CN111904958B - Umi-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用 - Google Patents

Umi-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种UMI‑77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。本发明提出了MCL1抑制剂UMI‑77对线粒体自噬的诱导作用，通过对急性肝炎，炎症性肠病和APP/PS1小鼠模型中的效果来看，UMI‑77对炎症有显著的抑制效果，对阿尔兹海默症有显著缓解效果。

Description

UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性 疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于炎症治疗技术领域，具体地说，涉及一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。
背景技术
线粒体自噬在炎症的抑制过程中发挥重要作用，而炎症是机体对抗感染的基本策略，同时也是导致疾病加重的主要原因，如某些神经退行性疾病，阿尔兹海默症。因此，筛选新的安全有效的线粒体自噬诱导剂是可能的抑制炎症，缓解疾病的治疗策略。现有的线粒体自噬诱导剂主要原理为破坏线粒体的功能，使细胞被迫发生线粒体自噬。虽然可以诱导线粒体自噬，但由于具有较大的毒性，并不能在临床应用中发挥作用。
目前并没有发现MCL1抑制剂可以作为线粒体自噬诱导剂，也没有以线粒体自噬诱导剂或者MCL1蛋白抑制剂为靶点的药物治疗炎症和阿尔兹海默症。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症和神经退行性疾病药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种UMI-77作为线粒体自噬诱导剂在制备治疗炎症及神经退行性疾病药物中的应用。
可选地，UMI-77诱导线粒体进入溶酶体发生线粒体自噬。
可选地，炎症为急性肝炎或者炎症性肠病。
可选地，神经退行性疾病为阿尔兹海默症。
本发明还公开了一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株，该细胞株于2019年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:C201940。
本发明还公开了一种人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株的构建方法，包括以下步骤：
1)慢病毒质粒准备：mtkeima序列合成后通过酶切连接方法，连入慢病毒质粒pCDH中形成pCDH-mtkeima，抽提无内毒素的质粒pCDH-mtkeima，慢病毒包装质粒pMD2.0G和psPAX2；
2)慢病毒制备：HEK293T细胞以1*106个/ml密度种于15cm培养皿中，24小时后转染三个质粒pCDH-mtkeima，pMD2.0G和psPAX2，每个质粒10μg；分别在转染后48小时和72小时，收集上清，合并上清并用0.45μm滤膜过滤，以每30ml过滤上清加入7.5ml病毒浓缩溶液的比例，加入适量的浓缩溶液，混匀后，以每隔30分钟颠倒混匀3-5次，共进行4次；4℃放置过夜，第二天4000g，4℃离心20分钟，倒掉上清，用1mlPBS重悬病毒沉淀，-80℃保存；
3)慢病毒感染：HEK293T细胞以5*105个/ml种于10cm培养皿中，24小时后，将制作好的慢病毒从-80℃中取出，充分溶解后滴入细胞培养物中，48小时后观察感染率，感染率大于90％评价为合格，向合格的感染细胞培养物中加入1μg/ml的嘌呤霉素清除未感染的细胞，2-3天后换液传代细胞，扩大培养，冻存细胞，得到人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明通过建立线粒体自噬的高通量筛选模型，通过mtkeima蛋白的特性，可以方便的指征线粒体自噬；筛选到可以温和诱导线粒体自噬的诱导剂UMI-77；UMI-77为MCL1蛋白的特异性抑制剂。
2)本发明MCL1抑制剂UMI-77对线粒体自噬的诱导作用，MCL1抑制剂UMI-77作为线粒体自噬诱导剂的新功能。同时MCL1抑制剂都可以作为线粒体自噬诱导剂的可能性。
3)本发明UMI-77对与炎症的显著抑制效果；通过对急性肝炎和炎症性肠病小鼠模型中的效果来看，UMI-77对炎症有显著的抑制效果。
4)本发明UMI-77对阿尔兹海默症的治疗效果显著；通过对APP/PS1小鼠模型中的效果来看，UMI-77对阿尔兹海默症有显著的改善效果。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明验证人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima系统是否可以指征线粒体自噬；
图2是本发明对2000多个FDA批准的药进行高通量筛选；颜色深浅代表586nm激发荧光与阴性对照对比的强弱；颜色越深代表线粒体自噬诱导越强；
图3是本发明33个阳性药物二次验证，柱形图代表线粒体自噬诱导程度高低，越高代表诱导越强；实线是阴性对照基准线，虚线是1.5倍上升线；
图4是本发明UMI-77诱导线粒体标记蛋白Tom20和Tim23降解；
图5是本发明UMI-77处理细胞免疫杂交(western blot)检测Caspase3的结果；
图6是本发明人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima系统在UMI-77处理下诱导线粒体自噬结果；图像为biotek cytation3拍摄,放大倍数4X；红色(EM586对应的上下两幅图)为mtkeima586nm激发荧光，代表发生线粒体自噬的线粒体。绿色(EM469对应的上下两幅图)为488nm激发荧光代表正常线粒体；
图7是本发明人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞用UMI-77处理后活细胞拍摄激光共聚焦图片观察线粒体和溶酶体共定位；
图8是本发明UMI-77处理HEK293T和Hela细胞导致的线粒体通过溶酶体发生降解；
图9是本发明透射电子显微镜检测UMI-77处理HEK293T细胞后线粒体的结果；
图10是本发明小鼠血液检测谷丙转氨酶和谷草转氨酶的活力测定结果，UMI-77抑制肝细胞破损；
图11是本发明HE(苏木精-伊红)染色小鼠肝脏切片显示UMI-77恢复肝细胞正常形态；
图12是本发明UMI-77诱导线粒体降解需要MCL1蛋白；
图13是本发明
Figure BDA0002055018550000041
In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit试剂盒(购自Sigma-Aldrich，#DUO92101)检测MCL1和LC3A相互作用；
图14是本发明免疫共沉淀实验显示UMI-77诱导LC3A和MCL1相互作用增强；
图15是本发明免疫共沉淀显示MCL1与LC3A相互作用通过LIR motif实现；
图16是本发明小鼠炎症性肠病模型及UMI77处理实验流程图；
图17是本发明小鼠体重统计结果，在DSS诱导小鼠炎症性肠病模型中，UMI77可以显著性减缓体重下降幅度，提示其可以保护炎症性肠病；
图18是本发明小鼠疾病活动指数统计结果，疾病活动指数基于体重变化、小鼠便血和粪便性状计算获得；
图19是本发明小鼠结直肠代表性图，小鼠结直肠长度统计结果；
图20是本发明小鼠结直肠HE染色图，小鼠结直肠组织病理评分；
图21是本发明小鼠结直肠组织中炎症因子表达水平；
图22是本发明定位巡航实验记录每组小鼠的逃避潜伏期；
图23是本发明空间搜索实验记录小鼠穿过原平台的次数；
图24是本发明空间搜索实验记录有代表性小鼠的运动轨迹。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1线粒体自噬的高通量筛选模型的建立：
本发明利用Keima荧光蛋白和线粒体定位序列融合成mtKeima蛋白，并以此构建人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株；构建步骤：1)慢病毒质粒准备：mtkeima序列跟据北京博尔迈生物技术有限公司(MBL BEIJING BIOTECH CO.,LTD)公司质粒pMitophagyKeima-Red mPark2(Hyg)中提供的MT-mKeima-Red序列全基因合成后通过酶切连接方法，连入慢病毒质粒pCDH中形成pCDH-mtkeima，抽提无内毒素的质粒pCDH-mtkeima，慢病毒包装质粒pMD2.0G和psPAX2。2)慢病毒制备：HEK293T细胞以1*106个/ml密度种于15cm培养皿中，24小时后转染三个质粒pCDH-mtkeima，pMD2.0G和psPAX2，每个质粒10μg。分别在转染后48小时和72小时，收集上清，合并上清并用0.45μm滤膜过滤，以每30ml过滤上清加入7.5ml病毒浓缩溶液的比例，加入适量的浓缩溶液，混匀后，以每隔30分钟颠倒混匀3-5次，共进行4次。4℃放置过夜。第二天4000g，4℃离心20分钟，倒掉上清，用1ml PBS(磷酸缓冲液)重悬病毒沉淀。-80℃保存。3)慢病毒感染：HEK293T细胞以5*105个/ml种于10cm培养皿中，24小时后，将制作好的慢病毒从负80度冰箱中取出，充分溶解后滴入细胞培养物中，48小时后观察感染率，感染率大于90％评价为合格。向合格的感染细胞培养物中加入1μg/ml的嘌呤霉素清除未感染的细胞，2-3天后换液传代细胞，扩大培养，冻存细胞，得到人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima稳定细胞株，其细胞株于2019年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201940。
利用keima蛋白在酸性条件下激发光为586nm，中性条件下激发光为440nm指征线粒体自噬的发生，并利用高通量成像系统biotek cytation3和软件分析，以(586nm阳性细胞数/440nm全细胞数)为指标进行高通量定量分析。
1、实验方法：人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞以1.5*105个/ml种于96孔黑色酶标板中，每孔种100μl，24小时后替换培养基为KH buffer和PBS，每个处理3个重复，于37℃，5％CO2培养条件下，处理4小时后，直接于biotek cytation3拍照。以469nm激发光做对焦通道，每孔拍摄4张图片，利用仪器软件处理图像。
如图1所示，KH buffer和PBS为阳性对照，可以诱导自噬(包括线粒体自噬)，KHbuffer(KH缓冲液)和PBS(磷酸缓冲液)处理细胞后，586nm激发的荧光明显上升，而NC(未作处理的)没有明显上升。
2、实验方法：人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞以1.5*105个/ml种于96孔黑色酶标板中，每孔种100μl。24小时后替换阳性对照孔培养基为KHbuffer和PBS，每个处理3个重复。用安捷伦bravo自动化液体处理平台高通量加入FDA批准的药物，每孔加入10μM的药物，于37℃，5％CO2培养条件下，处理6小时后，直接于biotek cytation3拍照。以469nm激发光做对焦通道，每孔拍摄4张图片，利用仪器软件处理图像。并以(586nm阳性细胞数/469nm全细胞数)为指标进行统计分析，Graphpad处理数据以热图展示。
如图2所示，对2000多个FDA批准的药进行高通量筛选，图像处理后，以(586nm阳性细胞数/440nm全细胞数)为指标进行统计分析，以热图方式展示。红色深浅代表586nm激发荧光与阴性对照对比的强弱。红色越强代表线粒体自噬诱导越强。
如图3所示，33个阳性药物二次验证，柱形图代表线粒体自噬诱导程度高低，越高代表诱导越强；多种不同的化合物都可以诱导线粒体自噬。UMI-77诱导效果位于中等偏上。
实施例2有效线粒体自噬诱导剂UMI-77的确证：
1、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml，Hela细胞和U2OS细胞以1.5*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml。每个细胞种6个孔。24小时后，分别在0小时，3小时，6小时，9小时加入UMI-77，终浓度为5μM。在12小时统一用250μl 2XSDS上样缓冲液收样。100℃加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(Tom20抗体购自Cell Signaling Technology，#42406S；Tim23抗体购自Proteintech，#11123-1-AP；Tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#M1305-2；Calnexin抗体购自Cell Signaling Technology，#2433S)以一定稀释比(Tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，PBST(磷酸盐缓冲液+0.1％Tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31430；Goatanti-Rabbit IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟。ECL显色。
如图4所示，免疫杂交(western blot)检测发现，UMI-77在HEK293T，Hela和U2OS细胞中以时间依赖的方式导致线粒体标记蛋白Tom20和Tim23降解，而不影响内质网标记蛋白Calnexin的降解。
2、实验方法：U2OS细胞以1.5*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml，5个孔。24小时后，分别在0小时，12小时，24小时，36小时加入UMI-77，终浓度为7.5μM。在48小时统一用250μl 2XSDS上样缓冲液收样。收样前3小时加入星形孢菌素终浓度1μM。100度加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体(Tom20抗体购自Cell Signaling Technology，#42406S；Caspase3抗体购自Cell SignalingTechnology，#9662；LC3B抗体购自Sigma-Aldrich，#L8918；LC3C抗体购自Proteintech，#18726-1-AP；Tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#M1305-2)以一定稀释比(Tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，PBST洗涤3遍每次10min。二抗(Goatanti-Mouse IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31430；Goat anti-RabbitIgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟。ECL显色。
如图5所示，免疫杂交(western blot)检测发现，UMI-77在U2OS细胞中并没有诱导细胞凋亡关键蛋白Caspase3的激活。STS为星形孢菌素(Staurosporine)，是一种细胞凋亡诱导剂，在本实验中作为阳性对照。
3、实验方法：人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞以1.5*105个/ml种于96孔黑色酶标板中，每孔100μl；24小时后加入UMI-77终浓度10μM，设置3个重复；于37度，5％CO2培养条件下，处理6小时后，直接于biotek cytation3拍照。以469nm激发光做对焦通道，每孔拍摄4张图片，利用仪器软件处理图像。
如图6所示，验证人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima系统是否可以在UMI-77处理下诱导586nm激发荧光上升。UMI-77处理人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞后，586nm激发的荧光明显上升，而NC(未作处理的)没有明显上升，因此，UMI-77可以诱导线粒体进入溶酶体发生线粒体自噬。
4、实验方法：人胚肾转化细胞HEK293Tmtkeima细胞以1.5*105个/ml种于活细胞专用培养皿中，每皿2ml。24小时后用LysoGreen(溶酶体特异探针)(1000X)染色30分钟，替换新鲜培养基后，加入UMI-77，终浓度10μM，30分钟后置于Zesis LSM 880with AiryScan激光共聚焦显微镜下活细胞培养，并连续拍摄1小时，每隔30秒拍一张照片。取240秒到450秒照片呈现。
如图7所示，加入UMI-77处理后线粒体被溶酶体包裹，发生共定位；没有处理的细胞没有任何共定位。
5、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml，5个孔。Hela细胞以1.5*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml，5个孔。24小时后，加入UMI-77，终浓度为5μM，处理24小时，在收样前12小时加入MG132 2μM，E64D2μM和氯化铵20mM，Leupeptin(亮抑蛋白酶肽)50μM。在24小时统一用250μl 2XSDS上样缓冲液收样。100度加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶封闭1h，抗体(Tom20抗体购自Cell Signaling Technology，#42406S；Tim23抗体购自Proteintech，#11123-1-AP；Tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#M1305-2)以一定稀释比(Tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，PBST洗涤3遍每次10min。二抗(Goatanti-Mouse IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31430；Goat anti-RabbitIgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟，ECL显色。
如图8所示，加入溶酶体抑制剂后阻止了UMI-77介导的线粒体标记蛋白降解，而蛋白酶体抑制剂MG132并没有阻止。
6、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml，5个孔。24小时后，加入UMI-77，终浓度为5μM，处理24小时，在收样前12小时加入E64D2μM和氯化铵20mM，Leupeptin(亮抑蛋白酶肽)50μM。用戊二醛固定后进行电镜样品制备检测。
如图9所示，UMI-77处理后在溶酶体抑制剂存在情况下，明显观察到线粒体被自噬溶酶体包裹。
筛选得到的有效线粒自噬诱导剂UMI-77具有以下特点：
1)线粒体标记蛋白Tom20和Tim23降解，同时其他细胞器的标记蛋白不降解，如内质网的标记蛋白Calnexin不降解；
2)线粒体与溶酶体共定位，如用荧光标记线粒体和溶酶体，活细胞观察其共定位增加；
3)线粒体降解通过溶酶体通路，如加入溶酶体抑制剂E64D或氯化铵和Leupeptin(亮抑蛋白酶肽)可以阻止线粒体标记蛋白Tom20和Tim23的降解；
4)线粒体会被自噬溶酶体膜包裹，如用电镜观察可以看到多个线粒体被自噬溶酶体包裹。
实施例3线粒体自噬诱导剂UMI-77用于炎症的治疗的应用
1、实验方法：C57BL/6遗传背景的雄性4-8周龄小鼠购于南京模式动物中心。分为4组，每组6只，正常饲养1周适应后进行实验。全部药物溶于2％DMSO+30％PEG400+水的溶剂中。对每只小鼠称重，按照体重以UMI-7730mg/kg，Nec1 2.5mg/kg腹腔注射药物200μl。LPS诱导组腹腔注射200μl溶剂。NC组不做处理。20分钟后注射LPS/D-Gal(脂多糖/D-半乳糖胺)浓度(LPS：100μg/kg，D-Gal：400mg/kg)。6小时后，眼球采血，并取出肝脏多聚甲醛固定。新鲜血液室温静置30分钟后，2000转每分钟，离心10分钟，取上清，用全自动生化分析仪测定ALT(谷丙转氨酶)，AST(谷草转氨酶)活力。肝脏固定后做HE(苏木精—伊红)染色。
如图10所示，LPS/D-Gal(脂多糖/D-半乳糖胺)诱导小鼠急性肝炎模型中，UMI-77可以显著抑制肝损伤。Nec1为已知的RIPK1蛋白抑制剂，UMI-77的效果好于Nec1。
如图11所示，LPS/D-Gal(脂多糖/D-半乳糖胺)诱导小鼠急性肝炎模型中，UMI-77可以显著抑制肝损伤。UMI-77恢复肝细胞的完整性。
实施例4UMI-77通过诱导MCL1与LC3A(自噬标记物蛋白)相互作用诱导线粒体自噬
1、实验方法：1)MCL1shRNA载体的构建。根据网站https://dharmacon.horizondiscovery.com上设计两个MCL1 shRNA序列，并在两端加入BamHI和EcoRI酶切位点，送交上海生工生物合成。合成好的序列退火后连入pLV3载体形成pLV3-M2，pLV3-M5。2)HEK293T细胞以2*105个/ml，Hela细胞以1.5*105个/ml的密度种于6孔板中，每孔2ml。每个细胞种6个孔。转染pLV3-M2，pLV3-M5入细胞，每个孔转入1μg shRNA质粒。转染方法：预先分别混合50μl无血清的DMEM培养基和1μg DNA，50μl无血清的DMEM培养基和2μllip2000。最后将两个组分混合，室温静置20分钟，滴入培养基中。转染48小时后，加入UMI-77 5μM，处理12小时后统一用250μl 2X SDS上样缓冲液收样。100度加热10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V 2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(Tom20抗体购自Cell Signaling Technology，#42406S；Tim23抗体购自Proteintech，#11123-1-AP；Tubulin抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#M1305-2，MCL1抗体购自杭州华安生物技术有限公司，#ET1606-14)以一定稀释比(Tubulin抗体为1：5000，其余为1：1000)4度孵育过夜，PBST(磷酸盐缓冲液+0.1％Tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31430；Goat anti-Rabbit IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟。ECL显色。
由图12可知，基因敲低实验后免疫杂交显示，MCL1蛋白被RNA干扰后表达量下降，此时再加入UMI-77后不能诱导线粒体标记蛋白Tom20和Tim23的降解。
2、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml，接种于12孔板，每孔1ml，并预先在板中铺入免疫荧光载玻片。24小时后，加入UMI-77 10μM处理5小时，去除培养基，用PBS洗涤两遍，加入适量的4％多聚甲醛固定20分钟。用PBS洗涤两遍，用
Figure BDA0002055018550000101
In Situ RedStarter Kit Mouse/Rabbit试剂盒(购自Sigma-Aldrich，#DUO92101)中的Blocking溶液封闭60分钟，37度。之后用上述试剂盒中的抗体稀释液稀释抗体(MCL1抗体购自santa cruz，#sc-69840，1：200稀释)，LC3A抗体购自Abcam，#ab62720，1：500稀释)，4度孵育过夜。用试剂盒中的洗涤试剂A洗涤片子2遍，每次10分钟。按照试剂盒的说明孵育二抗Anti-rabbit-PLUS和Anti-mouse-MINUS,37度60分钟。之后同样用洗涤试剂A洗涤片子2遍，按照试剂盒的说明用连接酶37度连接30分钟。之后同样用洗涤试剂A洗涤片子2遍，按照试剂盒的说明等温扩增37度120分钟。最后用洗涤试剂B洗涤，用带有DNA染料DAPI的封片试剂封片。biotekCytation3拍照，并用软件分析荧光强度和个数。
由图13可知，用
Figure BDA0002055018550000111
In Situ Red Starter Kit Mouse/Rabbit试剂盒(购自Sigma-Aldrich，#DUO92101)在HEK293T细胞中检测内源的MCL1与LC3A相互作用。红色的点代表相互作用，红色点越多或者荧光强度变强说明其相互作用越强。UMI-77可以明显诱导红点变多，说明MCL1和LC3A相互作用增强。
3、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml，接种于10cm培养皿。24小时后，共转染pCMV3-MCL1-3xFlag和pCDNA3.1-HA-LC3A或pCDNA3.1-HA-LC3B质粒，每个各4μg。转染方法：预先分别混合500μl无血清的DMEM培养基和8μgDNA，500μl无血清的DMEM培养基和16μl PEI(聚乙烯亚胺)转染试剂。最后将两个组分混合，室温静置20分钟，滴入培养基中。转染24小时后加入UMI-77 10μM处理5小时后，用PBS洗涤细胞两遍。用RIPA(20mM Tris-HCl,150mMNaCl,0.5％NP-40,1mM NaF,1mM Na3VO4,1mMEDTA)裂解液每个样品1ml，4度裂解30分钟。用枪头将细胞刮下，连同液体一同转移到1.5ml离心管中，4度12000g离心10分钟，取上清转移到新管中。从裂解好的上清中取出50μl样品加入等体积的2X SDS上样缓冲液收样，100度煮沸10分钟，作为Input样品。取适量的偶联有Flag抗体的琼脂糖凝胶，用RIPA裂解液洗涤3遍，每次2000rpm离心3分钟。将剩余的制备好的细胞裂解上清与预处理的偶联有Flag抗体的琼脂糖凝胶混合，4度混合过夜。第二天，2000rpm离心3分钟收取琼脂糖凝胶，并用RIPA洗涤3遍，每次2000rpm离心3分钟。最后收集琼脂糖凝胶用30μl的2X SDS上样缓冲液重悬，100度煮沸10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(Flag抗体购自杭州华安生物有限公司，#0912-1，HA抗体购自杭州华安生物有限公司，#0906-1)以1：5000稀释比4度孵育过夜，PBST(磷酸盐缓冲液+0.1％Tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)二抗购自Thermo Fisher Scientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟。ECL显色。
由图14可知，免疫共沉淀实验显示UMI-77诱导LC3A和MCL1相互作用增强。
4、实验方法：HEK293T细胞以2*105个/ml，接种于10cm培养皿。24小时后，共转染pCMV3-MCL1-3xFlag以及突变体和pCDNA3.1-HA-LC3A质粒，每个各4μg。转染方法：预先分别混合500μl无血清的DMEM培养基和8μg DNA，500μl无血清的DMEM培养基和16μl PEI(聚乙烯亚胺)转染试剂。最后将两个组分混合，室温静置20分钟，滴入培养基中。转染24小时后加入UMI-77 10μM处理5小时后，用PBS洗涤细胞两遍。用RIPA裂解液每个样品1ml，4度裂解30分钟。用枪头将细胞刮下，连同液体一同转移到1.5ml离心管中，4度12000g离心10分钟，取上清转移到新管中。从裂解好的上清中取出50μl样品加入等体积的2X SDS上样缓冲液收样，100度煮沸10分钟，作为Input样品。取适量的偶联有Flag抗体的琼脂糖凝胶，用RIPA裂解液洗涤3遍，每次2000rpm离心3分钟。将剩余的制备好的细胞裂解上清与预处理的偶联有Flag抗体的琼脂糖凝胶混合，4度混合过夜。第二天，2000rpm离心3分钟收取琼脂糖凝胶，并用RIPA洗涤3遍，每次2000rpm离心3分钟。最后收集琼脂糖凝胶用30μl的2X SDS上样缓冲液重悬，100度煮沸10分钟。免疫杂交：每个样品上样10μl，电泳90V2h；转膜300mA，1h。5％脱脂牛奶室温封闭1h，抗体(Flag抗体购自杭州华安生物有限公司，#0912-1，HA抗体购自杭州华安生物有限公司，#0906-1)以1：5000稀释比4度孵育过夜，PBST(磷酸盐缓冲液+0.1％Tween20)洗涤3遍每次10分钟。二抗(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)二抗购自Thermo FisherScientific，#31460)以1：20000稀释比室温孵育1h，PBST洗涤3遍每次10分钟。ECL显色。
由图15可知，将MCL1含有的两个LIR motif分别突变。第一个LIR motif突变为四种形式：W261A,I264A,W261A/I264A,ΔLIR.第二个LIR motif突变为三种形式：F318A，V321A，F318A/V321A。第一个LIR motif突变后显著影响了MCL1和LC3A的相互作用。第二个LIR motif几乎没有影响。
实施例5UMI77对小鼠炎症性肠病保护作用
实验方法：C57BL/6遗传背景的7-8周龄雄性野生型小鼠自由饮用2％DSS溶液(溶液需新鲜配制)6天后，改换饮用正常水至实验结束。实验过程中，每天皮下注射UMI77(5mg/kg体重)；同时，每天记录小鼠体重变化、粪便形状和便血情况。实验中，粪便性状和便血情况评分参考文献Nat Protoc.2007；2(3):541-6；组织病理学评分分为炎性细胞浸润评分和组织损伤评分参考文献Immunity.2010；32(3):379-91，最终计算疾病活动指数。
实验结束，以CO2处死小鼠后，离断自盲肠至肛门的全部肠段，拍照并测量长度。然后，取中间约1cm肠段放入包埋盒中浸入10％中性福尔马林以制备病理标本，用于HE染色；剩余肠段用50mL注射器以预冷的生理盐水进行冲洗，洗尽肠腔内剩余液体后，用小剪刀剪碎、混匀，锡箔纸包裹后液氮急冻，全部操作控制在小鼠死后10分钟以内完成。用Trizol裂解组织，按照Trizol说明书提取RNA；得到的RNA用ABI公司的逆转录试剂盒进行逆转录反应；SYBR Green法检测逆转录产物中炎症因子Cxcl1、G-CSF、IL6、IL-1β、S100A8和TNF-α，以管家基因Actin为内参，用2-ΔΔCt法来计算和分析。
由图16-图21可知，UMI77可以显著性减缓体重下降幅度，降低疾病活动指数，恢复肠组织及其细胞正常状态，降低炎症因子表达，提示其可以保护炎症性肠病。
实施例6UMI-77恢复APP/PS1模型老鼠的空间记忆学习能力
实验方法：目前通用的其中一个阿尔兹海默疾病的小鼠模型为APP/PS1小鼠。遗传背景为C57BL/6的APP/PS1小鼠和对照鼠购自于南京模式动物中心。分为三组，对照组，APP/PS1模型组，APP/PS1模型给药组，每组5-7只。APP/PS1 4月龄时开始腹腔注射给药UMI-7713mg/kg。隔天给药，持续4个月，之后进行水迷宫实验。实验主要分为两部分：定位巡航实验和空间搜索实验。定位巡航实验用于测量小鼠对水迷宫的学习和记忆能力获取。空间搜索实验测量小鼠对平台空间位置记忆的保持能力。
定位巡航实验：将含有二氧化钛水的水池分为4个象限(西北，东北，西南，东南)，平台置于东南象限水下1cm左右。将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置按照西北，东北，东南，西南的顺序放入4次。记录每次小鼠找到水下平台的时间。如果时间超过60秒，则引导小鼠到平台上，让其停留20秒，并记录此次找到平台时间为60秒。每只小鼠每天训练4次，一共训练4天，记录找到平台的时间(逃避潜伏期)。
由图22可知，颜色越深代表逃避潜伏期越长，越浅代表逃避潜伏期越短。从图中可以看到，随着训练时间的增加，每组小鼠的逃避潜伏期都有所下降，说明小鼠获得了空间位置的信息。但在训练过程中，APP/PS1小鼠的逃避潜伏前明显长于对照小鼠和给药小鼠，说明APP/PS1小鼠空间学习能力受损，在用UMI-77治疗后，能力恢复且优于野生型。总体上，用UMI-77治疗的APP/PS1小鼠的空间学习和记忆能力明显好于APP/PS1小鼠。(P<0.05,差异显著)。
空间搜索实验：定位巡航实验结束24小时后，将平台撤除，开始60秒的空间搜索实验。将小鼠由原先平台象限的对侧放入水中，记录小鼠穿过原先平台位置的次数和运动轨迹。
由图23可知，APP/PS1小鼠穿过原平台的次数显著低于对照小鼠，说明其空间记忆保持能力受损。(P<0.05,差异显著)。用UMI-77治疗后的APP/PS1小鼠的穿过次数明显多于APP/PS1小鼠。(P<0.01,差异显著)说明UMI-77可以明显提高APP/PS1小鼠的空间记忆保持能力。由图24可知，图中圆圈为原平台位置。对照组和给药组都有不同次数的穿过平台，APP/PS1小鼠并没有穿过平台。
阿尔兹海默症是一种严重的神经退行性疾病，目前并无特效药治疗。在之前的研究中发现阿尔兹海默症患者大脑中存在大量的淀粉样蛋白堆积和损伤线粒体堆积。目前已知的临床药物主要是针对淀粉样蛋白的清除和降解。UMI-77可以诱导线粒体自噬，帮助清除损伤线粒体，预示其对于治疗阿尔兹海默症的潜力。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

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1.一种UMI-77作为唯一活性成分在制备治疗阿尔兹海默症药物中的应用。
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