CN111939144A - 三氯生的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供三氯生的新应用。具体是，将三氯生用于治疗脓肿分枝杆菌感染灶。所述三氯生可制成外用药和口服制剂。针对皮肤脓肿破溃处采用外用药涂抹治疗，针对肺脏、骨、胰腺、肝脏、大脑等深部多发脓肿采用口服制剂治疗。本发明药物治疗效果敏感，十天外涂加口服可治愈，无副作用，短程、廉价、效果好、口感好。

Description

三氯生的新应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体为三氯生药物在治疗脓肿分枝杆菌感染灶的新应用。

背景技术

脓肿分枝杆菌是一种快速生长的非结核分枝杆菌，在人体主要引起肺部及皮肤软组织的感染。常规消毒方法难以消除，脓肿分枝杆菌病为机会条件性致病菌，南方炎热地区发病率为10-20％，也会引起暴发流行。脓肿分枝杆菌患者占所有分枝杆菌感染患者的11.1-22.9％。免疫功能低下者可引起全身扩散，常规联合化疗易耐药，敏感性有限。

脓肿分枝杆菌对临床常用抗结核药物具有天然耐药性，耐药率均＞95％，根据《非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家公识》(2012年版)，推荐的治疗方案包含一种大环内酯类联合一种或多种静脉用药物，如克拉霉素、阿米卡新、利奈唑胺等联合治疗至少6个月；美国AST/IDSA同类文件推荐头孢西丁或者亚胺培南联合阿米卡星治疗2-4个月。2017年英国胸科协会指南《英国胸科协会治疗非结核分支杆菌肺病(NTM-PD)》推荐4周的初期用药(亚胺培南、替加环素、阿米卡星)和持续阶段(阿奇霉素、克拉霉素、阿米卡星等)至痰转阴后至少12个月。上述治疗方法为传统常规疗法，都是三联或者四联药物联合治疗至少2-6个月,疗程长、易耐药，且毒性大，需监测肝肾毒性，治疗费用也较昂贵，进口利奈唑胺一个疗程至少几万元人民币，而且也易复发，较难根治，导致患者病亡率较高。

分枝杆菌本身的化学特性含有通透性极低的细胞壁使其对许多抗生素固有耐药，非典型分枝杆菌引起的感染更加难以治愈，其对常规抗结核药物耐药。

三氯生是高效广谱抗菌剂为脂溶性有机化合物，化学名称为2,4,4′-三氯-2′-羟基-二苯醚，分子式为C12H7Cl3O2，外观为白或灰白色晶状粉末，熔点为55-57℃，沸点为120℃，微溶于水，极易溶于脂肪、乙醇、乙醚等有机溶剂。三氯生化学性质相对稳定，200℃下可稳定存在2h。容易穿透皮肤和细胞膜对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、酵母菌、病毒、分枝杆菌等都具有高效抑制杀灭作用。

在小鼠、大鼠和仓鼠试验中，三氯生水溶性和分配系数(log Kow＝4.8)较低，因此经皮吸收较慢且较少(<10％)；约70-80％的三氯生可经口被吸收。经胃肠道给药的三氯生，4-8小时后在血浆中达到最高水平。吸收后主要分布在肝脏、肺脏、肾脏、胃肠道和胆囊。三氯生经口或经皮吸收后，主要与葡萄糖醛酸或硫酸结合，分别经尿和粪便排泄，仓鼠、兔、猴和人类主要经尿排泄。

三氯生的毒理学安全评价显示急性毒性和刺激毒性都在安全范围内。慢毒和内分泌干扰作用仅见长期慢性接触(60d)。各国法规仅仅对慢性长期接触产品和限量值有要求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供三氯生在治疗脓肿分枝杆菌感染灶的应用，其治疗效果敏感、无副作用、短程、廉价、效果好。

由此，本发明的目的在于提供三氯生的新应用。具体是，将三氯生用于治疗脓肿分枝杆菌感染灶。

所述三氯生可制成外用乳膏和口服制剂。

针对脓肿分枝杆菌引起的皮肤脓肿破溃处采用外用乳膏涂抹治疗，针对脓肿分枝杆菌引起的骨、胰腺、肝脏、大脑等深部多发脓肿感染灶采用口服制剂治疗；

所述三氯生口服制剂由三氯生和蜂蜜混合制备而成，其制备方法为：

取三氯生50g，加蜂蜜60ml，混匀后装瓶密封保存即可。

所述三氯生口服制剂的用法与用量：3ml/次，一日2次，轻症3-5日，重症连服7-10日。

所述三氯生外用药由酒精凝胶和三氯生混合制备而成，其制备方法为：

取三氯生0.3g加酒精凝胶100ml混合，混匀后装瓶密封保存即可。

所述三氯生外用药的用法与用量：3-10ml/次，一日2次，轻症3-5日，重症连用7-10日。一般不超过14日。

本发明开辟了三氯生在治疗脓肿分枝杆菌的皮肤和深部多发脓肿分枝杆菌感染灶方面的新应用，本发明药物治疗效果敏感，十天外涂和口服可治愈，无副作用，短程、廉价、效果好、口感好。

具体实施方式

实施例1

三氯生对脓肿分枝杆菌的最小抑菌浓度实验：

试验方法：用DMSO配制的三氯生原液在阳离子调节的穆勒辛顿肉汤中连续稀释2倍，最终浓度范围为64.0-0.031ug mL^-1；将该杀菌剂稀释液滴入微滴板孔中；将每个分离株的分枝杆菌细胞从新鲜生长的琼脂培养皿中拭取到无菌蒸馏水(4.5mL)中，以获得匹配0.5麦克法兰标准(1.5×10⁸CFUml^-1)的细胞悬液；悬浮液在无菌水中连续稀释，以获得所需的细胞浓度1.5×10⁶CFUml^-1，将该悬浮液10ul添加到含生物碱的孔中。在37℃的环境空气中培养，并在72小时检测生长抑制。

结果：在8-64μg/mL的浓度范围条件下，脓肿分枝杆菌的生长完全受到抑制，即平均MIC值为8μg/mL。MIC被定义为能完全抑制宏观生长的最低杀菌剂浓度。

实施例2

三氯生的毒理学安全性测定:

(1)急性毒性 三氯生的毒性较低。大鼠和小鼠的经口LD50>3 700mg/kg，家兔的经皮LD50>9 000mg/kg、吸入LC50>0.15mg/L。大鼠经皮下、腹腔、静脉注射三氯生的平均病毒滴度分别为>14 700mg/kg、>1 090mg/kg、>29mg/kg。

(2)皮肤(眼)刺激性和皮肤致敏性急性经皮毒性试验结果显示，5％三氯生对家兔的皮肤产生中度但可逆转的刺激性。急性眼刺激性试验结果显示，1％～100％三氯生对家兔产生可逆的眼刺激性。但14d经皮重复毒性试验结果显示，1.5％～6％三氯生对大鼠或小鼠的皮肤产生中度至重度的皮肤刺激性。局部封闭涂皮试验结果显示，豚鼠皮下注射0.1％的三氯生或局部给药1％～10％三氯生，均未引起皮肤致敏反应。

(3)致突变性/遗传毒性在三氯生的鼠伤寒沙门菌回复突变试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验中，除中国仓鼠肺细胞(V79)基因突变试验结果显示阳性外，其他试验结果均为阴性。

(4)慢性毒性(致癌性)：小鼠经口给予不同剂量[0、10、30、100、200mg/(kg·d)]的三氯生溶液18个月，结果显示，在10mg/(kg·d)组的小鼠出现肝腺瘤和肝癌，且呈剂量依赖性，此外，雄性小鼠的肝癌发病率高于雌性小鼠。对于三氯生引起小鼠肝癌的机制研究中，三氯生可通过介导小鼠肝细胞增殖、肝纤维化和氧化应激反应，从而促进肝细胞瘤生长，并增加肿瘤多样性和发病率。但在大鼠慢性毒性试验中，三氯生未见肝毒性和致癌性；在仓鼠慢性毒性试验中，三氯生仅有肝毒性，无致癌性。三氯生对小鼠的致癌性是由于三氯生激活过氧化物酶体增殖物激活受体所致；而对于大鼠、仓鼠及人类，此致癌机制并未发挥作用。

实施例2内容表明，三氯生不具备致癌性、遗传毒性，急性毒性、皮肤(眼)刺激性和皮肤致敏性急性经皮毒性均在安全范围内，因此，不具备副作用。

实施例3

动物临床实验：

实验用菌株由上海一研生物科技有限公司提供，安全等级：二级，安全柜操作。

实验动物：

NSI小鼠购置于北京斯贝福生物技术有限公司，日龄为42到48天，性别为雄性；

试验用药物由北京娜雅医药有限公司提供

试验主要培养基和药物配置方法：

1)活化并培养菌株：准备1支含有5-10ml液体培养基的试管和2个平板；安全柜中打开，用酒精灯灼烧顶部，后迅速滴上无菌水使之破裂，随后用镊子将其敲碎；吸取0.5ml液体培养基打入冻干管，充分溶解后重新打回液体试管中，混匀；吸取0.2ml菌悬液打入平板中，涂布均匀，重复两次获得两个平板；将液体试管和平板全部置于上述培养条件下培养，菌种长出即可使用。短期存放10天或30天参照说明书操作；

2)配制OADC增菌液、7H10固体培养基、0.5％CMC-Na溶液、LB液体和固体培养基、保菌用80％甘油。

OADC增菌液配制方法：分别称取50g牛血清白蛋白，40mg过氧化氢酶，8.1NaCI，20g葡萄糖，30ml油酸溶液至2.5L体积的量杯，加入920mLddH₂O,4℃冷库中过夜搅拌溶液后，使用0.22μm滤器过滤至无菌离心管保存；

7H10固体培养基配制方法：分别取9.5g7H10粉末，2.5mL甘油，450mLddH₂O至500mL体积的蓝盖玻璃瓶，混匀后适当拧松瓶盖，高压灭菌后，放置65℃烘箱烘干表面水分，2小时后取出，加入50mL增菌液迅速混匀后使用；

0.5％CMC-Na溶液配制方法：量取1L的去离子水至烧杯中，将5g的CMC-Na粉末均匀倒入在烧杯中，注意倒入时尽可能分开粉末，尽可能加热搅拌均匀，过滤团块后取澄清液体使用；

LB液体和固体培养基配制方法：分别称取5g胰蛋白胨，2.5g酵母提取物，2.5gNaCI，450mL ddH₂O至500mL体积的蓝盖玻璃瓶，如配制固体培养基需额外添加7.5g的琼脂粉，高压灭菌完成后，放置65℃烘箱烘干水分，1小时后取出，常温保存；

保菌用80％甘油配制方法：使用时移液枪，小心移取80mL纯品甘油，加入20mL去离子水，混匀后轻轻拧松瓶盖，高压灭菌后，常温储存备用。使用时，需要使甘油在菌液的终浓度为10％左右，对于细胞壁脂类物质含量较高的分枝杆菌的保存时，可以不加甘油。

试验方法和步骤：

1)菌种复苏：将其涂于7H11固体平板中，在37度培养箱中培养4-5天左右后，根据检测的发光值挑取菌落，接种入50ml无菌离心管，加入5ml的新鲜7H9液体培养基，轻轻拧松瓶口，并用胶带固定，最后用保鲜袋包好离心管，将离心管放置于37度摇床中200rpm培养24个小时左右。分别使用发光仪检测各个离心管中的菌液，挑取其中发光值较高的离心管，检测整块平板是否具有发光值。同时移取适量菌液于冻存管中，放置于-80度冰箱冻存；

2)菌液样本PCR和送测序

移取部分培养菌液于85度加热20分钟灭活后进行菌液PCR。根据实验室已经设计合成的引物序列，分别扩增电泳鉴定后的PCR产物，进行测序。根据测序结果，进行基因序列比对确认是否为脓肿分枝杆菌；

3)小鼠到达确认

按照订单号和合格证号，确认到达的小鼠为6-7周龄的雄性NSI(免疫缺陷小鼠)鼠，装笼30只分3组，等待动物中心检疫完成后，标记好到达的时间和数量，放置在生物安全二级实验室适应1周；

4)NSI鼠感染

NSI鼠30只在生物安全二级实验室适应1周后开始进行感染。将制备的菌液离心后使用生理盐水重悬、过细胞筛采用皮下注射的方式感染10只；另20只采用尾静脉注射的方式感染，每只体积不超过0.2ml；

5)感染观察和给药

每日观察并记录拍摄皮肤感染情况和生命体征记录，皮肤脓肿破溃形成后大约5-10天时开始给药。连续治疗1周，皮肤破溃脓肿组每天外用药物一次，一次适量约2g；尾静脉注射组治疗组每天口服一次，连续治疗1周，药物浓度和剂量按照公式计算；尾静脉注射组空白对照组观察感染情况及生命体征；1周后观察各组治疗情况并记录，进行结果统计分析；如果治疗效果明显，处死后进行皮肤、肺脏、肝脏及可见病灶的病理切片比较；并记录感染、死亡、肿瘤发生、活动度的差异及变化。

结果：皮下治疗组在感染第3天出现皮疹、红肿，第7天皮肤脓肿较明显时开始应用外用三氯生酒精凝胶，连续用药1周后观察皮肤脓肿全部治愈。

尾静脉注射治疗组第7天NSI鼠活动力明显下降，口服药物一周后解剖行脏器病理切片正常。

尾静脉注射对照组第7天NSI鼠活动力明显下降，且有死亡现象，解剖行病理切片发现多脏器脓肿形成。

应用本发明实例：

女，46岁。应反复面部、鼻部、肺部、腹部脏器、椎骨多发脓肿5年，面部皮肤红肿破溃、疼痛流脓。先后抗结核治疗无效，后输注和口服利奈唑胺症状减轻，后一直口服利奈唑胺维持治疗，但近半年出现乏力、面部破溃疼痛加重。住院判断为利奈唑胺耐药。

体格检查：精神欠佳，系统检查未见明显异常。皮肤科检查：左脸颊部皮肤破溃红肿，直径9cm，明显隆起，局部疼痛有波动感。实验室检查：WBC：10.47×109/L，RBC：2.9×1012/L，Hb：66g/L。血清铁：2.6umol/L，血清总铁结合力：39.6umol/L，血清铁饱和度：6.6％。腹部CT：胰头及周围区域团块影，考虑占位性病变，可能为淋巴结转移，肝右叶近包膜下结节状强化，胆囊壁稍增厚；胆囊结石。脾脏增大，腹膜后淋巴结增多增大；部分椎体骨质密度增高。胰头部占位活检排除肿瘤可能，为脓肿病理组织改变。脓液抗酸染色阳性，分枝杆菌培养和生化鉴定为脓肿分枝杆菌。

治疗：给予三氯生外用药外用2周后面部破溃结痂愈合，口服三氯生十天后复查腹部CT未见异常。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.三氯生用于治疗脓肿分枝杆菌感染灶的新应用。