CN111973814B - 一种具有复合仿生界面的血管支架及其制备方法 - Google Patents
一种具有复合仿生界面的血管支架及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有复合仿生界面的血管支架及其制备方法，包括血管支架的金属基底、和在所述金属基底上的拓扑结构，在具有拓扑结构的金属基底上还有水凝胶涂层。该复合仿生界面的弹性模量极大地降低了弹性模量，使其力学性能与生理状态下的血管基底膜很大程度地接近，能够改善目前镍钛合金血管支架表面弹性模量过高的缺陷。当血管支架植入后，能够给血管内皮细胞提供更加接近生理状态的生长环境，有利于提高内皮细胞分泌前列环素PGI2，抑制内皮细胞分泌内皮素ET‑1，从而能够有效减少晚期血栓与再狭窄形成。本发明的复合仿生界面适用于所有金属血管支架，尤其适用于植入后再内皮化程度低，再狭窄发生率较高的镍钛合金血管支架。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，特别是涉及一种具有复合仿生界面的血管支架及其制备方法，该复合仿生界面能够促进血管支架内皮化并降低血栓发生率。
背景技术
心血管疾病是全球第一大致死原因，其中动脉粥样硬化是最常见的心血管病致病因素之一。血管支架植入术因具有创伤小、治疗效果显著的优势，被广泛运用在动脉粥样硬化的治疗中。血管支架经历了从裸金属支架到药物缓释支架再到可降解支架的发展，可有效改善短期再狭窄的情况，然而在血管支架植入后，对晚期血栓的形成以及再狭窄等并发症的发生仍然无法避免。由于支架植入过程中机械损伤导致血管内皮层被破坏，内皮细胞被破坏，支架植入后平滑肌细胞增殖速度远远超过内皮细胞，就会导致再狭窄发生(NewbyA C,Zaltsman A B.Molecular mechanisms in intimal hyperplasia[J].Journal ofPathology,2015,190(3):300-309.)。而内皮层的破坏也造成内皮细胞功能失衡，延缓支架植入后再内皮化进程，导致晚期血栓的发生。目前认为赋予支架表面快速再内皮化进程以及提高内皮细胞功能可能会有效减少晚期血栓与再狭窄的形成(Losordo DW,Isner JM，Diaz—Sandoval LJ.Endothelial recovery-The next target in restenosisprevention.Circulation 2003；107(21)：2635-2637.)。
血管支架植入后，在支架表面的内皮细胞、平滑肌细胞、血液以及支架表面会共同构成血管支架-血液界面。在血管支架-血液界面上，细胞与血管支架的基底材料会发生相互作用，基底材料的表面因素(如基底材料表面的拓扑结构、力学特性(刚度)、曲率与剪应力等)会影响细胞与血管支架之间发生的这种相互作用，这种相互作用又会影响细胞的如增殖能力、迁移能力等行为，还会影响细胞分泌与血管收缩、舒张相关的细胞因子的功能。
目前已经有研究表明，通过在血管支架的基底材料表面构建不同拓扑结构来模拟生理状态下的血管基底膜的拓扑结构能促进支架表面再内皮化进程，而力学特性等其他基底材料表面因素往往被忽略，导致内皮细胞在支架表面的生长环境与天然血管内皮细胞的生长环境有很大差异，影响内皮细胞正常的生长与功能。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种具有复合仿生界面的血管支架，该复合仿生界面能够促进血管支架再内皮化进程并降低血栓发生率。该血管支架，包括血管支架的金属基底、和在所述金属基底表面的拓扑结构，在具有拓扑结构的金属基底表面还有水凝胶涂层。
所述水凝胶涂层是将乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在光引发剂的作用下通过光聚合反应构建在具有拓扑结构的金属基底上；拓扑结构可为设于金属基底表面的多个平行沟槽，优选沟槽的形状模拟血管基底膜所具有的条纹。
所述水凝胶涂层的厚度为200nm-600nm；优选水凝胶涂层底面与所述沟槽相配合。
所述光引发剂为2,2-二乙氧基苯乙酮、安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯甲酮、α-羟烷基苯酮、α-胺烷基苯酮、二苯基乙酮、二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮等中的一种或几种。
水凝胶涂层的构建具体为：将乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺溶于水中，超声分散后，将具有拓扑结构的金属基底浸没于其中；然后加入光引发剂，紫外灯下照射发生光聚合反应，待溶液由透明变黄色后，取出金属基底，得到所述具有复合仿生界面的血管支架；优选的，乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在水中的质量百分含量分别为2-10％和0.002-0.01％。
所述血管支架表面的弹性模量为100-200MPa。
第二方面，本发明提供制备上述具有复合仿生界面的血管支架的方法，包括在具有拓扑结构的金属基底上构建水凝胶涂层。
在具有拓扑结构的金属基底上构建水凝胶涂层具体为：将乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺溶于水中，超声分散后，将具有拓扑结构的金属基底浸没于其中，乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺填充进拓扑结构的沟槽内；然后加入光引发剂，紫外灯下照射发生光聚合反应，待溶液由透明变黄色后，完成具有拓扑结构的金属基底上水凝胶涂层的构建，水凝胶涂层的底面与沟槽配合，取出金属基底，得到所述具有复合仿生界面的血管支架；优选的，乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在水中的质量百分含量分别为2-10％和0.002-0.01％。
所述光引发剂为2,2-二乙氧基苯乙酮、安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯甲酮、α-羟烷基苯酮、α-胺烷基苯酮、二苯基乙酮、二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮等中的一种或几种。
具有拓扑结构的金属基底的制作具体为：在光滑的金属基底上使用正性光刻胶进行匀胶，在金属基底上形成胶膜，匀胶厚度为2-2.5μm；将金属基底上的胶膜烘干后进行坚膜，即：将拓扑结构的图案曝光至金属基底上的胶膜上，在金属基底上滴加显影液进行显影，对金属基底上显影出的图案进行刻蚀，得到具有拓扑结构的金属基底。
本发明提供了一种具有复合仿生界面的血管支架，该复合仿生界面的弹性模量约为100-200MPa，与仅有拓扑结构的金属血管支架相比，其弹性模量降低至MPa数量级，而仅有拓扑结构的金属血管支架的弹性模量为20GPa左右，极大地降低了血管支架表面的弹性模量，使其力学性能与生理状态下的血管基底膜很大程度地接近，能够改善目前镍钛合金等金属血管支架表面弹性模量过高的缺陷。当本发明血管支架植入后，能够给血管内皮细胞提供更加接近生理状态的生长环境，有利于提高内皮细胞分泌前列环素PGI2，抑制内皮细胞分泌内皮素ET-1的功能，从而能够有效减少晚期血栓与再狭窄的形成。本发明的复合仿生界面适用于所有金属血管支架，尤其适用于植入后再内皮化程度低，再狭窄发生率较高的镍钛合金血管支架。
附图说明
图1所示为本发明大鼠动脉血管基底膜原子力显微镜图；
图2所示为本发明具有复合仿生界面的血管支架表面扫描电镜图；
图3所示为本发明血管支架对内皮细胞增殖效果的柱状图；
图4所示为本发明血管支架对平滑肌细胞增殖效果的柱状图；
图5所示为本发明血管支架对内皮细胞PGI2分泌效果的柱状图；
图6所示为本发明血管支架对内皮细胞ET-1分泌效果的柱状图；
图7所示为本发明血管支架对表面血小板黏附效果的柱状图；
图8所示为本发明血管支架对表面血小板激活效果的柱状图；
图9所示为本发明血管支架对溶血率影响的柱状图；
图10所示为本发明血管支架弹性模量的柱状图；
图11所示为本发明血管支架的剖面结构示意图。
具体实施方式
正常生理状态下，血管由三层组成，靠近血流的内皮层，中层基底膜和外层血管壁，内皮层是由附着在中层基底膜上的内皮细胞组成。目前植入的血管支架的表面只是金属，硬度太高，刚度太大。已经有研究表明，血管支架表面在接近生理状态基底膜的刚度(约30kPa)时，能够给内皮细胞提供更好的生长环境，促进内皮细胞正常发挥分泌NO、PGI2和ET-1等物质的功能。
目前，金属血管支架(如镍钛合金、钴铬合金、316L不锈钢等金属血管支架)的弹性模量远远超过生理状态基底膜的刚度，发明人大胆设想：若改善金属血管支架表面的弹性模量，或许能够有利于血管内皮细胞在支架表面的生长以及细胞功能的发挥。因此发明人试图在血管支架表面构建水凝胶涂层，利用构建的水凝胶涂层仿生天然血管基底膜的刚度，用以仿生天然血管基底膜。
在生理环境中，血管内皮细胞附着的血管基底膜具有微米级沟槽拓扑结构,如图1所示，大鼠动脉血管基底膜具有条纹状拓扑结构。本发明在综合考虑拓扑结构与力学特性这两个重要的基底材料表面因素后，对血管支架表面进行改性：在支架表面仿生构建血管基底膜微米沟槽拓扑结构，即仿生血管基底膜条纹趋向的拓扑结构；再通过光聚合技术在沟槽表面构建水凝胶涂层，仿生血管基底膜的力学特性。虽然目前也有在血管支架上构建水凝胶涂层的，但其目的是药物缓释，而不是仿生力学特性；且构建方法用的是匀胶仪涂布，而不是光聚合技术。
镍钛合金是目前临床上广泛运用的血管支架材料，具有良好的形状记忆效应和超弹性，但其表面光滑没有拓扑结构，且其弹性模量约为20GPa，远远超过基底膜生理刚度；没有拓扑结构，不能模拟天然血管基底膜结构，弹性模量过大与天然内皮细胞生长附着的基底膜刚度不匹配，影响内皮细胞的生长和功能，使其应用受到极大的限制。本发明以医用镍钛合金为例，将其作为血管支架表面改性的基底材料，利用光刻与离子束刻蚀实现镍钛合金表面微米沟槽拓扑结构的构建。聚乙烯膦酸是优异的亲水聚合物材料的代表，本发明通过在镍钛合金沟槽拓扑结构表面光聚合聚乙烯膦酸-N,N′-亚甲基双丙烯酰胺水凝胶[P(VPA-co-MBAA)]实现复合仿生界面的构建。
本发明提供的具有复合仿生界面的血管支架，其剖面结构图见图11，包括金属基底1，金属基底表面设有拓扑结构2，在具有拓扑结构的金属基底表面设有水凝胶涂层3。
拓扑结构2由多个平行的微米级的沟槽4构成，沟槽4的形状模拟血管基底膜所具有的条纹状，沟槽4的深度h为800-1000nm，宽度w为3-5μm。
水凝胶涂层3的厚度为200-600nm，表面随着拓扑结构2对应的沟槽4形状呈起伏状态，具有与沟槽4相配合的多个平行的凹槽。底面填充于沟槽4中，即水凝胶涂层3的底面与沟槽4相配合。
金属基底1上设置的拓扑结构2仿生血管基底膜条纹趋向的拓扑结构。具有拓扑结构2的金属基底表面设有的水凝胶涂层3能够大大降低血管支架表面的弹性模量，从而仿生血管基底膜的力学特性。
本发明还提供制备具有复合仿生界面的血管支架的方法，其具体包括如下步骤：
(1)、镍钛合金沟槽拓扑结构的构建
采用正性光刻胶，在光滑镍钛合金(命名为CK)基底上使用正性光刻胶进行匀胶，转速为4500转/分钟，匀胶厚度为2-2.5μm，在金属基底上形成胶膜。在烘胶台上，将金属基底上匀的胶膜烘干，烘干温度100-110℃，烘干时间5-8分钟。烘干后进行坚膜，即：利用曝光机，将掩膜版的图案(即拓扑结构的图案)转移到镍钛合金基底的胶膜上，曝光时间设定为5s。利用光刻胶专用显影液，对曝光后的图案进行显影，显影液的温度控制在20-25℃，显影时间30s。在等离子刻蚀机上，对镍钛合金基底刻蚀显影出的拓扑结构的图案，刻蚀能量450eV，刻蚀时间50min。刻蚀结束后用无水乙醇超声清洗20min，再用去离子水冲洗数遍晾干，裁剪为1cm×1cm待用，得到具有拓扑结构的金属基底，刻蚀后的具有沟槽拓扑结构的镍钛合金命名为RG。
(2)、水凝胶涂层的构建
量取50g水倒入烧杯，加入乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，乙烯基膦酸：N,N′-亚甲基双丙烯酰胺的质量比不小于1000:1，优选(100-1000)：1，乙烯基膦酸在水中的质量百分含量为2-10％，超声分散混匀后，倒入培养皿，分别将光滑镍钛合金(CK)与步骤(1)得到的镍钛合金片(RG)放入该培养皿中并浸没30min，以沉积乙烯基膦酸单体分子。加入光引发剂，光引发剂可以为2,2-二乙氧基苯乙酮、安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯甲酮、α-羟烷基苯酮、α-胺烷基苯酮、二苯基乙酮、二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮等中的一种或几种；紫外灯(波长365nm)照射发生光聚合反应，溶液由透明变黄色后(大约2h)，取出用去离子水冲洗数遍，紫外灯照射30min灭菌，于去离子水中保存，分别得到光滑镍钛合金上构建有水凝胶涂层的血管支架，命名CKg，以及本发明具有复合仿生界面的血管支架，命名RGg。
以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。
实验一：具有复合仿生界面的血管支架的细胞相容性评价
实验例1-1：内皮细胞与平滑肌细胞增殖检测
用CCK-8试剂盒(购自DOJINDO东仁化学科技(上海)有限公司)测定不同血管支架表面上内皮细胞和平滑肌细胞的增殖能力：
(1)将不同血管支架材料1cm×1cm(厚度无要求)置于24孔板中，血管支架材料分别为：没有拓扑结构的表面光滑的镍钛合金片(CK)、按本发明方法步骤(2)中在没有拓扑结构的表面光滑的镍钛合金片表面构建有水凝胶涂层的镍钛合金片(CKg)、按本发明方法步骤(1)构建了沟槽拓扑结构的镍钛合金片(RG)、以及本发明的先构建了沟槽拓扑结构再构建水凝胶涂层的镍钛合金片(RGg)(以下分别简称为CK组、CKg组、RG组、RGg组)，紫外灭菌30min，做好标记；
(2)复苏培养(培养基购买细胞时附带)人冠状动脉内皮细胞(HCAEC细胞，购自Sciencell)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC细胞，购自Sciencell)，分别接种HCAEC细胞和HUASMC细胞到步骤(1)得到的各组孔中，每个组设3个复孔，每个孔接种等密度等体积的细胞悬液，使得每孔接种的细胞量相同，放置于5％ CO2培养箱内培养；
(3)隔天换新鲜培养基，细胞培养3天后吸出培养基，每孔用PBS液清洗两次。随后每个孔中加入300μL含有10％(v/v)CCK-8试剂的培养基，于37℃、5％ CO2条件下孵育2小时。孵育结束后，毎孔吸取200μL反应液到96孔板，置于酶标仪中，检测溶液在450nm处的吸光度值，HCAEC细胞和HUASMC细胞的结果分别见图3和图4。
通过在不同血管支架的表面培养人冠状动脉内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞，3天后利用CCK-8法检测细胞增殖情况，图3为内皮细胞的结果，图4为平滑肌细胞的结果。
由图3可见，在450nm波长，CK组的表面光滑镍钛合金片培养的内皮细胞吸光值为0.57±0.03，CKg组培养的内皮细胞吸光值为0.54±0.05，RG组培养的内皮细胞吸光值为0.54±0.02，而本发明的具有复合仿生界面的镍钛合金片(RKg组)培养的内皮细胞吸光值为0.52±0.05。RGg组与CK、CKg、RG组相比较，吸光值均没有显著改变，结果说明本发明复合仿生界面中的沟槽拓扑结构与水凝胶涂层对内皮细胞增殖能力都没有影响。
由图4可见，光滑镍钛合金CK组培养平滑肌细胞吸光值为1.03±0.05，CKg组培养平滑肌细胞吸光值为0.98±0.03，RG组培养平滑肌细胞吸光值为0.86±0.04，本发明RGg组培养平滑肌细胞吸光值0.83±0.08。与光滑镍钛合金CK组相比，有拓扑结构的RG组和RGg组中平滑肌细胞增殖能力显著降低(p＜0.05)，而CKg组相比CK组平滑肌细胞增殖能力没有显著改变，此结果说明本发明复合仿生界面中沟槽拓扑结构能够抑制平滑肌细胞增殖。
综上，本发明具有复合仿生界面的血管支架相比光滑镍钛合金CK不影响内皮细胞的正常增殖能力，同时能够有效抑制平滑肌细胞增殖，结果表明本发明具有复合仿生界面的血管支架能够防止支架植入后由于平滑肌细胞增殖速度过快引起的再狭窄，同时维持内皮细胞的正常生长。
实验例1-2：内皮细胞前列环素(PGI2)分泌水平测定
用PGI2 ELISA试剂盒(购自Abnova)检测不同材料培养内皮细胞PGI2分泌水平，具体步骤包括：
(1)同实验例1-1的步骤(1)；
(2)将HCAECs细胞悬液(用培养基悬浮HCAECs得到，培养基和HCAECs均购自于Sciencell)分别等量接种在步骤(1)得到的CK组、CKg组、RG组、RGg组中的镍钛合金片上，培养8小时后给细胞换新鲜内皮细胞培养基(购自于Sciencell)，在新培养基中继续培养细胞48小时，收集上清培养基，作为样品。
(3)将试剂盒中所有试剂置于室温下平衡30min。取出30个试剂盒自带的包被好的96孔板，其余室温平衡的所有试剂放置于4℃保存。
(4)制备标准品：取出5个离心管，做好标记1-5#。吸取1mL试剂盒自带的稀释液到1#管，2-5#管均加入750μL稀释液。移除1#管中20μL稀释液，加入20μL100000pg/mL的标准品。彻底混匀后，取250μL到2#管中，混匀后依次转移250μL到3#管中，依次梯度稀释一直到5#管。此时，1-5#标准品浓度分别为2000、500、125、31.25、7.81pg/mL。步骤(2)的四组样品和标准品重复3个平行孔。
(5)按试剂盒中说明书提供的步骤，吸取100μL稀释液到NSB孔和B0孔(两种对照孔)；分别吸取100μL 1-5#标准品和100μL步骤(2)的四组样品到样品孔中；吸取50μL稀释液到NSB孔；吸取50μL试剂盒自带的结合液到除了空白孔的所有孔中；吸取50μL试剂盒自带的抗体液到除了空白孔和NSB孔的所有孔中。
(6)在微量振荡器上室温孵育2h后，甩干孔中液体，每孔加入300μL试剂盒自带的洗涤液震荡清洗1min，重复3次，彻底甩干；每孔加入200μL p-Npp底物，室温孵育45min；然后每孔加入50μL试剂盒自带的终止液，在405nm波长下读取吸光值，结果见图5。
本实验例在不同血管支架的表面培养内皮细胞，48h后检测内皮细胞PGI2分泌水平。由图5可见，光滑镍钛合金CK组PGI2浓度为2426.79±137.90pg/mL，CKg组PGI2浓度为2730.82±98.42pg/mL，RG组PGI2浓度为2379.59±99.96pg/mL，具有复合仿生界面的RGg组PGI2浓度2737.62±27.98pg/mL，与光滑对照组CK组相比，具有水凝胶涂层的CKg组和RGg组PGI2浓度显著升高，RG组PGI2浓度没有显著变化，结果表明复合仿生界面中的水凝胶涂层能够促进内皮细胞分泌PGI2(p＜0.05)。
实验例1-3：内皮细胞内皮素-1(ET-1)分泌水平测定
用ET-1ELISA试剂盒(购自Abcam)检测不同材料培养内皮细胞ET-1分泌水平，具体步骤包括：
(1)同实验例1-1的步骤(1)；
(2)将HCAECs细胞悬液(用培养基悬浮HCAECs得到，培养基和HCAECs均购自于Sciencell)分别等量接种在步骤(1)得到的CK组、CKg组、RG组、RGg组中的镍钛合金片上，培养8小时后给细胞换新鲜内皮细胞培养基(购自于Sciencell)，在新培养基中继续培养细胞48小时，收集上清培养基后再进行离心3000rpm离心5min，作为样品；所有样品和标准品重复2个平行孔。
(3)-(5)同实验例1-2的步骤(4)；
(6)将孔板密封后在室温下孵育1h；清空孔板中液体，每孔加入试剂盒自带的洗涤液300μL，洗涤5次，每次45s；每孔加入100μL试剂盒自带的内皮素ET-1抗体，封闭孔板后，室温下孵育30min；清空孔板中液体，每孔加入洗涤液300μL，洗涤5次，每次45s；每孔加入100μL试剂盒自带的3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB底物，封闭孔板后，室温下孵育30min；每孔加入100μL试剂盒自带的终止液，在450nm波长下读取吸光值，按照试剂盒说明书计算ET-1浓度，结果见图6。
由于在高血压以及心血管疾病的病理过程中，过量释放的ET-1会引起内皮细胞功能失衡，因此，一定程度上降低内皮细胞的ET-1释放会缓解由ET-1引起的内皮细胞功能失衡，促进血管内皮重建过程。本实验例在不同血管支架表面培养内皮细胞，48h后检测内皮细胞ET-1分泌水平，由图6可见，光滑镍钛合金CK组ET-1浓度为157.16±2.03pg/mL，CKg组ET-1浓度为143.86±2.85pg/mL，RG组ET-1浓度为157.84±2.49pg/mL，复合仿生界面RGg组ET-1浓度140.90±5.32pg/mL，与光滑对照CK组相比，具有水凝胶涂层的CKg与RGg组ET-1浓度显著降低，而RG组ET-1浓度没有显著变化，结果说明复合仿生界面中的水凝胶涂层能够降低内皮细胞分泌ET-1(p＜0.001)。
实验二：复合仿生界面血液相容性评价
实验例2-1：血小板黏附评价
采用平行板流动小室模拟血流剪切力作用，通过不同血管支架表面黏附血小板荧光强度计算评价血小板黏附情况，平均灰度值与荧光强度呈正比，因此可用平均灰度值评价血小板黏附情况，具体步骤包括：
(1)从中国人民解放军307医院取新鲜人源富血小板血浆5mL，用购自Solarbio的改良台式液稀释至45mL，得到稀释血小板，检测其中血小板浓度为1×1011/L；安装调节好注射器与微量输液泵，设置流速为1mL/min(剪切率为1000s-1)；称取1.93mg ADP溶解至800μL改良台式液中，得到ADP溶液，向每10mL稀释血小板中加入200μL ADP溶液，配制得到含0.01mM ADP的血小板血浆。
(2)用改良台式液冲洗购自GlycoTech的平行板流动小室10min，分别将实验例1-1中CK组、CKg组、RG组、RGg组的镍钛合金片放入流动小室垫片槽内，用注射器吸取10mL步骤(1)得到的含0.01mM ADP的血小板血浆，并在1mL/min的流速下流动10min，流动方向平行于沟槽条纹方向(没有拓扑结构的镍钛合金片方向任意)。
(3)用改良台式液轻轻冲洗掉未黏附在四组镍钛合金片上的血小板，用2.5wt％戊二醛分别浸泡四组镍钛合金片过夜，以进行固定。
(4)用改良台式液漂洗3次，每次5min；采用FITC AnnexinV免疫荧光染色：将20μLFITC AnnexinV(购自BD Biosciences)用改良台式液稀释至400μL，震荡混匀，作为荧光染料；每个镍钛合金片的表面滴加100μL荧光染料，避光孵育15min后，用改良台式液漂洗3次，去除未结合的荧光染料，干燥后在激光共聚焦显微镜下观察血小板的黏附情况。每组随机拍摄5张照片，采用ImageJ软件计算平均灰度值，结果见图7。
由图7可见，光滑镍钛合金CK组黏附血小板平均灰度值为82500±7944，CKg组黏附血小板平均灰度值为21943±15814，RG组黏附血小板平均灰度值为31313±8508，本发明具有复合仿生界面的镍钛合金片RGg组表面黏附的血小板平均灰度值为7864±2045，与光滑对照CK组相比，CKg组、RG组、以及RGg组黏附的血小板平均灰度值均显著降低，其中RGg组黏附的血小板平均灰度值最低，结果说明水凝胶涂层和沟槽拓扑结构均能显著降低激活的血小板黏附，本发明具有复合仿生界面的镍钛合金片能够综合水凝胶涂层和沟槽拓扑结构的优势发挥抗激活的血小板黏附功能(p＜0.001)。
实验例2-2：血小板激活评价
采用平行板流动小室模拟血流剪切力作用，通过ELISA方法检测不同材料表面血小板激活情况，具体步骤包括：
(1)从中国人民解放军307医院取新鲜人源富血小板血浆15mL，用购买自Solarbio的改良台式液稀释至45mL，得到稀释血小板；安装调节好注射器与微量输液泵，设置流速为1mL/min(剪切率为1000s-1)。
(2)用改良台式液冲洗购自GlycoTech的平行板流动小室5min，分别将实验例1-1中CK组、CKg组、RG组、RGg组的镍钛合金片放入流动小室垫片槽内，用注射器吸取5mL稀释血小板，并在1mL/min的流速下流动5min，流动方向平行于沟槽条纹方向(没有拓扑结构的镍钛合金片方向任意)。
(3)用改良台式液轻轻冲洗掉未黏附在四组镍钛合金片上的血小板，每组加入60μL一抗(由购自BIORAD的鼠抗人CD62P抗体：PBS为1:100混合得到)，37℃孵育1h；用PBS液漂洗未结合的一抗，漂洗3次，每次3min；每组加入60μL二抗(由购自Jacksonimmuno的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体：PBS为1:100混合得到)，37℃孵育1h；PBS液漂洗未结合的二抗，漂洗3次，每次3min；每组加入400μL TMB显色液(购自BioLegend)，3min后用200μL 1M硫酸终止反应；每组取200μL在450nm波长测定吸光值，结果见图8，以加入一抗、二抗以及底物显色液和终止液的为空白孔，定义空白孔为100％激活，计算各组流动状态下的血小板激活率。
由图8可见，光滑镍钛合金CK组血小板激活率为63.80％，CKg组血小板激活率为56.40％，RG组血小板激活率为62.49％，本发明具有复合仿生界面的镍钛合金片RGg组表面的血小板激活率为54.39％，与光滑对照CK组相比，具有水凝胶涂层的CKg与RGg组表面的血小板激活率显著降低，而RG组表面的血小板激活率没有显著改变，结果说明复合仿生界面中的水凝胶涂层能够抑制血小板激活(p＜0.001)，降低血栓的发生，再狭窄发生的概率进一步降低。
实验例2-3：溶血率测定
在540nm波长下用酶标仪检测四组不同血管支架与血细胞接触后血细胞破裂释放的血红蛋白量。释放的游离血红蛋白越多，说明血管支架的溶血率越高，具体步骤包括：
(1)从中国人民解放军307医院取新鲜健康献血者2mL全血加入2.5mL生理盐水进行稀释，得到稀释全血；将CK组、CKg组，RG组、RGg组的镍钛合金片分别浸泡于37℃的9.8mL生理盐水中，作为实验组；以9.8mL生理盐水作为阴性对照组，9.8mL无菌水作为阳性对照组，37℃孵育30min；
(2)向所有组(实验组、阴性对照组和阳性对照组)中加入0.2mL步骤(1)得到的稀释全血，轻轻混匀后于37℃孵育1h；然后3000rpm离心5min；取上清液200μL于96孔板中，在540nm波长下用酶标仪检测血细胞破裂释放的血红蛋白；计算溶血率HR＝(A-OD阴)/(OD阳-OD阴)×100％，A为OD镍钛合金片，结果见图9。
由图9可见，光滑镍钛合金CK组溶血率为0.04％±0.03，CKg组溶血率为0.46％±0.09，RG组溶血率为0.10％±0.08，本发明具有复合仿生界面的镍钛合金片RGg组的溶血率为0.51％±0.11，与光滑对照CK组相比，只有水凝胶涂层的CKg组与RGg组溶血率有升高。虽然复合仿生界面的水凝胶涂层会引起微弱的溶血作用(p＜0.01)，但是各组样品的溶血率均远远小于国际标准规定的5％，符合国际标准要求。
实验例3：弹性模量的测定
将实验例1-1中CK组、CKg组、RG组、RGg组中的样品分别放入Oxford-asylumreaserch afm cypherS型原子力显微镜载物台上，在常温常压条件下，采用接触模式随机选取样品表面不同位置检测样品的弹性模量，结果见图10。
由图10可见，光滑镍钛合金CK组弹性模量为20.08±1.85GPa，CKg组弹性模量为175.45±31.82MPa，RG组弹性模量为18.63±1.27GPa，RGg组弹性模量为132.08±10.60MPa。结果说明没有水凝胶涂层的镍钛合金弹性模量数量级能够达到GPa，而构建水凝胶涂层的CKg组与具有复合仿生界面的RGg组弹性模量均为MPa数量级，复合仿生界面相比光滑镍钛合金的弹性模量显著降低，更加接近生理基底膜刚度。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。
Claims (9)
1.具有复合仿生界面的血管支架的制备方法，其特征在于，所述血管支架包括血管支架的金属基底、和在所述金属基底表面的拓扑结构，在具有拓扑结构的金属基底表面还有水凝胶涂层；所述水凝胶涂层的厚度为200nm-600nm，所述血管支架表面的弹性模量为100-200MPa；
所述制备方法包括在具有拓扑结构的金属基底上构建水凝胶涂层，所述水凝胶涂层是将乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在光引发剂的作用下通过光聚合反应构建在具有拓扑结构的金属基底上；
所述光引发剂为2,2-二乙氧基苯乙酮、安息香、安息香双甲醚、安息香乙醚、安息香异丙醚、安息香丁醚、二苯甲酮、α-羟烷基苯酮、α-胺烷基苯酮、二苯基乙酮、二苯甲酮、2,4-二羟基二苯甲酮、米蚩酮中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述拓扑结构为设于金属基底表面的多个平行沟槽。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述沟槽的形状模拟血管基底膜所具有的条纹。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述水凝胶涂层底面与所述沟槽相配合。
5.根据权利要求1-4任一所述制备方法，其特征在于，在具有拓扑结构的金属基底上构建水凝胶涂层具体为：将乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺溶于水中，超声分散后，将具有拓扑结构的金属基底浸没于其中，乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺填充进拓扑结构的沟槽内；然后加入光引发剂，紫外灯下照射发生光聚合反应，待溶液由透明变黄色后，完成具有拓扑结构的金属基底上水凝胶涂层的构建，水凝胶涂层的底面与沟槽配合，取出金属基底，得到所述具有复合仿生界面的血管支架。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，乙烯基膦酸和N,N′-亚甲基双丙烯酰胺在水中的质量百分含量分别为2-10％和0.002-0.01％。
7.根据权利要求1-4任一所述制备方法，其特征在于，具有拓扑结构的金属基底的制作具体为：在光滑的金属基底上使用正性光刻胶进行匀胶，在金属基底上形成胶膜，匀胶厚度为2-2.5μm；将金属基底上的胶膜烘干后进行坚膜，即：将拓扑结构的图案曝光至金属基底上的胶膜上，在金属基底上滴加显影液进行显影，对金属基底上显影出的图案进行刻蚀，得到具有拓扑结构的金属基底。
8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，具有拓扑结构的金属基底的制作具体为：在光滑的金属基底上使用正性光刻胶进行匀胶，在金属基底上形成胶膜，匀胶厚度为2-2.5μm；将金属基底上的胶膜烘干后进行坚膜，即：将拓扑结构的图案曝光至金属基底上的胶膜上，在金属基底上滴加显影液进行显影，对金属基底上显影出的图案进行刻蚀，得到具有拓扑结构的金属基底。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，具有拓扑结构的金属基底的制作具体为：在光滑的金属基底上使用正性光刻胶进行匀胶，在金属基底上形成胶膜，匀胶厚度为2-2.5μm；将金属基底上的胶膜烘干后进行坚膜，即：将拓扑结构的图案曝光至金属基底上的胶膜上，在金属基底上滴加显影液进行显影，对金属基底上显影出的图案进行刻蚀，得到具有拓扑结构的金属基底。
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