CN111905109A - 输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法 - Google Patents

输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明适用于癌症治疗技术领域，提供了输运载体pHLIP‑PEI‑PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，通过首先合成pHLIP‑PEI‑PLA共聚物，测定pHLIP‑PEI‑PLA共聚物对siRNA的络合能力，检测pHLIP‑PEI‑PLA@siRNA复合物的血清稳定性；制备pHLIP‑PEI‑PLA@siRNA复合物，观察细胞对FITC‑pHLIP‑PEI‑PLA@siRNA复合物的摄取情况，最后通过流式细胞术分析细胞对pHLIP‑PEI‑PLA@siRNA复合物的摄取情况，从而为研究pHLIP‑PEI‑PLA共聚物将siRNA递送至肿瘤细胞的效率以及siRNA在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。

Description

输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的 研究方法
技术领域
本发明属于癌症治疗研究技术领域，尤其涉及输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法。
背景技术
自RNA干扰技术(RNAi)发现以来，基于siRNA的药物研究取得了不错的进展，为癌症的基因治疗提供了新思路。然而，裸露的siRNA稳定性差、容易被血清中的核酶降解、血液半衰期短、转染效率低。传统的基因递送系统肿瘤靶向效率低，且不能快速有效地逃逸内涵体，严重限制了siRNA在肿瘤治疗中的应用。聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有出色转染效果的金标准聚合物，但其严重的细胞毒性和不可降解性阻碍了其作为基因传递载体的治疗应用。
发明内容
本发明提供输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，旨在为siRNA在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。
本发明是这样实现的，输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，包括以下步骤：
S1、合成pHLIP-PEI-PLA共聚物；
S2、测定pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力；
S3、制备pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物，检测pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性；
S4、观察细胞对FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况；
S5、通过流式细胞术分析细胞对pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况。
优选的，所述合成pHLIP-PEI-PLA共聚物，具体包括以下步骤：
1)将50mg PEI-PLA溶于5mL DMSO中；
2)将10mg Sulfo-SMCC溶解于1mL DMSO中；
3)步骤2)中的溶液缓慢滴加至步骤1)的溶液中，室温下磁力搅拌4h；
4)反应结束，将混合溶液转移至8000–14000Da透析袋中，去离子水透析24h后，冷冻干燥透析液获得马来酰亚胺功能化的Mal-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验；
5)将得到的Mal-PEI-PLA共聚物全部溶解在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中；
6)避光条件下将10mg FITC-pHLIP溶解于乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中；
7)将步骤5)和步骤6)的溶液混合，置于棕色玻璃瓶中磁力搅拌16h；
8)将反应溶液转移至透析袋(截留分子量8000–14000Da)中，在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中透析4h，再转入去离子水中透析24h；
9)透析液冷冻干燥得到pHLIP-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验。
优选的，所述测定pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力，具体包括以下步骤：
使用1％琼脂糖凝胶电泳来评估pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力，将不同体积的100μg/mLpHLIP-PEI-PLA共聚物溶液与5μM siRNA溶液以不同的N/P比混合，N/P比分别为0.5、1、2、3、5、7.5、10、12.5和20；
室温下孵育30min以制备pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物，再用ddH2O稀释至终体积10μL，加入2μLLoadingbuffer在TBE缓冲液中用含有GelRed的1％琼脂糖凝胶电泳分析所有样品，并通过凝胶成像仪来观察pHLIP-PEI-PLA对siRNA迁移的阻滞作用。
优选的，所述检测pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性，具体为：
将游离siRNA和现络合的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物分别与10％或50％血清在37℃下孵育不同的时间，分别为0.5、1、2、4、8、12、24、48和72h；并立即与2μL含有或不含有1％SDS的Loadingbuffer混合。将上述溶液通过含有GelRed的1％琼脂糖凝胶在TBE缓冲液中恒压90V电泳35min，在凝胶成像仪下观察siRNA条带。
优选的，所述观察细胞对FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况，具体为：
1)在12孔板中铺上盖玻片，将HCT116和HepG2细胞接种于12孔板的盖玻片上，置于细胞培养箱过夜培养，此时细胞培养液中不含抗生素；
2)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与24.5μL 100μg/mL FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mLpH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siPKM2终浓度为50nM的pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物溶液；
3)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与20.3μL 100μg/mLPEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mLpH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siRNA终浓度为50nM的PEI-PLA@siPKM2复合物溶液；
4)将12孔板中的细胞和含上述FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物或PEI-PLA@siPKM2复合物的pH为7.4或6.5的溶液于37℃共培养12h；
5)培养结束，在避光条件下用PBS溶液缓慢清洗细胞3次后，室温下用4％多聚甲醛固定30min；
6)PBS溶液洗去4％多聚甲醛固定液后，室温下DAPI染色10min，用PBS溶液洗去DAPI染液；
7)在载玻片上滴加抗荧光衰减封片剂，将孔板中的盖玻片轻轻取出置于载玻片上，在其周围滴加固定液，室温静置后使用60倍DeltaVision细胞成像仪观察，全程避光操作。
优选的，所述通过流式细胞术分析细胞对pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况，具体为：
使用pHLIP-PEI-PLA@siRNA、PEI-PLA@siRNA复合物在pH 7.4或6.5条件下处理HepG2细胞12h，收集细胞，用PBS溶液洗涤2次，通过流式细胞仪分析HepG2细胞中Cy5的荧光强度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成方法简便易行，产率较高，pHLIP多肽和生物相容性高分子PLA的引入可大大降低PEI本身的细胞毒性，同时保留了PEI出色的siRNA络合能力；pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物明显改善了siRNA的血清稳定性，并且在弱酸性条件下可通过形成跨膜α螺旋将siRNA直接递送至肿瘤细胞内，该过程不依赖于受体结合或内吞作用，避免了内涵体捕获，无需逃逸内涵体，可实现siRNA向肿瘤细胞的高效递送，降低脱靶毒性，为肿瘤的精准靶向治疗提供了一种新思路。
附图说明
图1为本发明的pHLIP-PEI-PLA共聚物的合成路线图。
图2为本发明的PEI-PLA共聚物以及pHLIP-PEI-PLA共聚物的GPC色谱图。
图3为本发明的PEI-PLA共聚物、FITC-pHLIP和FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物的紫外可见光谱图。
图4为本发明的不同N/P条件下pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳图。
图5为本发明的用10％(a)和50％(b)血清孵育不同时间后，游离siRNA和pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的琼脂糖凝胶电泳分析。
图6为本发明的在pH 7.4或6.5条件下HCT116(a)和HepG2(b)细胞与PEI-PLA@siPKM2复合物或FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物的处理12h后用DeltaVision观察结果图。
图7为本发明的流式细胞术分析结果图。
图8为本发明的pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物构建过程示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种技术方案：输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，包括以下步骤：
S1、准备试剂：1640液体培养液、无支原体胎牛血清、低pH插入肽pHLIP和FITC标记的低pH插入肽(FITC-pHLIP)、4％多聚甲醛固定液、抗荧光衰减封片剂、DMSO、胰酶、青链霉素混合物、靶向PKM2的siRNA：5'-CCAUAAUCGUCCUCACCAA-3'、阴性对照siRNA、Cy5标记的靶向PKM2的siRNA。
其中，人结肠癌细胞株HCT116和人肝癌细胞株HepG2均购自中科院上海细胞库。1640液体培养液购自Hyclone公司。无支原体胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司。低pH插入肽(pHLIP)和FITC标记的低pH插入肽(FITC-pHLIP)(纯度>98％)由上海楚肽生物科技有限公司合成。4％多聚甲醛固定液、抗荧光衰减封片剂、DMSO、胰酶、青链霉素混合物均购自北京索莱宝科技有限公司。靶向PKM2的siRNA(siPKM2)：5'-CCAUAAUCGUCCUCACCAA-3'以及阴性对照siRNA(siNC)通过上海生工生物工程股份有限公司合成。Cy5标记的靶向PKM2的siRNA由上海吉玛制药技术有限公司提供。
S2、配置1×TBE：取11.0g硼酸、21.6gTris、1.49g EDTA-2Na，用去离子水定容至2L。
配置1％核酸胶：取0.25g Agar、1×TBE 25mL、1μLGelRed核酸染料混合。
配置1640细胞培养液：取20mL胎牛血清、2mL青链霉素混合物、180mL无血清1640培养液并混合。
配置0.25％胰蛋白酶：取0.02g EDTA、0.25g胰蛋白酶、100mLPBS并混合。
S3、合成pHLIP-PEI-PLA共聚物：
1)将50mg PEI-PLA溶于5mL DMSO中。
2)将10mg Sulfo-SMCC溶解于1mL DMSO中。
3)步骤2)中的溶液缓慢滴加至步骤1)的溶液中，室温下磁力搅拌4h。
4)反应结束，将混合溶液转移至8000–14000Da透析袋中，去离子水透析24h后，冷冻干燥透析液获得马来酰亚胺功能化的Mal-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验。
5)将得到的Mal-PEI-PLA共聚物全部溶解在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中。
6)避光条件下将10mg FITC-pHLIP溶解于乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中。
7)将步骤5)和步骤6)的溶液混合，置于棕色玻璃瓶中磁力搅拌16h。
8)将反应溶液转移至透析袋(截留分子量8000–14000Da)中，在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中透析4h，再转入去离子水中透析24h。
9)透析液冷冻干燥得到pHLIP-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验。
如图1所示，我们以Sulfo-SMCC为交联剂与PEI-PLA共聚物上的PEI的氨基反应得到马来酰亚胺功能化的Mal-PEI-PLA共聚物，再将低pH插入肽(pHLIP)C端的巯基与Mal-PEI-PLA共聚物的马来酰亚胺基团通过迈克尔加成反应得到pHLIP-PEI-PLA共聚物。
通过GPC以及紫外可见光谱(UV-Vis spectrum)对合成的pHLIP-PEI-PLA共聚物进行了表征。如表1和图2所示，pHLIP-PEI-PLA共聚物经GPC检测其分子量为26262Da，PDI为2.216，为单峰型分子量分布的聚合物。洗脱时，pHLIP-PEI-PLA在凝胶柱中的保留时间为8.08min，PEI-PLA共聚物保留时间为8.17min，这一结果说明pHLIP成功连接到PEI-PLA上，使其分子量略微增大。
表1：GPC测定PEI-PLA共聚物以及pHLIP-PEI-PLA共聚物的分子量、PDI和保留时间。
Figure BDA0002636486660000071
接下来，将FITC-pHLIP溶解在乙腈和水的混合溶剂(V/V＝1:1)中，PEI-PLA共聚物和FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物溶解于水中，进行紫外可见光谱(UV-Vis spectrum)扫描。
如图3所示，PEI-PLA共聚物的UV-Vis光谱中未见明显的吸收峰，而在FITC-pHLIP的光谱中，在280nm处有一强烈的吸收峰，该峰来自于多肽，但我们未观察到来自FITC的强吸收峰(495nm左右)。由于FITC-pHLIP不溶于水，我们采用了乙腈与水的混合溶剂来溶解该多肽，可能是混合溶剂会淬灭FITC的荧光，导致其特征吸收峰消失。在FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物的光谱中，除了在280nm处检测到多肽的特征吸收峰外，还在500nm左右处观察到一个强的吸收峰，该峰来自FITC，表明用水作为溶剂不会淬灭FITC的荧光。以上结果表明，我们成功合成了具备良好水溶性的FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物，PEI-PLA共聚物的引入改善了多肽的水溶性。
S4、测定pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力：
使用1％琼脂糖凝胶电泳来评估pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力，将不同体积的100μg/mL pHLIP-PEI-PLA共聚物溶液与5μM siRNA溶液以不同的N/P比混合，N/P比分别为0.5、1、2、3、5、7.5、10、12.5和20。室温下孵育30min以制备pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物，再用ddH2O稀释至终体积10μL，加入2μL Loading buffer在TBE缓冲液中用含有GelRed的1％琼脂糖凝胶电泳分析所有样品，并通过凝胶成像仪来观察pHLIP-PEI-PLA对siRNA迁移的阻滞作用。如图4所示，当N/P比大于7.5时，pHLIP-PEI-PLA共聚物与siRNA完全络合，这一结果也与PEI-PLA与siRNA的络合实验结果一致。因此，在本实施方式中，使用N/P比为10的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物来进行下面的研究。
S5、检测pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性。
我们采用N/P比为10的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物用于血清稳定性研究。将游离siRNA和现络合的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物分别与10％或50％血清在37℃下孵育不同的时间，分别为0.5、1、2、4、8、12、24、48和72h。并立即与2μL含有或不含有1％SDS的Loadingbuffer混合。将上述溶液通过含有GelRed的1％琼脂糖凝胶在TBE缓冲液中恒压90V电泳35min，在凝胶成像仪下观察siRNA条带。
如图5a所示，在10％血清中，4h后游离siRNA就会被降解，72h后仍可观察到pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的siRNA条带。当与50％血清孵育时，2h后不再能观察到游离siRNA的条带，而来自pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的siRNA条带在12h时仍可以检测到，如图5b所示。这些结果表明，pHLIP-PEI-PLA@siRNA可以保护siRNA不受血清中核酸酶的降解，pHLIP-PEI-PLA共聚物递送系统可以提高siRNA的血清稳定性。
S6、观察细胞对FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况。
1)在12孔板中铺上盖玻片，将HCT116和HepG2细胞接种于12孔板的盖玻片上，置于细胞培养箱过夜培养，此时细胞培养液中不含抗生素。
2)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与24.5μL 100μg/mL FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mLpH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siPKM2终浓度为50nM的pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物溶液。
3)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与20.3μL 100μg/mL PEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mL pH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siRNA终浓度为50nM的PEI-PLA@siPKM2复合物溶液。
4)将12孔板中的细胞和含上述FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物或PEI-PLA@siPKM2复合物的pH为7.4或6.5的溶液于37℃共培养12h。
5)培养结束，在避光条件下用PBS溶液缓慢清洗细胞3次后，室温下用4％多聚甲醛固定30min。
6)PBS溶液洗去4％多聚甲醛固定液后，室温下DAPI染色10min，用PBS溶液洗去DAPI染液。
7)在载玻片上滴加抗荧光衰减封片剂，将孔板中的盖玻片轻轻取出置于载玻片上，在其周围滴加固定液，室温静置后使用60倍DeltaVision细胞成像仪观察，全程避光操作。
低pH插入肽(pHLIP)是一种酸度敏感多肽，在弱酸性环境中，pHLIP可以在细胞膜上形成稳定的跨膜α螺旋，将其C端插入细胞膜内。因此，我们分别在中性(pH 7.4)和弱酸性(pH 6.5)条件下中检测了FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物的细胞内化行为。HCT116和HepG2细胞经PEI-PLA@siRNA或FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA在两种pH条件下分别处理后通过60倍DeltaVision细胞成像仪观察。细胞核使用DAPI染色，呈蓝色荧光；FITC标记的pHLIP呈现绿色荧光；siPKM2由Cy5标记，呈现红色荧光。在pH 7.4和6.5条件下，PEI-PLA@siPKM2复合物与HCT116和HepG2细胞孵育后，在细胞质中的红色荧光信号强度基本相当，表明PEI-PLA@siPKM2对siRNA的递送效率不受pH值的影响(图6a和b)。对于FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA处理组，在pH 7.4条件下，两种细胞中的绿色荧光信号相对较弱，来自Cy5-PKM2的红色荧光强度与PEI-PLA@siPKM2处理组接近，如图6a和b所示。但在pH 6.5条件下，经FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2处理后，HCT116和HepG2细胞中的红色荧光强度显著高于pH 7.4条件下的同处理组和两种pH条件下的PEI-PLA@siPKM2处理组，绿色荧光强度明显高于pH 7.4条件下的同处理组，如图6a和b所示。这些结果表明，在弱酸性条件下，FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物表面的pHLIP可以通过形成跨膜α螺旋与细胞膜结合，将siPKM2高效递送至细胞内。
S7、通过流式细胞术分析细胞对pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况：
使用pHLIP-PEI-PLA@siRNA、PEI-PLA@siRNA复合物在pH 7.4或6.5条件下处理HepG2细胞12h，收集细胞，用PBS溶液洗涤2次，通过流式细胞仪分析HepG2细胞中Cy5的荧光强度。如图7所示，两种复合物PEI-PLA@siPKM2和pHLIP-PEI-PLA@siPKM2处理组中Cy5荧光强度均显著强于游离siPKM2处理组，表明共聚物络合siPKM2后可显著提高其转染效率。在两种pH条件下，PEI-PLA@siPKM2处理组中的荧光强度无显著差异。中性条件(pH 7.4)下，pHLIP-PEI-PLA@siPKM2处理组细胞中的荧光强度与PEI-PLA@siPKM2处理组接近。而在pH6.5条件下，pHLIP-PEI-PLA@siPKM2处理HepG2细胞12h后，细胞内Cy5荧光强度显著增加。如图7b所示，定量分析结果表明，在两种pH条件下，PEI-PLA@siPKM2处理组中的荧光强度无显著差异。中性条件(pH 7.4)下pHLIP-PEI-PLA@siPKM2处理组与pH 6.5条件下PEI-PLA@siPKM2处理组的荧光强度也无显著差异。与pH 7.4条件下的pHLIP-PEI-PLA@siRNA处理组相比，弱酸性条件下(pH 6.5)pHLIP-PEI-PLA@siRNA处理HepG2细胞后，细胞内的Cy5荧光强度增加了3倍，这与DeltaVision细胞成像仪检测细胞内化的结果一致。这些结果表明，pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物在弱酸性条件下可显著提高siRNA的递送效率。
低pH插入肽(pH low insertion peptide,pHLIP)是一种pH依赖的具有跨膜活性的多肽，在弱酸性条件下，pHLIP可作为一种生物纳米注射器，将连接在其碳端的不能进入细胞膜的物质靶向递送至肿瘤细胞内。如图8所示，将pHLIP与PEI-PLA共聚物连接，合成得到pHLIP-PEI-PLA共聚物。GPC和紫外可见光谱分析表明我们成功合成了pHLIP-PEI-PLA共聚物。利用其与针对PKM2的siRNA络合得到pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物。凝胶阻滞实验表明：当N/P比大于7.5时，pHLIP-PEI-PLA共聚物可以与siRNA完全络合。因此，使用N/P比为10的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物用于后续实验。此外，通过血清稳定性实验检测了pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物的稳定性，结果表明pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物在10％和50％血清中可以分别稳定保护siRNA72 h和12h不受血清中核酸酶的降解。与PEI-PLA@siRNA复合物相比，pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性有所提高，这说明pHLIP的连接可以进一步提高siRNA递送系统的血清稳定性。DeltaVision Elite高分辨率细胞成像系统和流式细胞仪分析表明：在pH 6.5条件下，pHLIP-PEI-PLA共聚物可以显著提高siPKM2的递送效率。
本研究合成的pHLIP-PEI-PLA共聚物有望被开发为多功能载体，为新型纳米药物设计和恶性肿瘤的高效靶向治疗提供新策略。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、合成pHLIP-PEI-PLA共聚物；
S2、测定pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力；
S3、制备pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物，检测pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性；
S4、观察细胞对FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况；
S5、通过流式细胞术分析细胞对pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况。
2.如权利要求1所述的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：所述合成pHLIP-PEI-PLA共聚物，具体包括以下步骤：
1)将50mg PEI-PLA溶于5mL DMSO中；
2)将10mg Sulfo-SMCC溶解于1mL DMSO中；
3)步骤2)中的溶液缓慢滴加至步骤1)的溶液中，室温下磁力搅拌4h；
4)反应结束，将混合溶液转移至8000–14000Da透析袋中，去离子水透析24h后，冷冻干燥透析液获得马来酰亚胺功能化的Mal-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验；
5)将得到的Mal-PEI-PLA共聚物全部溶解在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中；
6)避光条件下将10mg FITC-pHLIP溶解于乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中；
7)将步骤5)和步骤6)的溶液混合，置于棕色玻璃瓶中磁力搅拌16h；
8)将反应溶液转移至透析袋(截留分子量8000–14000Da)中，在乙腈和水的混合溶液(V/V＝1:1)中透析4h，再转入去离子水中透析24h；
9)透析液冷冻干燥得到pHLIP-PEI-PLA共聚物，称重并置于-20℃保存或进行后续试验。
3.如权利要求2所述的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：所述测定pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力，具体包括以下步骤：
使用1％琼脂糖凝胶电泳来评估pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的络合能力，将不同体积的100μg/mL pHLIP-PEI-PLA共聚物溶液与5μM siRNA溶液以不同的N/P比混合，N/P比分别为0.5、1、2、3、5、7.5、10、12.5和20；
室温下孵育30min以制备pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物，再用ddH2O稀释至终体积10μL，加入2μL Loadingbuffer在TBE缓冲液中用含有GelRed的1％琼脂糖凝胶电泳分析所有样品，并通过凝胶成像仪来观察pHLIP-PEI-PLA对siRNA迁移的阻滞作用。
4.如权利要求3所述的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：所述检测pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的血清稳定性，具体为：
将游离siRNA和现络合的pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物分别与10％或50％血清在37℃下孵育不同的时间，分别为0.5、1、2、4、8、12、24、48和72h；并立即与2μL含有或不含有1％SDS的Loading buffer混合。将上述溶液通过含有GelRed的1％琼脂糖凝胶在TBE缓冲液中恒压90V电泳35min，在凝胶成像仪下观察siRNA条带。
5.如权利要求4所述的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：所述观察细胞对FITC-pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况，具体为：
1)在12孔板中铺上盖玻片，将HCT116和HepG2细胞接种于12孔板的盖玻片上，置于细胞培养箱过夜培养，此时细胞培养液中不含抗生素；
2)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与24.5μL 100μg/mL FITC-pHLIP-PEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mLpH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siPKM2终浓度为50nM的pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物溶液；
3)将10μL 5μM Cy5标记的siPKM2溶液与20.3μL 100μg/mL PEI-PLA共聚物溶液在室温下避光孵育30min，再加入1mL pH 7.4或6.5无抗生素新鲜培养液，制备成Cy5-siRNA终浓度为50nM的PEI-PLA@siPKM2复合物溶液；
4)将12孔板中的细胞和含上述FITC-pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物或PEI-PLA@siPKM2复合物的pH为7.4或6.5的溶液于37℃共培养12h；
5)培养结束，在避光条件下用PBS溶液缓慢清洗细胞3次后，室温下用4％多聚甲醛固定30min；
6)PBS溶液洗去4％多聚甲醛固定液后，室温下DAPI染色10min，用PBS溶液洗去DAPI染液；
7)在载玻片上滴加抗荧光衰减封片剂，将孔板中的盖玻片轻轻取出置于载玻片上，在其周围滴加固定液，室温静置后使用60倍DeltaVision细胞成像仪观察，全程避光操作。
6.如权利要求5所述的输运载体pHLIP-PEI-PLA的合成、表征及其对siRNA的递送的研究方法，其特征在于：所述通过流式细胞术分析细胞对pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物的摄取情况，具体为：
使用pHLIP-PEI-PLA@siRNA、PEI-PLA@siRNA复合物在pH 7.4或6.5条件下处理HepG2细胞12h，收集细胞，用PBS溶液洗涤2次，通过流式细胞仪分析HepG2细胞中Cy5的荧光强度。
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