CN111925434B - 一种单克隆抗体的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种单克隆抗体的筛选方法,包括以下步骤:(S1)构建抗体重、轻链可变区基因文库;(S2)分别构建抗体重链和轻链表达载体,混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,得到阳性组合;(S3)将阳性组合中的所有重链进行转化后,得到所有重链序列组合H0,拆分m份后得到重链子序列H1,H2,H3...Hm;同样地,将所有轻链进行转化后,得到所有轻链序列组合L0,拆分m份后得到L1,L2,L3...Lm,之后进行抗体重、轻链可变区基因全部序列与拆分子序列的组合筛选;该方法能够从患有感染性疾病的患者记忆B细胞中得到的海量的序列,筛选出具有高亲和力,高特异性的重链和轻链组合。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种单克隆抗体的筛选方法。
背景技术
抗体是指抗原刺激机体后,由B淋巴细胞或浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。其中,由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。单克隆抗体的发展经历了鼠源性单克隆抗体,嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源化单克隆抗体四个阶段。现如今,随着单克隆抗体制备技术的不断发展和完善,单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等多种学科和领域得到了广泛的应用,同时也对于生物学分子作用机理的研究也起到了很大推动作用。
单克隆抗体技术的发展让人们在新的领域得到了发现,但它在临床上的应用却经历了漫长的过程。经过杂交瘤技术得到的鼠源性抗体,用于人体治疗时存在各种问题。首先,由于鼠源性单克隆抗体对于人体属于异种蛋白,因此,应用于人体后很容易引发针对异种蛋白的免疫反应,影响单抗的治疗效果。其次,鼠源性单克隆抗体因其缺乏人体内抗体特异性糖基化和亲和力成熟过程,通常不能有效地激活人体的生物效应功能,如补体依赖的细胞毒性(CDCC)及抗体依赖的细胞毒性(ADCC)作用。此外,鼠源性单克隆抗体在人体内的半衰期也较短。这些都限制了鼠源性单克隆抗体的治疗作用。随着研究的不断深入,又产生了诸如嵌合抗体,噬菌体展示为代表的体外展示技术,单细胞克隆技术,EB病毒介导的B细胞永生技术,蛋白质谱分析结合DNA高通量测序技术等等单克隆抗体制备技术,这些技术在保留对特异抗原表位的高亲和力的基础上实现人源化的改造,大大减少异源抗体的免疫源性,但是这些技术也存在着如比如单克隆抗体产量不稳定,易于丢失等缺点。近年来,全人源单克隆抗体受到关注,其具有特异性强,疗效快,半衰期短和副作用小等临床治疗优势,代表了药品治疗领域的最新发展方向。
目前,测序技术日新月异,发展迅速,近年来发展起来的二代测序技术(NGS)具有费用低、通量高、速度快的优势,且已经广泛用于研究抗体基因谱组成的多样性,通过高通量测序,我们可以得到众多重链和轻链的序列,如何在众多的序列中快速找到与抗原具有亲和力的重链和轻链配对一直是一个难题。传统的方法是分别构建重链和轻链的表达载体,然后按照单一重链和单一轻链组合的原则,进行表达以及功能性验证。但是它却存在耗时长、工作量大和难以大规模进行筛选等缺点,因此寻找一种高通量的抗体筛选方式显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术的不足及实际需求,本发明提供了一种与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体的筛选方法,该方法能够从患有感染性疾病的患者记忆B细胞中得到的海量的序列,并快速找出能产生对抗目的抗原的单克隆抗体的重链和轻链配对组合,从而筛选出具有高亲和力,高特异性的重链和轻链组合,显著提高单克隆抗体筛选的工作效率。
一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、构建抗体重、轻链可变区基因文库;
S2、分别构建抗体重链和轻链表达载体,混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,得到阳性组合;
S3、将阳性组合中的所有重链与轻链可变区基因重组质粒进行转化后,得到所有重链序列组合H0与所有轻链序列L0,拆分m等份后分别得到重链子序列与轻链子序列,重、轻链全部序列及拆分的子序列混合筛选确定最佳重、轻链子序列后,各挑选n份重、轻链单克隆序列,进行重、轻链最佳子序列与对应单克隆序列的混合筛选,筛选后选取高亲和力的重、轻链单克隆序列进行“一对一”配对筛选,最终得到高特异性的单克隆抗体。
优选的,步骤(S3)中重、轻链全部序列及拆分序列的组合筛选方式包括如下步骤:
(a)将所有重链序列组合H0分别与所有轻链序列组合L0,通过构建表达载体,将所有重链序列组合H0与对应的轻链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的轻链子序列;
(b)将所有轻链序列组合L0与对应的重链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的重链子序列;
(c)将步骤(a)、(b)得到的最佳拆分的重链和轻链序列分别进行转化,各挑取n个单克隆序列并构建表达载体;
(d)类似地,将以上优选的重、轻链单克隆子序列分别与(a)、(b)步骤得到的最佳轻链子序列和最佳重链子序列进行混合筛选,各得到OD值排名前10左右的高亲和力的重链和轻链单克隆子序列;
将以上得到的高亲和力重链与轻链单克隆序列挑选后按照“一对一”的组合方式进行筛选,直至筛选出特异性最高,亲和力最强的单克隆抗体序列;
其中m、n均取大于等于1的整数。
优选的,步骤(S3)中将阳性组合中的所有重链和轻链序列分别拆分成m组,确定最佳拆分重、轻链子序列后,又重新将确定最佳的拆分重链与轻链进行单克隆挑选,确定高亲和力重轻、链单克隆序列后,按照重、轻链序列“一对一”配对原则,将n条重链和n条轻链随机配对,利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,类似地进行重复多次的筛选得到与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。
优选的,所述的表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物表达系统中的任意一种或几种。
优选的,所述的活性检测方法选自ELISA、IF、PHA以及RIA中的任意一种或几种。
优选的,步骤(S1)中所述的载体构建方法选自酶切连接、同源重组中的任意一种或几种。
优选的,步骤(S2)中所述的混合配对方式是重链表达载体与轻链表达载体以一定的质量比进行混合,混合的比例可以根据重链和轻链的条数进行相应调整。
与现有技术相比,本发明具有如下优势特点:本发明提供了一种高效的抗体筛选方法,提出了抗体“三步筛选”策略,第一步先将重、轻链所有序列进行拆分,拆分后将所有重、轻链序列分别与对应的拆分子序列进行混合筛选,确定最佳重、轻链子序列;第二步再将上一步得到的最佳重、轻链子序列分别进行单克隆挑选,同样地,将最佳重、轻链子序列分别与对应的单克隆序列进行混合筛选,得到高亲和力重、轻链单克隆序列;第三步将上一步得到的重、轻链单克隆序列按照“一对一”配对原则筛选出特异性最强,亲和力最高的抗体组合。该方法打破传统的一条重链与一条轻链配对表达的做法,组合方式灵活多变,科学严谨,灵敏度高,为单克隆抗体的大量制备提供了新的思路和方法,广泛应用在生物学、免疫学、医学以及相关领域。
附图说明
图1为本发明的筛选步骤示意图;
图2为重链序列H0与轻链序列L0分10组筛选结果;
图3为重链序列H5中挑选的20个单克隆序列与轻链序列L7筛选的结果;
图4为轻链序列L7中挑选的20个单克隆序列与重链序列H5筛选的结果;
图5为排名前五的重轻链单克隆序列“一对一”配对筛选结果;
图6为记忆B细胞在96孔细胞培养板上的布局图;
图7为采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测B细胞上清中特异性抗体的分泌的结果(A1-A20为ELISA结果中挑选的对照孔及OD值较高的孔,其中A1-A2:PBS对照和0个记忆B细胞对照,A3-A8:100个记忆B细胞,A9-A14:200个细胞,A15-A20:500个细胞。)。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案及优点更为明确清晰,以下结合附图和实施例,对本发明进行作进一步详细说明,但本发明并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所给说明条件进行操作。
本发明要解决的技术问题通过以下技术方案得以实现:
(S1)构建抗体重、轻链可变区基因文库;
(S2)分别构建抗体重链和轻链表达载体,混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,得到阳性组合;
(S3)将阳性组合中的所有重链进行转化后,得到所有重链序列组合H0,拆分m份后得到重链子序列H1,H2,H3...Hm;同样地,将所有轻链进行转化后,得到所有轻链序列组合L0,拆分m份后得到L1,L2,L3...Lm,之后进行抗体重、轻链可变区基因全部序列与拆分子序列的组合筛选。
步骤(S1)中构建全人源单克隆抗体基因组文库,具体方式如下:
将扩增的抗体重链可变区基因VH和轻链可变区基因Vκ、Vλ分别连接到表达载体pIgH(AbVec-hIgG1 for VH),pIgκ(AbVec-hIgKappa for Vκ)和pIgλ(IG-lambdaexpression vector for Vλ)(NCBI GenBank编号分别为:FJ475055,FJ475056,FJ517647)上。依次使用AgeI-HF和Sal I-HF酶切VH、pIgH;用AgeI-HF和Xho I酶切Vλ、pIgλ;用AgeI-HF酶切Vκ、pIgκ,再用BsiW I酶切Vκ、pIgκ。将上述酶切产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的基因位置,并回收胶并保存目的基因。
重链和轻链表达载体构建方法可以是酶切连接、同源重组等方法中的一种或几种。根据相应的方案设计,本发明进一步优选的技术方案为酶切连接。该方法目的性强,准确性高,能够实现对目的基因的精准切割连接,为下一步抗体重、轻链筛选打下基础。
作为优选技术方案,步骤(S3)所述的筛选方式包括如下步骤:
(a)将所有重链序列组合H0分别与所有轻链序列组合L0,通过构建表达载体,将所有重链序列组合H0与对应的轻链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的轻链子序列;
(b)将所有轻链序列组合L0与对应的重链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的重链子序列;
(c)将步骤(a)、(b)得到的最佳拆分的重链和轻链序列分别进行转化,各挑取n个单克隆序列并构建表达载体;
(d)类似地,将以上优选的重、轻链单克隆子序列分别与(a)、(b)步骤得到的最佳轻链子序列和最佳重链子序列进行混合筛选,各得到OD值排名前10左右的高亲和力的重链和轻链单克隆子序列。
将以上得到的高亲和力重链与轻链单克隆序列挑选后按照“一对一”的组合方式进行筛选,直至筛选出特异性最高,亲和力最强的单克隆抗体序列;
其中m、n均取大于等于1的整数。
重链与轻链的组合方式可以按照需要选择以下配对方式中的一种或者几种组合,配对方式有:重链混合序列与单一轻链子序列配对,轻链混合序列与单一重链子序列配对,单一重链子序列与单克隆轻链序列配对,单克隆重链序列与单一轻链子序列配对,单克隆重链序列与单克隆轻链序列配对。
所有重链序列与拆分后的轻链子序列混筛,筛出最佳轻链子序列;将所有轻链序列与拆分后重链子序列混筛,筛出最佳重链子序列。同样地,在最佳重、轻链序列中分别进行单克隆挑选后进行混筛,得到高亲和力的重、轻链单克隆序列。最后按照重、轻链“一对一”配对组合的方式筛选得到特异性最强,亲和力最高的单克隆抗体组合。
所述的表达系统可以是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物表达系统中的任意一种或者几种组合。
所述活性检测的方法可以是ELISA、IF、PHA以及RIA中任意一种或者几种组合,进一步优选的技术方法为ELISA法。该方法操作简便,灵敏度很高,可以在微克甚至纳克水平上对抗体进行定量,且特异性强,现已被广泛应用于单克隆抗体的筛选和鉴定。
实施例:抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体的制备
从丙肝康复志愿者体内抽取50ml新鲜血液,分离外周血单核细胞(peripheryblood mononuclear cell,PBMC),之后采用“人记忆B细胞分选磁珠”试剂盒(德国Miltenyi,Cat.NO.99-130-046-901)分选人记忆B细胞,最后采用“人B细胞CD27分选磁珠”试剂盒,通过特异性磁珠标记分选出人记忆B细胞。
记忆B细胞的体外活化培养及阳性孔筛选,具体步骤:将分选所得的记忆B细胞按照10细胞/孔、50细胞/孔、100细胞/孔、200细胞/孔等密度接种96孔细胞培养板,记忆B细胞在96孔细胞培养板上的布局(图6),采用适宜的条件培养一定时间,将记忆性B细胞活化成为浆细胞分泌抗体,收集细胞上清进行检测;
采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测B细胞上清中特异性抗体的分泌(图7),结果如图所示;将96孔板中各孔进行综合分析,如图7所示,其中A1、A2孔为对照孔,OD值平均为0.0369,最后确定18个阳性孔进行编号A3-A20,其中编号A4、A7、A13、A14、A18、A19、A20三个阳性孔的OD值明显高于其他孔,其余阳性孔相对于对照孔也有一定的程度升高,OD值均在0.3左右,选取高OD值阳性孔进行后期实验。
抗体可变区基因文库的构建及筛选,具体步骤为:用枪头吹打活化培养后的细胞,将其吸到无核酸酶的PCR管中,再用适量的PBS洗一次,然后加入0.25%胰蛋白酶进行消化,FBS终止消化后迅速将细胞放入液氮和98℃的PCR仪中处理,随后放入液氮速冻,每管加入适量蛋白酶K和RNA酶抑制剂,最后置于PCR仪中53℃,1h。
用两步RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因VH(为了提高每步实验效率,将重链可变区基因VH引物分成了H和H’两大类,再分别进行PCR的扩增及后续的实验,在重组质粒转化时再将两大类混合在一起挑取单克隆)和轻链可变区基因Vκ或Vλ:以反转录后的cDNA作为PCR模板,进行巢式PCR第一轮反应;然后再以巢式PCR第一轮反应产物为模板,进行巢式PCR第二轮反应。具体引物序列、PCR反应程序以及PCR反应体系参考文献(NatProtoc.2009;4(3):372-84.)。经琼脂糖凝胶电泳检测确定成功将重链基因和轻链基因构建到了其对应的表达载体。
抗体重链可变区和轻链可变区基因的筛选,筛选方式如下:
将重、轻链可变区基因总文库H、L随机分成14(m=14)个子文库,随后将H总文库分别与10个轻链子文库组合筛选,得到阳性轻链子文库,再将阳性轻链子文库与10个重链子文库组合筛选,得到阳性重链子文库(图2),随后将筛选到的阳性重链、轻链子文库各挑20个(n=20)单克隆,按照上一步类似方法进行混合筛选,得到最佳的重、轻链单克隆序列(图3和图4),最后随机挑选5条重、轻链单克隆序列,按照“一对一”配对组合方式,得到特异性单克隆抗体组合(图5),具体步骤如下:
(1)接种细胞:将0.25%的胰酶-EDTA消化终止后的细胞,按每孔1×104个细胞接种96孔板,再补加培养液至190μl。同时设置对照组,对照组1为加转染试剂和细胞,但不加质粒;对照组2为只加细胞,不加转染试剂和质粒。
(2)用opti-MEM分别稀释质粒和转染试剂,使得加入每孔的转染试剂为0.15μl,每孔的质粒为100ng。
(3)按1:1的比例将稀释的质粒和稀释的转染试剂混匀,5min后将其加入到接种有细胞的孔中,37℃、5%的CO2培养箱中培养,48h后检测抗体含量。
(4)ELISA检测细胞培养上清IgG分泌量:收集步骤(3)中的转染后细胞培养上清,使用VP1蛋白包被酶标板,采用人IgG作为标准品,标准品对应的二抗为1:5000稀释的HRP标记的Goat Anti-Human IgG,待检测的培养基上清对应的二抗为1:10000稀释的Goat x-human IgG-Fc Fragment HRP Conjugated。最后加入显色液100μl/孔,室温避光显色10min;加入2mol/L硫酸50μl/孔,终止显色反应,检测OD值,参考波长为450nm。
通过特异性的筛选模式,最后成功筛选得到3株高亲和力的抗丙型肝炎病毒的全人源单克隆抗体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、构建抗体重、轻链可变区基因文库;
S2、分别构建抗体重链和轻链表达载体,混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,得到阳性组合;
S3、将阳性组合中的所有重链与轻链可变区基因重组质粒进行转化后,得到所有重链序列组合H0与所有轻链序列组合L0,拆分m等份后分别得到重链子序列与轻链子序列,重、轻链全部序列及拆分的子序列混合筛选确定最佳重、轻链子序列后,各挑选n份重、轻链单克隆序列,进行重、轻链最佳子序列与对应单克隆序列的混合筛选,筛选后选取高亲和力的重、轻链单克隆序列进行“一对一”配对筛选,最终得到高特异性的单克隆抗体;
其中m、n均取大于等于1的整数。
2.如权利要求1所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,步骤(S3)中重、轻链全部序列及拆分序列的组合筛选方式包括如下步骤:
(a)将所有重链序列组合H0分别与所有轻链序列组合L0,通过构建表达载体,将所有重链序列组合H0与对应的轻链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的轻链子序列;
(b)将所有轻链序列组合L0与对应的重链拆分子序列表达载体进行混合筛选,确定最佳拆分的重链子序列;
(c)将步骤(a)、(b)得到的最佳拆分的重链和轻链序列分别进行转化,各挑取n个单克隆序列并构建表达载体;
(d)类似地,将以上步骤(c)挑取的n个重、轻链单克隆子序列分别与(a)、(b)步骤得到的最佳轻链子序列和最佳重链子序列进行混合筛选,各得到OD值排名前10的高亲和力的重链和轻链单克隆子序列;
将以上得到的高亲和力重链与轻链单克隆序列挑选后按照“一对一”的组合方式进行筛选,直至筛选出特异性最高,亲和力最强的单克隆抗体序列。
3.如权利要求2所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,步骤(S3)中将阳性组合中的所有重链和轻链序列分别拆分成m等份,确定最佳拆分重、轻链子序列后,又重新将确定最佳的拆分重链与轻链进行单克隆挑选,确定高亲和力重轻、链单克隆序列后,按照重、轻链序列“一对一”配对原则,将n条重链和n条轻链随机配对,利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达,对表达产物进行活性检测,类似地进行重复多次的筛选得到与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。
4.如权利要求1-3任一所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,所述的表达系统选自大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统以及哺乳动物表达系统中的任意一种或几种。
5.如权利要求1-3任一所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,所述的活性检测方法选自ELISA、IF、PHA以及RIA中的任意一种或几种。
6.如权利要求1所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,步骤(S1)中所述的载体构建方法选自酶切连接、同源重组中的任意一种或几种。
7.如权利要求1所述的一种单克隆抗体的筛选方法,其特征在于,步骤(S2)中所述的混合配对方式是重链表达载体与轻链表达载体以一定的质量比进行混合,混合的比例根据重链和轻链的条数进行相应调整。
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