，需要专门的实验室，使用许多耗材和多个仪器，手工操作过程复杂繁琐，在手工操作过程中容易引入污染。

目前的PCR芯片大多体积较大，需要的机械动作复杂，一片芯片能同时进行的检测项目较少。比如赛沛公司的基因专家试剂盒（芯片），体积较大，一个试剂盒同时最多只能检测4到6个项目（如美国专利US9322052、专利US9669409）。

目前的PCR微反应室阵列芯片，多需要在检验过程中边抽真空边加混合液（如中国专利申请：CN102277294A），或者将微反应室附近材料设置为透气疏水性材料，在检验前抽真空，然后必须立即进行加液，依靠透气性材料的缓慢吸气能力将混合液吸入微反应室（如中国专利申请：CN103071548A、CN104894106A）。在实际应用场景中，需要额外配置真空泵，抽真空的过程增加了操作人员的工作量。

许多PCR微反应室阵列芯片需要一根或多根细流道联通到每个微反应室，因为流道对空间的占用，不利于微反应室阵列形成较高的密度（如中国专利申请：CN104894106A）。

市场上已有的FILMARRAY芯片，在加完混合液后，需要外部动力按压微反应室阵列上方的薄膜，使薄膜紧贴微反应室阵列上方，堵住每个微反应室的入口，从而对微反应室阵列彼此之间进行彼此隔绝，防止核酸扩增反应中的交叉污染（如专利申请：US20180320220A1、CN104507577A），这种方法需要额外的动力来维持长时间的按压动作，比如需要更多的电机。另一方面，该方案因为一面被某机构按压，该面不利于传热和对微反应室内的混合液进行快速温度控制。

FILMARRAY芯片的微反应室阵列由5层薄结构热压键合而成，键合工艺较多。FILMARRAY芯片的微反应室阵列的微反应室的入口由薄膜刺穿而成，厚度较浅，微反应室内的物质更容易溢出，从而造成微反应室之间的污染。大部分微阀与芯片本体通过键合形成一体，结构复杂，工艺较多，容易泄露，无法长久维持芯片内部的真空，且一旦开启，又难以关闭。

其他的PCR微反应室阵列芯片，多需要边抽真空边加混合液，这需要配置额外的真空泵，增加的操作人员的工作量。还有的PCR微反应室阵列芯片，需要某种特殊的透气性材料来制作，且需要临时抽真空，抽真空过程长达几十分钟到一个小时。这需要配置额外的真空泵，增加的操作人员的工作量和芯片制作的成本。

此外，大多数PCR芯片的微阀的制作过程需要多个模块的键合，微阀容易泄露，微阀难以长久保持真空（比如维持一年以上内部真空），且开启后又难以关闭。

发明内容

本发明旨在提供一种PCR微流控芯片及其进样方法，该微流控芯片可以集核酸洗脱、洗脱液与PCRmix的混合、混合液分流入多个微反应室并彼此隔绝、然后进行核酸扩增反应于一体。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种PCR微流控芯片，包括芯片本体，设置在芯片本体内的反应杯、混合腔、储油腔以及PCR微反应室阵列；所述PCR微反应室阵列包括底板、盖板、以及设置在底板和盖板之间的中间层；其结构特点是：

所述中间层上开设有多个用于容纳混合液的微反应室，所述盖板上开设有用于容纳密封油的油封腔；每个所述微反应室通过设置在中间层的喉道与所述油封腔连通；所述喉道的口径小于微反应室的口径，同时喉道的口径小于油封腔的口径；

所述混合腔一侧设有第一柱塞腔，该第一柱塞腔内装有第一柱塞，且所述第一柱塞腔通过进样流道与所述反应杯连通，所述储油腔内装有第二柱塞；

所述第一柱塞腔与混合腔通过进样微阀分隔形成A区域和B区域，所述混合腔与油封腔之间通过第一微阀隔开，所述储油腔与油封腔通过第二微阀分隔形成A’区域和B’区域；

所述第一柱塞和第二柱塞上均对应安装有一个针状进样装置；所述针状进样装置包括针，所述针上开有进口和出口，所述进口和出口通过开设在针侧壁上的槽或开设在针内的针内流道连通。

由此，本发明的芯片由反应杯、连接各腔室的流道和微阀、柱塞、针、混合腔、微反应室阵列、储油腔等结构组成，在芯片尺寸较小的前提下，在较小的空间内依靠简单的机械动作，实现了核酸的洗脱、洗脱液与PCRmix的混合、混合液的多微室加样、微室的彼此隔离和微室的温度循环。

喉道的深度实质上等同于微反应室与油封腔之间的距离。

PCR微反应室阵列能将混合液同时加入多个微小反应腔室，并彼此隔绝，然后进行核酸扩增反应。

本发明减小了芯片的体积，通过较简单的机械动作，使用较少的试剂，甚至可以实现在一块芯片上同时进行19个以上的检测项目。

根据本发明的实施例，还可以对本发明作进一步的优化，以下为优化后形成的技术方案：

为了方便实现微阀的开启和再关闭，所述针状进样装置具有三种状态：

i、相应的针状进样装置位于A或A’区域内，进样微阀或第二微阀保持常闭状态；

ii、针状进样装置穿过进样微阀或第二微阀，所述进口位于A或A’区域内，出口位于B或B’区域内，所述A区域和B区域之间或A’区域和B’区域之间通过所述槽125或所述针内流道122连通，进样微阀或第二微阀保持开启状态；

iii、针状进样装置穿过进样微阀或第二微阀，所述进口和出口均位于B或B’区域内，进样微阀或第二微阀保持常闭状态。

在需要开启微阀时，通过针刺破微阀，此时微阀通过所述槽或针内流道实现开启状态，需要再次关闭微阀时，只需要继续下压或上提针，保证进口和出口位于微阀的同一侧，此时针将微阀上的孔堵塞。

此外，本发明减少了键合复杂度，降低了微阀的制作成本，可以维持PCR微反应室阵列内部长久的真空（如一年以上），且通过简单的操作实现微阀的开启和再关闭。

优选地，所述喉道的尺寸使得微反应室内封装后的混合液不进入油封腔内，油封腔内的密封油不进入微反应室内，各微反应室的混合液通过油封腔内的密封油彼此隔绝；优选所述喉道直径不大于1.5mm，更优选所述喉道直径为0.1mm-1mm，最优选为0.5mm-1mm；优选所述喉道深度不小于0.1mm，更优选所述喉道深度为0.1mm-1mm，最优选为0.5mm-1mm。

为了更利于微反应室的温度循环控制，所述PCR微反应室阵列由底板、中间层和盖板键合形成三层结构，所述PCR微流控芯片在PCR微反应室阵列处向内凹进；优选PCR微反应室阵列的厚度为2mm-3mm。这种三层结构可以将PCR微反应室阵列做的更薄。

为了保证油封可靠，在垂直于盖板的方向看，所述油封腔的投影覆盖所述多个微反应室的投影。

所述油封腔分别与第一流道和第二流道连通，其中所述第一流道内设有第一微阀，所述第二流道内设有第二微阀；所述进样微阀、第一微阀和第二微阀常闭，且所述混合腔以及所述微反应室、喉道和油封腔形成真空腔；优选所述芯片本体上开设有与所述混合腔连通的抽真空孔，所述盖板上也开设有与所述油封腔连通的抽真空孔；所述抽真空孔均为贯通孔。由此保证了无外在动力的前提下，混合液能充满各微反应室和喉道，这样，需要封装混合液时，打开第一微阀，混合液在负压作用下被吸入并充满各微反应室和喉道。

为了方便制造和组装，所述微反应室包括开设在中间层朝向底板一侧的第一孔，所述中间层的第一孔与底板贴合形成所述微反应室；所述油封腔为开设在盖板朝向中间层一侧的第二孔，该第二孔为盲孔。这样微反应室和喉道一起贯通整个中间层，目标液体可以通过相应流道流入油封腔。

所述芯片本体和各微阀之间为一体注塑成型，和/或所述微反应室和喉道为一体注塑成型。由此，各微阀和芯片本体注塑在一起，微反应室和喉道注塑在一起，不存在键合。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种所述的PCR微流控芯片的进样方法，其包括如下步骤：

S1、提取的核酸和磁珠储存在反应杯中，通过针刺穿并打开进样微阀，反应杯内的洗脱液通过进样流道和所述槽或针内流道进入预装有PCRmix的混合腔内形成混合液；

S2、打开第一微阀，混合液进入并充满各微反应室和其上的喉道、油封腔；优选通过针刺穿并打开第一微阀，进样微阀关闭；

S3、通过针刺穿并打开第二微阀，将储油腔中的密封油压入油封腔内，形成对各微反应室的彼此隔绝，密封油无法进入各微反应室，混合液也无法进入油封腔；优选所述密封油为矿物油、石蜡油或氟化油；

优选地，S4、通过加热片夹紧所述微反应室阵列，开始温度循环，微反应室内开始核酸扩增反应。

为了减小加样难度，所述混合腔保持真空状态，进样微阀打开时洗脱液因负压被吸入混合腔内；各微反应室、喉道、油封腔保持真空状态，第一微阀打开时，混合液因负压被吸入各微反应室、喉道、油封腔内。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、在较小的空间里，实现了混合液的多微反应室加样和彼此隔离。

2、预先对芯片抽真空并封装维持其内真空度，使用时依靠真空将洗脱液吸入含PCRmix的混合腔，混合液不依靠外部动力源来充满每个微反应室。预先封装，长久保持真空，使用时减少配套设备和操作量。

3、微反应室依靠密封油实现彼此隔绝，无需其他运动部件或微阀来隔离微反应室。

4、PCR微反应室阵列由三层结构组成，每一层一毫米以内，结构较薄，利于快速控制微室的传热和温度循环。

5、微反应室阵列可通过注塑成型，中间层的微反应室和喉道注塑为一体，不需额外键合，微反应室阵列可通过注塑成型，将微反应室阵列的层数从4层以上减少到3层，减少了键合工艺，降低了制作的复杂度和制造成本，便于大规模生产。

6、使用时依靠真空吸入混合液，然后使用密封油排开油封腔中混合液，密封油充满油封腔，对各微反应室进行隔绝。此外，喉道高度可控，有效避免微反应室内容物的溢出和微反应室之间的污染。

7、本发明减少了生物芯片的体积，通过较简单的机械动作，使用较少的试剂，在一片芯片上同时进行19个以上的检测项目。

8、本发明减少了检测时的对配置的需求，减少操作人员的工作量，降低制作芯片对特殊材料的需求。

9、PCR微反应室阵列使用普通塑料制成，无需特殊透气材料，降低了制造成本。

10、相对于FILMARRAY芯片的微反应室阵列，本发明减少了微反应室阵列的键合复杂度，降低制造成本，便于大规模生产。

11、PCR微反应室阵列处可以单独做薄，传热迅速，能快速控制微室的温度循环。

12、依赖于针和微阀的特殊结构和位置关系，依靠简单的下压动作来实现微阀和流道的开启和再关闭。

13、芯片的微阀与主体注塑在一起、微反应室和喉道注塑在一起，无需额外的键合，增加了芯片的密封性，降低了芯片的制作复杂度，便于大规模生产。此外，多个部件直接注塑成型，减少键合工艺，降低制造成本，维持微阀的高度密封性。

13、芯片由普通塑料如PE、PP制作，无需采用PDMS等特殊透气性材料，采用PE或者PET等普通塑料即可生产芯片，降低了制造成本。

14、本发明集核酸洗脱、洗脱液与PCRmix的混合、混合液分流入多个微反应室并彼此隔绝、然后进行核酸扩增反应于一体。

附图说明

图1是本发明一个实施例的结构原理图；

图2是图1中微反应室阵列的结构示意图；

图3是图2的爆炸图；

图4是图2的纵切面立体示意图；

图5是本发明微反应室阵列通入混合液的状态图；

图6是本发明微反应室阵列进行混合液封装的状态图；

图7是图1中一种实施例的针状进样保持微阀常闭的状态示意图；

图8是图1中一种实施例的针状进样保持微阀开启的状态示意图；

图9是图1中一种实施例的针状进样保持微阀开启后再关闭的状态示意图；

图10是图1中另一种实施例的针状进样保持微阀常闭的状态示意图；

图11是图1中另一种实施例的针状进样保持微阀开启的状态示意图；

图12是图1中另一种实施例的针状进样保持微阀开启后再关闭的状态示意图。

具体实施方式

以下将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。为叙述方便，下文中如出现“上”、“下”、“左”、“右”字样，仅表示与附图本身的上、下、左、右方向一致，并不对结构起限定作用。

一种PCR微流控芯片，如图1所示，具有芯片本体100，芯片本体100内设有反应杯101、混合腔103、储油腔104以及PCR微反应室阵列200。混合腔103内预先固定有PCRmix的冻干粉末，储油腔104内预先储存有密封油，最好是矿物油，当然也可以是其他不与混合液相容的液体，如石蜡油或氟化油。

为了更好的说明，图1中额外展示了外部配套的零部件磁铁113和超声探头300。

芯片各部分包括处都可由普通塑料注塑制作，如PE、PET和PP，不需要采用特殊的透气疏水性材料，比如PDMS，这样成本更低，制造更方便，同时为后续某些腔体内抽真空提供了可能。

为了方便进样，所述混合腔103一侧设有第一柱塞腔，该第一柱塞腔内装有第一柱塞109，且所述第一柱塞腔通过进样流道111与所述洗脱液杯102连通，所述储油腔104内装有第二柱塞110。所述第一柱塞腔与混合腔103通过进样微阀106分隔形成A区域和B区域，所述混合腔103与油封腔35之间通过第一微阀31隔开，所述储油腔104与油封腔35通过第二微阀32分隔形成A’区域和B’区域。

如图1所示，反应杯101处设有磁铁113，用来吸住反应杯101内的磁珠，这样将PCR微流控芯片进行倾倒，使洗脱液流入反应杯101一侧的洗脱液杯102中，磁珠滞留在反应杯101内。反应杯101也可以做成截面为W形的杯，其中一边放置有磁珠，另一边用于盛装洗脱液。洗脱液杯102通过进样流道111和第一柱塞腔连通。为了便于无动力将洗脱液加入到混合腔103中，混合腔103内抽真空形成负压。

为了方便打开各微阀，所述第一柱塞109和第二柱塞110上均对应安装有一个针状进样装置。所述针状进样装置包括针105，所述针105上开有进口121和出口123，所述进口121和出口123通过开设在针105侧壁上的槽125或开设在针105内的针内流道122连通。

这样，下压第一柱塞109和针105，针105刺穿进样微阀106，进样微阀106打开，洗脱液杯102中的洗脱液因负压流经进样流道111和进样微阀106进入混合腔103内。

为了方便快速将混合腔103内的混合液混匀，超声探头300顶紧混合腔103，混匀并除去气泡，并使洗脱液和PCRmix充分混合，形成混合液。

如图2和图3所示，PCR微反应室阵列200主要由底板1、中间层2和盖板3三层组成，各层之间通过热密封或者胶水键合。如图4所示，中间层2包括微反应室21和喉道22，微反应室21和喉道22为一体注塑成型，中间不存在键合。微反应室21体积在1微升到20微升，在垂直于盖板3的方向看，所述油封腔35的投影覆盖所述多个微反应室21的投影，即油封腔35面积覆盖所有微反应室21。微反应室21内部预先放置有特异性引物。

本实施例中的中间层采用塑料制成，最好是采用热变形温度≥100℃的黑色塑料，如PP、PE、PC等。本实施例中的底板和盖板采用塑料制成，最好是热变形温度≥100℃的透明塑料，如PP、PET等。这样，两种塑料的热熔焊接匹配性好，焊接后牢固。而且塑料能做到核酸低吸附性，蛋白低吸附性。

为了方便制造，所述微反应室21包括开设在中间层2朝向底板1一侧的第一孔，所述中间层2的第一孔与底板1贴合形成所述微反应室21。所述油封腔35为开设在盖板3朝向中间层2一侧的第二孔，该第二孔为盲孔。

这样，当混合液混匀并且无气泡后，继续下压第一柱塞109和针105，针105刺穿第一微阀31，第一微阀31打开，混合液因负压被吸入微反应室阵列200内，混合液填充满所有微反应室21和其上的喉道22、油封腔35。

下压第二柱塞110和针105，针105刺穿第二微阀32，第二微阀32打开，并继续下压第二柱塞110，储油腔104中的油被压入油封腔35内，形成对微反应室阵列的彼此隔绝。因为喉道22处油水界面张力的存在，油无法进入各微反应室21，混合液也无法流出微反应室21。

如图2-5所示，所述PCR微反应室阵列200由底板1、中间层2和盖板3键合形成三层结构，所述PCR微流控芯片在PCR微反应室阵列200处向内凹进。一般而言，本发明的PCR微反应室阵列200的厚度可以控制在2mm-3mm。所述芯片本体100和各微阀之间为一体注塑成型。所述微反应室21和喉道22为一体注塑成型。

如图3所示，在垂直于盖板3的方向看，所述油封腔35的投影覆盖所述多个微反应室21的投影。

所述油封腔35分别与第一流道33和第二流道34连通，其中所述第一流道33内设有第一微阀31，所述第二流道34内设有第二微阀32。所述进样微阀106、第一微阀31和第二微阀32常闭，且所述混合腔103以及所述微反应室21、喉道22和油封腔35形成真空腔。在实际制造过程中，最好在混合腔103和PCR微反应室阵列200外侧均设有抽真空孔112。也就是说，所述芯片本体100上开设有与所述混合腔103连通的抽真空孔112，所述盖板3上也开设有与所述油封腔35连通的抽真空孔112。所述抽真空孔112均为贯通孔。

由此，将各层结构键合后，通过两个抽真空孔对混合腔103和微反应室阵列200抽真空，然后关闭两个抽真空孔112，由于微阀（进样微阀106、第一微阀31和第二微阀32）和抽真空孔112全部为不可活动，该PCR微反应室阵列200可以长久保存而不丧失真空（比如一年以上）。或者，在真空环境下将各层结构键合，然后封闭第一微阀31和第二微阀32，PCR微反应室阵列结构200内部保持真空。

这样在柱塞的作用下，如图7-12所示，以进样微阀106为例，针105与进样微阀106之间形成三种状态：

1、针105位于A区域内，进样微阀106保持常闭状态。

2、针105穿过进样微阀106，所述进口121位于A区域内，出口123位于B区域内，所述A区域和B区域之间通过所述槽125或所述针内流道122连通，进样微阀106保持开启状态。

3、针105穿过进样微阀106，所述进口121和出口123均位于B区域内，进样微阀106保持常闭状态。

以第二微阀32为例，针105与第二微阀32之间形成三种状态：

1、针105位于A或A’区域内，第二微阀32保持常闭状态。

2、针105穿过第二微阀32，所述进口121位于A’区域内，出口123位于B’区域内，所述A’区域和B’区域之间通过所述槽125或所述针内流道122连通，第二微阀32保持开启状态。

3、针105穿过第二微阀32，所述进口121和出口123均位于B’区域内，第二微阀32保持常闭状态。

第一微阀31的打开和关闭与进样微阀106、第二微阀32类似。为了保证进样效果，当第一微阀31打开时，进样微阀106最好处于关闭状态。

总之，本实施例的针105上下两个高度开有小孔（进口121和出口123），针内有针内流道122连通两个小孔，未下压时，针上两个小孔都在微阀上方，此时微阀关闭。针往下运动特定高度，针贯穿微阀，小孔分别在微阀上下，此时微阀打开，液体可以经由小孔和针内竖直管道流经微阀。针继续下压，针上两个小孔都在微阀下方，液体无法流经微阀，微阀被再关闭。

对于另一些实施例而言，如图10-12所示，针内流道122也可以用开设在针105侧壁上的键槽125代替，作用类似，工作原理类似，不再赘述。

利用所述的PCR微流控芯片的进样方法，其包括如下步骤：

S1、提取的核酸和磁珠储存在反应杯101中，反应后将洗脱液倾倒至洗脱液杯102中，通过第一柱塞109下压使针105刺穿进样微阀106，洗脱液依靠混合腔103内的真空被吸入混合腔103。反应杯101内的洗脱液通过进样流道111和所述槽125或针内流道122进入预装有PCRmix的混合腔103内形成混合液。然后使用超声探头300对混合腔103内的混合液进行除气泡和混匀。

S2、通过第一柱塞109下压使针105刺穿第一微阀31，第一微阀31打开，进样微阀106关闭，混合液进入并充满各微反应室21和其上的喉道22、油封腔35。由此，混合腔103内的混合液依靠微反应室阵列200内的真空被吸入微反应室阵列内。

S3、通过第二柱塞110下压使另一根针105刺穿第二微阀32，继续下压第二柱塞110，使储油腔104内的矿物油注入油封腔35内。所述喉道22的口径小于微反应室21的口径，同时喉道22的口径小于油封腔35的口径，使得密封油形成对各微反应室21的彼此隔绝，密封油无法进入各微反应室21，混合液也无法进入油封腔35。

如图6所示，本实施例的喉道22的尺寸使得微反应室21内封装后的混合液不进入油封腔35内，油封腔35内的密封油不进入微反应室21内，各微反应室21的混合液通过油封腔35内的密封油彼此隔绝。根据大量试验研究发现，所述喉道直径不大于1.5mm，更好的范围为0.1mm-1mm，最好为0.5mm-1mm。所述喉道深度不小于0.1mm，更好的范围为0.1mm-1mm，最好为0.5mm-1mm。

S4、通过加热片夹紧所述微反应室阵列200，开始温度循环，微反应室21内开始核酸扩增反应。由于微反应室阵列200处只有2-3mm厚，比较薄，两边被加热片夹住，加热片对微反应室阵列进行加热和温度循环，一侧加热片有跟微反应室数量相对应的镂空小孔，通过镂空小孔对微反应室进行实时监测。

本实施例的最好的方案是预先将混合腔103和微反应室21、喉道22、油封腔35抽真空，这样，所述混合腔103保持真空状态，进样微阀106打开时洗脱液因负压被吸入混合腔103内。各微反应室21、喉道22、油封腔35保持真空状态，第一微阀31打开时，混合液因负压被吸入各微反应室21、喉道22、油封腔35内。当然也可以通过常规方式将洗脱液注入混合腔103内，以及将混合液注入到微反应室21内，但比起本实施例抽真空的效果要差一些。

本实施例的微反应室21、喉道22和油封腔35的形状、体积和高度的变化。

本实施例的PCR微反应室阵列的规模，比如可以是4个微反应室21或者100个微反应室21。

微阀可单独制作，然后与芯片本体键合在一起。PCR微反应室阵列可以使用其他材料，如其他塑料、玻璃等。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (10)

1.一种PCR微流控芯片，包括芯片本体（100），设置在芯片本体（100）内的反应杯（101）、混合腔（103）、储油腔（104）以及PCR微反应室阵列（200）；其特征在于：

所述PCR微反应室阵列（200）包括底板（1）、盖板（3）、以及设置在底板（1）和盖板（3）之间的中间层（2）；所述中间层（2）上开设有多个用于容纳混合液的微反应室（21），所述盖板（3）上开设有用于容纳密封油的油封腔（35）；每个所述微反应室（21）通过设置在中间层（2）的喉道（22）与所述油封腔（35）连通；所述喉道（22）的口径小于微反应室（21）的口径，同时喉道（22）的口径小于油封腔（35）的口径；

所述混合腔（103）一侧设有第一柱塞腔，该第一柱塞腔内装有第一柱塞（109），且所述第一柱塞腔通过进样流道（111）与所述反应杯（101）连通，所述储油腔（104）内装有第二柱塞（110）；

所述第一柱塞腔与混合腔（103）通过进样微阀（106）分隔形成A区域和B区域，所述混合腔（103）与油封腔（35）之间通过第一微阀（31）隔开，所述储油腔（104）与油封腔（35）通过第二微阀（32）分隔形成A’区域和B’区域；

所述第一柱塞（109）和第二柱塞（110）上均对应安装有一个针状进样装置；所述针状进样装置包括针（105），所述针（105）上开有进口（121）和出口（123），所述进口（121）和出口（123）通过开设在针（105）侧壁上的槽（125）或开设在针（105）内的针内流道（122）连通。

2.根据权利要求1所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述针状进样装置具有三种状态：

i、相应的针状进样装置位于A或A’区域内，进样微阀（106）或第二微阀（32）保持常闭状态；

ii、针状进样装置穿过进样微阀（106）或第二微阀（32），所述进口（121）位于A或A’区域内，出口（123）位于B或B’区域内，所述A区域和B区域之间或A’区域和B’区域之间通过所述槽125或所述针内流道122连通，进样微阀（106）或第二微阀（32）保持开启状态；

iii、针状进样装置穿过进样微阀（106）或第二微阀（32），所述进口（121）和出口（123）均位于B或B’区域内，进样微阀（106）或第二微阀（32）保持常闭状态。

3.根据权利要求1所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述喉道（22）的尺寸使得微反应室（21）内封装后的混合液不进入油封腔（35）内，油封腔（35）内的密封油不进入微反应室（21）内，各微反应室（21）的混合液通过油封腔（35）内的密封油彼此隔绝；

优选所述喉道（22）直径不大于1.5mm，更优选所述喉道（22）直径为0.1mm-1mm，最优选为0.5mm-1mm；

优选所述喉道（22）深度不小于0.1mm，更优选所述喉道（22）深度为0.1mm-1mm，最优选为0.5mm-1mm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述PCR微反应室阵列（200）由底板（1）、中间层（2）和盖板（3）键合形成三层结构，所述PCR微流控芯片在PCR微反应室阵列（200）处向内凹进；优选PCR微反应室阵列（200）的厚度为2mm-3mm。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，在垂直于盖板（3）的方向看，所述油封腔（35）的投影覆盖所述多个微反应室（21）的投影。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述油封腔（35）分别与第一流道（33）和第二流道（34）连通，其中所述第一流道（33）内设有第一微阀（31），所述第二流道（34）内设有第二微阀（32）；

所述进样微阀（106）、第一微阀（31）和第二微阀（32）常闭，且所述混合腔（103）以及所述微反应室（21）、喉道（22）和油封腔（35）形成真空腔；

优选所述芯片本体（100）上开设有与所述混合腔（103）连通的抽真空孔（112），所述盖板（3）上也开设有与所述油封腔（35）连通的抽真空孔（112）；所述抽真空孔（112）均为贯通孔。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述微反应室（21）包括开设在中间层（2）朝向底板（1）一侧的第一孔，所述中间层（2）的第一孔与底板（1）贴合形成所述微反应室（21）；所述油封腔（35）为开设在盖板（3）朝向中间层（2）一侧的第二孔，该第二孔为盲孔。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的PCR微流控芯片，其特征在于，所述芯片本体（100）和各微阀之间为一体注塑成型，和/或所述微反应室（21）和喉道（22）为一体注塑成型。

9.一种如权利要求1-8中任一项所述的PCR微流控芯片的进样方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提取的核酸和磁珠储存在反应杯（101）中，通过针（105）刺穿并打开进样微阀（106），反应杯（101）内的洗脱液通过进样流道（111）和所述槽（125）或针内流道（122）进入预装有PCRmix的混合腔（103）内形成混合液；

S2、打开第一微阀（31），混合液进入并充满各微反应室（21）和其上的喉道（22）、油封腔（35）；优选通过针（105）刺穿并打开第一微阀（31），进样微阀（106）关闭；

S3、通过针（105）刺穿并打开第二微阀（32），将储油腔（104）中的密封油压入油封腔（35）内，形成对各微反应室（21）的彼此隔绝，密封油无法进入各微反应室（21），混合液也无法进入油封腔（35）；优选所述密封油为矿物油、石蜡油或氟化油；

优选地，S4、通过加热片夹紧所述微反应室阵列（200），开始温度循环，微反应室（21）内开始核酸扩增反应。

10.根据权利要求9所述的进样方法，其特征在于，所述混合腔（103）保持真空状态，进样微阀（106）打开时洗脱液因负压被吸入混合腔（103）内；

各微反应室（21）、喉道（22）、油封腔（35）保持真空状态，第一微阀（31）打开时，混合液因负压被吸入各微反应室（21）、喉道（22）、油封腔（35）内。

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