CN111920792A - 甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血脑损伤疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甲基萘醌‑7在制备防治缺氧/缺血脑损伤疾病药物中的应用，属于医药技术领域。本发明以星形胶质细胞为切入点，阐明了MK‑7对缺氧/缺血性脑损伤保护作用的分子机制，结果表明，MK‑7通过抑制星形胶质细胞的氧化应激，线粒体功能障碍和炎症反应，改善了低氧诱导的细胞毒性。本发明为临床上防治缺氧/缺血性脑损伤和MK‑7更广泛地应用提供理论支持。

Description

甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血脑损伤疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血脑损伤疾病药物中的应用。

背景技术

星形胶质细胞是大脑中广泛分布的细胞类型，其可以产生营养因子、合成和分泌神经递质、清除毒素，维持大脑的稳态。星形胶质细胞在缺氧/缺血性脑损伤中的病理生理作用最近引起了人们的广泛关注，当缺氧/缺血超过机体耐受水平时，星形胶质细胞受损，产生炎性细胞因子，并能促进邻近神经元死亡，增加对大脑的损伤。因此，寻找有效的治疗损伤星形胶质细胞的药物将为缺氧/缺血性脑损伤提供有价值的贡献。

维生素K-2(vitamin K2,VK2)是一系列被称为甲基萘醌的化合物，其一共有14个异构体；它们有一个共同的核心分子—甲基醌，根据其侧链含有的不饱和异戊二烯基单元的数量进行分类。甲基萘醌-7(menaquinone-7,MK-7)是VK2家族中最佳的生物活性形式，并且其生物利用度最高。

当缺氧/缺血超过机体耐受水平时，星形胶质细胞受损，产生炎性细胞因子，并能促进邻近神经元死亡，增加对大脑的损伤。因此，寻找有效的治疗损伤星形胶质细胞的药物将为缺氧/缺血性脑损伤提供有价值的贡献。在许多国家，MK-7已被用作预防或逆转骨质疏松症和心血管疾病的治疗营养素；但其在缺氧/缺血性脑损伤中的作用未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血性脑损伤疾病的药物中的应用。

本发明以星形胶质细胞为切入点，通过研究发现MK-7可以增加缺氧星形胶质细胞的活力和增殖。同时，MK-7可以使星形胶质细胞在低氧条件下的形态趋于正常；MK-7可以通过平衡ROS的产生和优化ATP的生成来逆转线粒体功能障碍，从而减少缺氧诱导的星形胶质细胞氧化应激损伤；MK-7可以减少缺氧星形胶质细胞中促炎细胞因子和趋化因子的表达。由此推断，MK-7为缺氧星形胶质细胞提供了一种有希望的保护治疗，并可能有助于缺氧/缺血性脑损伤。

进一步地，本发明还阐明了MK-7对缺氧/缺血性脑损伤保护作用的分子机制。缺氧导致星形胶质细胞的Gas6表达降低，但MK-7预处理可明显增加Gas6水平；在缺氧条件下，Gas6与MK-7具备的星形胶质保护作用紧密相连，用siRNA沉默星形胶质细胞的Gas6表达，可明显减弱MK-7对星形胶质细胞的保护作用。

在本发明中确定了MK-7可以保护缺氧诱导的星形胶质细胞损伤，并探讨了其作用机制，为临床上防治缺氧/缺血性脑损伤和MK-7更广泛地应用提供理论支持。

附图说明

图1为实施例1中MK-7促进缺氧星形胶质细胞存活和增殖的结果。原代星形胶质细胞在低氧条件下培养4、6、8和12h，用CCK-8法(A)或BrdU法(B)测定细胞活力和增殖。在常氧条件下，用增加MK-7浓度的方法对星形胶质细胞进行72h的预处理，然后分析细胞活力(C)和增殖(D)。用CCK-8法(E)或BrdU法(F)检测低氧条件下MK-7预处理星形胶质细胞的细胞活力和增殖。G.原代星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白的免疫荧光(标尺：200μm)。H.在常氧或低氧条件下培养12h的星形胶质细胞在150μM MK-7预处理30h的存在或不存在下的形态学改变的代表性图像(标尺：200μm)。注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001与常氧组比较；#p<0.05，##p<0.01与单独缺氧处理的细胞相比；n＝6个独立实验。

图2为实施例2中MK-7减轻缺氧诱导的星形胶质细胞氧化损伤的结果。A.在常氧或低氧条件下培养星形胶质细胞4、6、8或12h，在10μM MK-7预处理30h的情况下进行或不进行预处理，然后用DCFDA细胞ROS测定试剂盒检测细胞内ROS水平。B.浓度梯度的MK-7处理低氧条件下星形胶质细胞ROS的产生。C.用二氢乙锭染色法测定预处理和非预处理MK-7的星形胶质细胞中的ROS免疫荧光(标尺：100μm)。注：*p<0.01与常氧单独组比较；#p<0.05，##p<0.01与单独缺氧处理的细胞相比；n＝3个独立实验。

图3为实施例3中MK-7保护缺氧星形胶质细胞的线粒体功能的结果。A.缺氧条件下培养4、6、8和12h的星形胶质细胞中ATP水平。B.在常氧条件下，MK-7浓度梯度预处理星形胶质细胞，检测细胞内ATP水平。C.10、50、100或150μM MK-7预处理30h，在低氧条件下培养12h,细胞内ATP水平。注：数据表示为在无MK-7预处理的常氧星形胶质细胞中ATP水平的百分比。*p<0.05，*p<0.01与常氧组比较；#p<0.05，##p<0.01与单独缺氧处理的细胞相比；n＝3个独立实验。

图4为实施例4中MK-7抑制缺氧星形胶质细胞的促炎细胞因子和趋化因子表达结果。用50、100或150μM MK-7预处理星形胶质细胞30h，在常氧或低氧条件下培养12h，然后用定量实时聚合酶链反应分析检测IL-6(A)、TNF-a(B)、Ccl2(C)和Cxcl10(D)水平。注：*p<0.01，**p<0.001与常氧组比较；#p<0.05与单独缺氧处理的细胞相比；n＝3个独立实验。

图5为实施例5中MK-7促进缺氧星形胶质细胞Gas6的表达结果。星形胶质细胞在常氧或低氧条件下培养12h，在150μM MK-7预处理，细胞内Gas6m RNA水平(A)和蛋白质水平(B)。*p<0.01与常氧组相比；#p<0.05，##p<0.01与单独缺氧处理的细胞相比；n＝3个独立实验。

图6为实施例5中沉默Gas6可降低MK-7对缺氧性星形胶质细胞保护的结果。A.转染si-Gas6后，星形胶质细胞中Gas6 mRNA的表达。B.在低氧12h条件下，si-Gas6转染的星形胶质细胞进行150μM MK-7预处理后，细胞内Gas6 mRNA的水平。C.在低氧条件下，Gas6siRNA对MK-7诱导的星形胶质细胞细胞活力增加的影响。Gas6 siRNA对MK-7诱导的缺氧星形胶质细胞ROS生成(D)和IL-6表达(E)降低的影响。F.在低氧条件下，Gas6 siRNA对MK-7诱导的星形胶质细胞ATP生成增加的影响。注：&p<0.01与si-control相比；*p<0.01与低氧组相比；#p<0.05，##p<0.01与MK-7处理的缺氧组相比。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

在本发明中，发明人发现缺氧会降低细胞活力和增殖，并增加ROS的生成，继而导致星形胶质细胞的氧化应激，线粒体功能障碍和炎症反应。给予MK-7后，低氧星形胶质细胞的细胞活力和增殖显着增加，并且过度ROS诱导的氧化应激显着降低。同时还发现，MK-7预处理可恢复线粒体功能并减轻炎症反应；并且其可以通过促进Gas6的表达来保护星形胶质细胞免受缺氧诱导的损伤，而siRNA-Gas6则部分逆转了此保护作用。目前的发现表明，MK-7通过抑制星形胶质细胞的氧化应激，线粒体功能障碍和炎症反应，改善了低氧诱导的细胞毒性。上述结果为临床上防治缺氧/缺血性脑损伤和MK-7更广泛地应用提供了理论支持。

实施例1

提取新生SD大鼠大脑皮层进行原代星形胶质细胞培养。利用缺氧工作站建立星形胶质细胞缺氧模型。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和BrdU法测定MK-7对缺氧星形胶质细胞的影响。

星形胶质细胞活力的测定使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(Dojindo，东京，日本)遵循制造商的操作指南。星形胶质细胞种于96孔培养板上，密度为6×10³/孔。用10、50、100和150μM MK-7预处理30h后，星形胶质细胞在低氧条件下维持12h，每孔加入15μL CCK-8溶液，星形胶质细胞在37℃下维持2h。用多功能酶标仪(Biotek，Winooski，VT，美国)在450nm处检测细胞吸光度。

根据制造商的说明书，使用BrdU细胞增殖ELISA试剂盒(罗氏，曼海姆，德国)进行BrdU检测。将星形胶质细胞种在黑色96孔板上，用10、50、100和150μM MK-7预处理，然后在低氧条件下培养12h。随后，加入10μM BrdU，细胞再培养18h。固定后，用100μL/孔anti-BrdU-POD工作溶液在25℃下维持星形胶质细胞100min。用底物溶液孵育10min后，用多功能酶标仪测量细胞的光发射。

1.MK-7促进缺氧星形胶质细胞的活力和增殖

如图1A和B所示：在低氧条件下，星形胶质细胞活力和增殖在所有时间间隔内都显著下降。缺氧12h引起星形胶质细胞最严重的损伤，因此，选择了这个时间点进行后续实验。

为了评估MK-7对缺氧星形胶质细胞的影响，在低氧条件下培养前，用一系列MK-7浓度(0、50、100、150μM)对细胞进行预处理。结果发现：在常氧条件下应用MK-7对星形胶质细胞活力和增殖几乎无影响(图1C和D，p>0.05)。值得注意的是，缺氧诱导星形胶质细胞活力和增殖明显减弱，但MK-7可以逆转此作用(图1E和F，p<0.05)，且150μM MK-7预处理的效果最好；因此，选择了150μM MK-7进行后续实验。同时发现：在低氧条件下，星形胶质细胞活力和增殖随着MK-7浓度的增加而增强。

2.MK-7可降低缺氧星形胶质细胞的形态学改变

为了证实MK-7在低氧条件下促进星形胶质细胞活力和增殖的作用，用倒置显微镜观察星形胶质细胞的形态学改变。

如图所示(图1H)，在常氧条件下，星形胶质细胞呈扁平状和多边形；并且，MK-7预处理并没有引起星形胶质细胞形态学发生明显改变。但缺氧处理12h后，部分细胞破碎漂浮，部分细胞圆形肿胀。然而，在低氧条件下，MK-7预处理的星形胶质细胞的形态学改变明显减少，贴壁星形胶质细胞的数量显著增加。

实施例2

MK-7可以减轻缺氧引起的星形胶质细胞氧化应激

为了检测缺氧诱导的星形胶质细胞活力和增殖是否与细胞内氧化应激有关，在本实施例中，在MK-7预处理存在或不存在的低氧条件下，采用二乙酸酯(DCFDA)或二氢乙锭(DHE)测定星形胶质细胞产生ROS的水平。

细胞内ROS首先用DCFDA细胞ROS检测试剂盒(ABCAM，剑桥，MA，美国)测定。DCFDA是一种荧光探针，可以测量ROS，如过氧化氢、过氧亚硝酸盐和过氧自由基。将细胞种在96孔板上，在不同时间间隔(4、6、8和12h)的常氧或低氧条件下，在多个MK-7(10、50、100和150μM)存在或不存在预处理的情况下培养。随后用DCFDA染色星形胶质细胞45min。每孔的荧光检测使用多功能酶标仪，激发/发射在485nm/535nm。

用共聚焦显微镜(Leica，Wetzlar，德国)检测细胞内的ROS水平。DHE(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO，美国)是一种红色荧光探针，通常用作超氧物探针。星形胶质细胞在150μM MK-7的预处理存在或不存在的情况下孵育30h，并在常氧或低氧条件下维持12h。随后，细胞在37℃的黑暗加湿室中用50μM DHE维持30分钟，然后用冷PBS洗涤四次。细胞图像立即用共聚焦显微镜在488nm激发和600nm发射下拍摄。

结果表明，缺氧刺激导致星形胶质细胞ROS生成显著增强，并且在常氧条件下，MK-7预处理对ROS生成没有影响。但是，MK-7预处理后，缺氧刺激的星形胶质细胞的ROS水平明显低于未预处理的低氧细胞(图2A和C，p<0.05)。此外，MK-7对缺氧星形胶质细胞ROS生成的抑制作用是剂量依赖性的(图2B，p<0.05)。

以上结果表明，MK-7可以通过减少细胞内ROS的生成，进而促进星形胶质细胞在低氧条件下的存活和增殖，从而保护星形胶质细胞免受氧化应激。

实施例3

MK-7缓解缺氧诱导的星形胶质细胞线粒体损伤

线粒体是产生ROS的主要细胞器，其在支持细胞正常功能方面起着重要作用；然而，过量的ROS会损伤线粒体。为了探讨MK-7是否能调节缺氧星形胶质细胞的线粒体功能，本实施例检测了用ATP法测定经MK-7预处理的缺氧星形胶质细胞内ATP水平。使用多功能酶标仪和ATP分析试剂盒(ABCAM)评估每个实验条件下的ATP含量。用10、50、100或150μM MK-7预处理星形胶质细胞30h，然后用缺氧刺激12h，收集细胞，并在100μL ATP测定缓冲液中再悬浮。样品在4℃中以13000r pm离心5min收集上清，然后将样品和标准品加入到96孔板中。将反应混合物加入到每孔中，并保持30min。采用多功能酶标仪在570nm处检测样品和标准的吸光度。

如图3A和C所示，缺氧显著抑制了ATP的产生；但是，MK-7可以明显提高缺氧星形胶质细胞ATP的生成，并且其作用是剂量依赖性的。上述结果表明，MK-7的保护作用可能与调节缺氧星形胶质细胞线粒体功能有关。图3B所示，在常氧条件下，MK-7预处理对ATP生成没有影响。

实施例4

MK-7减轻了缺氧星形胶质细胞的炎症反应

在缺氧诱导的星形胶质细胞中，在MK-7预处理存在或不存在的情况下，测定细胞内白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CC-趋化因子配体2(CCL2)和CXC-趋化因子配体10(CXCL10)以及维生素K依赖性蛋白生长停滞特异性6(Gas6)的水平。

用50、100或150μM MK-7预处理星形胶质细胞30h，在常氧或低氧条件下培养12h，然后用定量实时聚合酶链反应分析检测IL-6、TNF-a、Ccl2和Cxcl10水平。

缺氧可引起炎症改变，氧化应激是炎症反应的重要机制。同时，线粒体在炎症的发生和发展中起着至关重要的作用。为了确定MK-7是否参与调节缺氧性星形胶质细胞的炎症反应，本实施例用不同浓度的MK-7对星形胶质细胞进行预处理，然后在低氧条件下进行培养。结果表明，缺氧能显著提高促炎细胞因子和趋化因子的水平，而MK-7预处理剂量依赖性地降低了IL-6、TNF-a、CC-趋化因子配体2(CCL2)和CXC-趋化因子配体10(CXCL10)的上调(图4，p<0.05)。这些数据表明，MK-7预处理可明显降低缺氧星形细胞的炎症反应，从而保护星形胶质细胞。

实施例5

MK-7通过促进Gas6的表达，减少线粒体损伤和炎症反应

Gas6是一种维生素K依赖蛋白，参与多种影响细胞存活、增殖、粘附和趋化的细胞过程。Gas6也能减轻炎症并影响线粒体功能。为了进一步研究MK-7在缺氧条件下保护星形胶质细胞的潜在机制，在MK-7预处理存在或不存在的情况下，分析了Gas6水平。用OBIO生物技术(上海，中国)设计和合成了Gas6siRNA。

其中Gas6的siRNA序列为：

si-1forward CAAGAGCUCCAAUAATT(SEQ ID NO.1)，

reverse UAUAUCUGGCAGCUCUGTT(SEQ ID NO.2)；

si-2forward GCAAACGAUCUCUGUGAATT(SEQ ID NO.3)，

reverse UUCCACAGAGAUCGUUGCTT(SEQ ID NO.4)。

在用RT-PCR证实这两种siRNA的敲除效率后，利用更有效的siRNA来沉默星形胶质细胞中Gas6的表达。用Lipofectamine2000试剂(ThermoFisher)将Gas6-siRNA或阴性对照siRNA转染星形胶质细胞。转染48h后，收集星形胶质细胞并用于进一步分析。

如图5A和B所示，缺氧显著降低了Gas6的mRNA和蛋白表达，而MK-7预处理显著逆转了星形胶质细胞中Gas6的水平。结果表明，Gas6可能参与MK-7对缺氧星形胶质细胞的保护作用。

为了进一步证实，在本实施中使用siRNAs沉默Gas6的表达，并使用效果更好的siRNA进行后续实验(图6A和B，p<0.05)。如图6C所示，Gas6的敲除可抑制MK-7对缺氧星形胶质细胞的保护作用。在si-Gas6条件下，测定了MK-7预处理的缺氧星形胶质细胞内ROS、IL-6和ATP水平(图6D，E和F，p<0.05)。结果表明，MK-7治疗可部分恢复缺氧星形胶质细胞中ROS、IL-6和ATP的水平，但Gas6沉默逆转了这一作用。综上所述，Gas6的敲除可以抑制MK-7对缺氧星形胶质细胞的保护作用，并且MK-7的保护作用与调节Gas6的表达有关。

通过以上研究发现：缺氧可显著降低星形胶质细胞的活力和增殖，而MK-7预处理可显著逆转此情况。MK-7还能抑制缺氧诱导的ROS生成，并增强缺氧星形胶质细胞的ATP生成。MK-7预处理可有效降低缺氧性星形胶质细胞中IL-6、TNF-α、CCL2和CXCL10的表达，但增强了Gas6的表达。Gas6的沉默可显著抑制MK-7诱导的ROS水平和IL-6表达的下降，减弱MK-7诱导的缺氧星形胶质细胞活力和ATP生成。

本发明证明了MK-7可通过抑制线粒体功能障碍和促炎细胞因子的表达，保护星形胶质细胞免受缺氧诱导的细胞毒性作用。Gas6也可能参与这些保护作用。为临床上防治缺氧/缺血性脑损伤和MK-7更广泛地应用提供理论支持。

序列表

<110> 南通大学

<120> 甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血脑损伤疾病药物中的应用

<130> 20200907

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caagagcucc aauaatt 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

uauaucuggc agcucugtt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaaacgauc ucugugaatt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

uuccacagag aucguugctt 20

Claims (3)

1.甲基萘醌-7在制备防治缺氧/缺血性脑损伤疾病的药物中的应用。

2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：甲基萘醌-7可以保护缺氧诱导的星形胶质细胞损伤，从而用于制备防治缺氧/缺血性脑损伤疾病的药物。

3.一种防治缺氧/缺血性脑损伤疾病的药物，其特征在于：包括甲基萘醌-7。

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