CN111926061A - 一种用于检测树突状细胞中环状rna分布位置的方法 - Google Patents

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周谦
曹春园
陈慧
吴慕瑶
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Abstract

本发明公开了一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，包括以下步骤：将明胶铺在培养板；将树突状细胞铺到培养板；将400μl 4%的多聚甲醛（PFA）加入到培养板中，室温下放置后润洗两次；将200μl 0.1%的Triton加入到培养板并进行细胞破膜打孔，在室温下放置后润洗两次；将1.5μg变性的DNA生物素探针加入到150μl预热至55℃的RNA杂交液中，然后将该混合物立即加入到培养板中，弃去混合液，用RNA杂交清洗液润洗两次，然后将1µg/ml带有红色荧光标记的链霉亲和素加入到培养板；将含有DAPI（1:5000）的PBS共染细胞核加入到培养板，置于荧光显微镜下观察，红色荧光部分即为树突状细胞中环状RNA的分布位置。本发明具有能确定树突状细胞中环状RNA的分布位置的优点。

Description

一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，具体涉及一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法。
背景技术
树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是由骨髓祖细胞分化成的重要的免疫细胞，与先天性和适应性免疫反应密切相关。根据细胞发育分化的程度，DCs分为未成熟的树突状细胞(imDCs)和成熟的树突状细胞(mDCs)。未成熟的DCs低表达MHCII类分子、共刺激分子和黏附分子，能通过吞噬和巨胞饮作用(macropinocytosis)摄取抗原，但加工提呈抗原的能力较弱,不能激活T细胞。未成熟DCs一旦摄取抗原或受到炎性刺激即进入成熟阶段，表型和功能均发生改变：高表达MHCII类分子、共刺激分子和黏附分子(如ICAM-1、DC-SIGN)，不表达FcR、CR和病原体受体。虽然摄取和加工抗原的能力降低，却具有强大的提呈抗原能力，可以向T细胞提供抗原肽，启动MHC I类限制性细胞毒性T细胞(CTL)反应和MHC II类限制性CD4+Th1反应。DCs是专业的抗原提呈细胞，在T细胞的激活、分化和功能中发挥着重要作用。根据其免疫功能，DCs可分为免疫反应性和免疫抑制性两大类。前者激活T细胞，促进Th1分化，从而启动免疫应答，而后者不能激活幼稚T细胞，但可以增强调节性T细胞(Tregs)。一般来说，imDCs具有免疫抑制作用，而mDCs具有免疫反应性。在器官移植中，imDCs的诱导已被用于抑制免疫、治疗自身免疫性疾病和免疫排斥反应。
环状RNA(circRNA)是一种新型的非编码RNA，作为重要的基因调节因子，在细胞发育、增殖和疾病发生等多种生理病理过程中发挥着重要作用。环状RNA作为当今研究的热点，参与多种疾病发生、发展的调控，利用RNA-seq技术确定环状RNA的表达量也越来越受到研究者的青睐。确定环状RNA在树突状细胞中的分布，有利于进一步深入细胞调控机制的研究，但是树突状细胞中环状RNA分布位置的检测技术目前文献中还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速准确地确定树突状细胞中环状RNA分布位置的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将明胶均匀铺在24孔培养板中，使其覆盖培养板孔底，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中至少2小时；
步骤(2)：将收集的树突状细胞(2x10^5)均匀铺到步骤(1)的24孔培养板上，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中，使树突状细胞充分粘附在24孔培养板上；
步骤(3)：将培养板从二氧化碳培养箱中取出，弃去上清液，然后用冷的(4℃)PBS轻轻加入到培养板中润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(4)：将至少400μl质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)加入到培养板中，然后将培养板在室温下放置15～25分钟后弃去上清液，接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(5)：将至少200μl质量浓度为0.1％的Triton加入到培养板中并进行细胞破膜打孔，然后将培养板在室温下放置15分钟；接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(6)：将1.5μg变性的DNA生物素探针加入到150μl预热至55℃的RNA杂交液中，然后将该混合物立即加入到步骤(5)的培养板中，并在室温下孵育2小时；
所述变性的DNA生物素探针与环状RNA特异性连接点互补，经PCR合成；
所述RNA杂交液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,质量浓度为10％的SDS，质量浓度为100％甲酰胺，以及无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:甲酰胺:无菌水＝180:20:1:200:599；
步骤(7)：弃去培养板中的混合液，用RNA杂交清洗液润洗细胞两次，然后将1μg/ml带有红色荧光标记的链霉亲和素streptavidin,Alex FlourTM594conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)加入到培养板中，并在室温下避光孵育1.5小时，弃去上清液；然后用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次，弃去上清液；
所述RNA杂交清洗液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,以及质量浓度为10％的SDS，摩尔浓度为0.5mol/L的EDTA，无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:EDTA:无菌水＝45:20:1:10:924；
步骤(8)：将含有DAPI(1:5000)的PBS加入到步骤(7)的培养板中共染细胞核，然后将培养板置于荧光显微镜下观察，红色荧光部分即为树突状细胞中环状RNA的分布位置。
进一步地，前述的一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，其中：步骤(1)中的明胶为质量浓度为1％的明胶。
进一步地，前述的一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，其中：在步骤(4)中，将至少400μl质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)加入到培养板中，然后将培养板在室温下放置20分钟后弃去上清液，接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液。
通过上述技术方案的实施，本发明的有益效果如下：利用PCR合成的与环状RNA连接位点互补的生物素探针结合的特异性，更准确地靶定环状RNA，然后再利用生物素-链霉亲和素结合的特性，加入带有红色荧光标记的链霉亲和素streptavidin,AlexFlourTM594conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)使之与生物素探针结合，从而快速准确地确定树突状细胞中环状RNA的分布位置。
具体实施方式
一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将质量浓度为1％的明胶均匀铺在24孔培养板中，使其覆盖培养板孔底，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中至少2小时；
步骤(2)：将收集的树突状细胞(2x10^5)均匀铺到步骤(1)的24孔培养板上，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中，使树突状细胞充分粘附在24孔培养板上；
步骤(3)：将培养板从二氧化碳培养箱中取出，弃去上清液，然后用冷的(4℃)PBS轻轻加入到培养板中润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(4)：将至少400μl质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)加入到培养板中，然后将培养板在室温下放置20分钟后弃去上清液，接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(5)：将至少200μl质量浓度为0.1％的Triton加入到培养板中并进行细胞破膜打孔，然后将培养板在室温下放置15分钟；接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(6)：将1.5μg变性的DNA生物素探针加入到150μl预热至55℃的RNA杂交液中，然后将该混合物立即加入到步骤(5)的培养板中，并在室温下孵育2小时；
所述变性的DNA生物素探针与环状RNA特异性连接点互补，经PCR合成；
所述RNA杂交液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,质量浓度为10％的SDS，质量浓度为100％甲酰胺，以及无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:甲酰胺:无菌水＝180:20:1:200:599；
步骤(7)：弃去培养板中的混合液，用RNA杂交清洗液润洗细胞两次，然后将1μg/ml带有红色荧光标记的链霉亲和素streptavidin,Alex FlourTM594conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)加入到培养板中，并在室温下避光孵育1.5小时，弃去上清液；然后用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次，弃去上清液；
所述RNA杂交清洗液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,以及质量浓度为10％的SDS，摩尔浓度为0.5mol/L的EDTA，无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:EDTA:无菌水＝45:20:1:10:924；
步骤(8)：将含有DAPI(1:5000)的PBS加入到步骤(7)的培养板中共染细胞核，然后将培养板置于荧光显微镜下观察，红色荧光部分即为树突状细胞中环状RNA的分布位置。
本发明的优点如下：利用PCR合成的与环状RNA连接位点互补的生物素探针结合的特异性，更准确地靶定环状RNA，然后再利用生物素-链霉亲和素结合的特性，加入带有红色荧光标记的链霉亲和素streptavidin,Alex FlourTM594conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)使之与生物素探针结合，从而快速准确地确定树突状细胞中环状RNA的分布位置。

Claims (3)

1.一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)：将明胶均匀铺在24孔培养板中，使其覆盖培养板孔底，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中至少2小时；
步骤(2)：将收集的树突状细胞(2x10^5)均匀铺到步骤(1)的24孔培养板上，然后将培养板置于内部温度为37℃的二氧化碳培养箱中，使树突状细胞充分粘附在24孔培养板上；
步骤(3)：将培养板从二氧化碳培养箱中取出，弃去上清液，然后用冷的(4℃)PBS轻轻加入到培养板中润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(4)：将至少400μl质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)加入到培养板中，然后将培养板在室温下放置15～25分钟后弃去上清液，接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(5)：将至少200μl质量浓度为0.1％的Triton加入到培养板中并进行细胞破膜打孔，然后将培养板在室温下放置15分钟；接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液；
步骤(6)：将1.5μg变性的DNA生物素探针加入到150μl预热至55℃的RNA杂交液中，然后将该混合物立即加入到步骤(5)的培养板中，并在室温下孵育2小时；
所述变性的DNA生物素探针与环状RNA特异性连接点互补，经PCR合成；
所述RNA杂交液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,质量浓度为10％的SDS，质量浓度为100％甲酰胺，以及无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:甲酰胺:无菌水＝180:20:1:200:599；
步骤(7)：弃去培养板中的混合液，用RNA杂交清洗液润洗细胞两次，然后将1μg/ml带有红色荧光标记的链霉亲和素streptavidin,Alex FlourTM594 conjugate(Cat.#S11227,Invitrogen)加入到培养板中，并在室温下避光孵育1.5小时，弃去上清液；然后用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次，弃去上清液；
所述RNA杂交清洗液包含：摩尔浓度为5mol/L的NaCl,摩尔浓度为1mol/L的Tris-HCl,质量浓度为10％的SDS，摩尔浓度为0.5mol/L的EDTA，以及无菌水，上述各成分的体积比为：NaCl:Tris-HCl:SDS:EDTA:无菌水＝45:20:1:10:924；
步骤(8)：将含有DAPI(1:5000)的PBS加入到步骤(7)的培养板中共染细胞核，然后将培养板置于荧光显微镜下观察，红色荧光部分即为树突状细胞中环状RNA的分布位置。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，其特征在于：步骤(1)中的明胶为质量浓度为1％的明胶。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测树突状细胞中环状RNA分布位置的方法，其特征在于：在步骤(4)中，将至少400μl质量浓度为4％的多聚甲醛(PFA)加入到培养板中，然后将培养板在室温下放置20分钟后弃去上清液，接着用冷的(4℃)PBS润洗细胞两次并弃去上清液。
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