CN111855729B - Oatp1b1在制备活体示踪和/或监测移植细胞的磁共振中的应用 - Google Patents

Oatp1b1在制备活体示踪和/或监测移植细胞的磁共振中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学领域，公开了OATP1B1在制备活体示踪和/或监测移植细胞的磁共振中的应用。将OATP1B1肝脏转运蛋白对移植细胞动态追踪的表现和Gd‑EOB‑DTPA沦为一体，证明了OATP1B1是Gd‑EOB‑DTPA依赖的基因报告，并且在确定细胞命运的监测中同时提供了MRI的非侵入性成像，在以移植为中心的研究中仍具有相当大的潜力。

Description

OATP1B1在制备活体示踪和/或监测移植细胞的磁共振中的 应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种肝脏转运蛋白OATP1B1作为磁共振成像成像报告分子在活体示踪和/或监测移植细胞中的应用。
背景技术
在宿主体内进行细胞监测是细胞治疗学发展和进步的先决条件。分子成像被广泛分为直接和间接(基于基因)报告基因标记。与预装造影剂的直接细胞标记相反，间接报告依赖于肽、受体、蛋白质或酶的表达，它们要么产生固有的成像信号，要么通过受体介导的细胞摄取给药的造影剂。由于操作简便，直接标记法追踪细胞更为常见，但随着细胞分裂稀释造影剂、巨噬细胞吞噬以及死亡和存活细胞信号的释放，阻碍了长期追踪。尽管遗传报告基因不如直接标记法敏感，但是它在定量和重复性的移植细胞非侵入性成像中具有优势。此外，如果报告基因从组织特异性启动子中作用，则可以检测到细胞的位置和分化状态。
间接报告系统可以使用包括磁共振成像(MRI)，生物发光成像(BLI)，正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和光学成像(OI)等不同类型的成像方式，每种成像方式都有各自的优缺点，因此，报告基因可以与多种成像方式联合成像，这就很好的掩盖了单一成像方法的缺点。由于磁共振成像能够在不暴露于电离辐射的情况下以高时空分辨率和良好的穿透深度获取图像，人们已经开始努力引入新的基因编码磁共振报告基因。
在过去的20年中，已经引入了几种MRI报告基因，它们通过不同的造影剂生成机制作用，在开发金属蛋白报告基因时，早已引起了很多关注，这些报告基因具有顺磁性，并在T1或T2加权图像上产生适度的对比度。例如，酪氨酸酶仅增强12％，铁蛋白显示35％，转铁蛋白增强50％。对比剂的适度改善以外源性铁补充剂与非临床有效的14T MRI结合为代价。另一方面，生物降解带电荷肽报告基因通过化学交换饱和转移(CEST)在11T磁共振成像上产生适度的信号。近日对水通道的利用，如水通道蛋白或尿素转移-B(UT-B)膜蛋白过度表达在扩散的MRI上增强了200％的对比度。其他膜转运蛋白报告方法完全依赖于造影剂的顺磁性质。据作者所知，啮齿动物有机阴离子转运多肽(rOatp1a1)的肿瘤通过摄取临床认可的基于Gd3+的造影剂钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸(GD-EOB-DTPA)可产生最高的780％MR信号增强(GD-EOB-DTPA)。Gd-EOB-DTPA是一种顺磁性肝胆染料，可在T1加权图像上增强信号，通常用于评估慢性肝病。有机阴离子转运多肽(人用燕麦多糖，啮齿动物用燕麦多糖)是一种多途径膜蛋白，介导细胞对多种底物的摄取，包括多种内源性和外源性物质。此属性使转运蛋白能够报告多种成像方式，包括MRI，SPECT，光声成像仪(PAI)，生物发光成像仪(BLI)等。由于大多数新引入的报告者都是通过非临床扫描仪以及在大型实体瘤中表达报告蛋白来验证的，因此对新开发的MRI报告者的临床适用性的评估越来越有必要。动物来源的报告基因也引起了与免疫原性相关的调节问题。
发明内容
本发明试图将OATP1B1肝脏转运蛋白对移植细胞动态追踪的表现和Gd-EOB-DTPA给药后沦为一体。据我们所知，迄今为止，OATP1B1还没有被描述为MRI报告基因。在这项研究中，我们已将OATP1B1显示为有效的MRI报告基因。我们还描述了OATP1B1的成像性能，并通过对移植细胞的早期植入、增殖和迁移的成像来证明OATP1B1的实用性。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了OATP1B1作为体内外磁共振成像报告分子在细胞医学中的应用。
其中，所述细胞医学为活体示踪和/或监测移植细胞。
本发明中证实了OATP1B1与钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸特异性亲和。
作为可实施的方式，用OATP1B1基因标记移植细胞，并将移植细胞植入宿主体内，注射钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸，指定时间内进行磁共振扫描成像。
进一步可实施的，所述钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸的注射用量为1～5mmol/kg。
本发明中，上述注射为静脉注射或腹腔注射。
作为可实施的方式，培养OATP1B1基因标记的细胞，将所述细胞用指定浓度的钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸在37℃和5％CO2下处理，停止处理后进行磁共振扫描成像。
进一步可实施的，所述钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸的浓度为0.05mM-1mM。
作为可选的实施方式，停止处理后将细胞进行过量洗涤，并用胰蛋白酶消化。
进一步的，消化后得到的细胞用琼脂糖凝胶密封。
本发明具有以下技术效果：
本发明提供了钆依赖OATP1B1作为新的MRI报告基因，它能够取代啮齿类动物肝脏转运体Oatp1a1，这将减轻由于将啮齿类动物蛋白引入人类细胞进行临床翻译或在人源化小鼠中对患者源性肿瘤异种移植进行成像而引起的与免疫原性相关的担忧。与其他磁共振成像不同的是，铁蛋白、转铁蛋白、AQP1、UT-B在哺乳动物组织中广泛运用，而OATP1B1的表达局限于肝细胞，这导致了低背景和高信噪比。依赖于钆的OATP1B1报告基因的另一个杠杆作用是，它产生正的明亮对比，而由铁螯合报告者产生的异位暗对比常常与人工制品或癌变部位固有的负对比混淆，肿瘤微环境中的转移或出血。这意味着OATPB1可通过磁共振成像仪摄取Gd-EOB-DTPA提供成像。
在临床3T MRI方面，Gd-EOB-DTPA依赖性摄取在追踪早期细胞植入和细胞迁移方面显示出高的敏感性和特异性。本发明中的OATP1B1是Gd-EOB-DTPA依赖的基因报告，并且在确定细胞命运的监测中提供了MRI非侵入性成像，在以移植为中心的研究中仍具有相当大的潜力。
附图说明
图1为在多克隆位点(MCS)连续克隆OATP1B1全长cDNA的诱导慢病毒构建示意图。
图2为Anti-Flag抗体免疫印迹显示转基因无漏泄表达，并且OATP1B1定量增加与Dox浓度的增加有关。
图3为通过PCR管对颗粒细胞的矢状截面进行T1加权的MR成像。
图4为定量分析磁共振成像的平均信号强度。
图5为定量分析磁共振成像的对比噪声比(CNR)。
图6展现了21d细胞移植后获得的MR图像，对照组的箭头显示了稀疏的对比度增强。
图7为21d细胞移植后MR图像的对比噪声比。
图8为肿瘤体积为20m2的肿瘤仅在Dox-fed组显示增强。
图9为7d细胞移植后MR图像的对比噪声比。
图10为皮下移植前体外诱导细胞2d，箭头指向表达4T1细胞的OATP1B1增强信号强度。
图11为24h细胞移植后MR图像的对比噪声比。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、Dox诱导稳定细胞系的细胞培养及产生
多西环素(Dox)诱导系统对功能研究来说是一个有效途径，它可以通过调节基因表达来避免转基因产物的长期非靶向效应。因此，我们首次在Dox诱导的TRE3G启动子下证实了转运蛋白OATP1B1在HEK293T细胞中的表达、定位和功能验证。将每个转基因的C端用3X标记，并用mVenus荧光蛋白(与自切割p2A肽分离)在框架中表达(图1)。通过转导然后选择嘌呤霉素建立具有OATP1B1转运蛋白的稳定细胞系(图2)。具体方法如下：
人胚肾细胞(HEK 293T)、鼠Trippel阴性乳腺癌细胞(4T1)从商业供应商(美国型培养标本)获得，并在37℃和5％CO2条件下，在添加10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中常规培养。
人脂肪源性间充质干细胞(hADSC)取自中国深圳Biowit科技有限公司(BiowitTechnologies，sheng，China)并在无血清超培养基(Lonza)中培养，培养液中添加了2％Ultroser G(PALL)和1％L-谷氨酰胺(Gibco)。
将HEK-293T细胞接种到6孔板(1x106/孔)中，与含有感兴趣基因(GOI)和3.2μμgpMD2.G和1.2μg pSPAX2载体的5μg plVX-Tet共转染到mvenus载体上。转染48h后，收集慢病毒培养基，过滤后加入目标293T、4T1或hADSC细胞培养，感染倍数(MOI)为5。转染48h后，用0.5μg/mL嘌呤霉素(puro)筛选HEK-293T细胞和hADSC细胞7d，用2.5μg/mL puro筛选4T1细胞2周。这导致产生含有GOI的多克隆HEK-293T、4T1和hADSC细胞；细胞携带空慢病毒载体，称为模拟细胞。
2、免疫荧光染色
用0.5μg/mL Dox诱导细胞48h，然后铺在4孔玻片(ThermoFisher)上。24小时后，将载玻片固定并在有或没有1％Triton X-100的情况下用4％低聚甲醛透化15分钟，并在4℃下用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。然后将细胞与3％BSA中的兔抗旗帜抗体(Solarbio)在4℃孵育过夜。用PBS洗涤后，将玻片与驴抗兔Alexa Fluor 594(ThermoFisher)(作为二抗)一起孵育，在0.1％PBS-Tween中按1：2000稀释45分钟，最后洗涤后，将玻片用Hoechst染色，稀释1：200在PBS中5分钟。对于阴性对照，将载玻片仅与二抗一起孵育。
加入Dox激活的TRE3G启动子，使荧光蛋白mVenus与转基因OATP1B1一起作用，具有OATP1B1转运蛋白的稳定细胞系建立成功。
3、蛋白质印迹
使用具有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Solarbio)裂解细胞，并使用Bradford分析法确定蛋白质浓度。用6X SDS上样缓冲液还原蛋白裂解液，并在SDS PAGE凝胶的每个泳道上运行15μg总蛋白。重要的是要注意蛋白质裂解物不会因热处理而变性，因为多通道膜蛋白质倾向于在较高温度下形成寡聚物。蛋白质转移到PVDF膜(Millipore)上后，使用多克隆兔抗旗帜抗体(Solarbio)以5000稀释度1稀释并在4℃下孵育过夜，以检测目标蛋白质。辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体(Abcam)，以10,000稀释的比例用作二抗，在室温下孵育时间为45分钟。蛋白质带由Immobilon Western化学发光HRP底物(Millipore)和Bio-Rad化学发光成像系统检测。
检测结果见图2。Anti-Flag抗体免疫印迹显示转基因无漏泄表达。并且OATP1B1的定量增加与Dox浓度的增加有关。
4、从组织，细胞和实时PCR中提取RNA
通过定量实时PCR(qRT-PCR)分析报告基因在植入的一级或二级(转移)位点的mRNA表达。按照制造商的规程，使用Trizol试剂(Invitrogen)从肿瘤组织，乳腺脂肪垫，肺，肝脏，脾脏，心脏和肠中提取总RNA。使用带有gDNA橡皮擦(Takara)的PrimeScript RT试剂盒，用1μg总RNA反转录cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus，Takara)试剂在Applied Biosystems 7500Real-Time PCR System上以25μl反应进行qRT-PCR。为了定量评估诱导的hADMSc细胞中的间充质干细胞标记，从Trizol中分离出总RNA，转录0.5μg总RNA，然后进行qRT-PCR。
在正常生理条件下，OATPs转运蛋白都定位在细胞膜上，N和C都位于细胞质中。较早的研究表明，在C末端增加额外的电荷可以改变跨膜蛋白的拓扑结构。事实上，在OATP1B1的C端添加3X标志已经被转移到细胞外区域，因为它可以通过免疫荧光检测而不发生细胞渗透。
实施例2
体外MRI
将OATP1B1的HEK-293T或4T1和相对的Mock对照细胞接种在6个孔板中，每孔0.8x106个细胞，接种在含0.5μg/mL Dox的完全培养基中。接种稳定的细胞系后24小时，吸出培养基并用含有12mM HEPES，pH 7.4的HBSS缓冲液校准30分钟。在HBSS缓冲液中具有指定浓度的Gd-EOB-DTPA(Bayer)或Gd-DTPA(Magnevist)的细胞在37℃和5％CO2下处理90分钟。通过添加冰冷的HBSS缓冲液停止摄取，然后进行过量洗涤和胰蛋白酶消化。将细胞在0.2mL PCR管中以5000RPM离心5分钟。小心地除去上清液，并用180μl的1％琼脂糖凝胶密封细胞沉淀。最后，将试管在PCR试管架中排成一行，然后将其置于装有水的塑料容器中。使用商用的12通道腕带线圈(上海联合成像医疗有限公司)在3-Tesla临床MR扫描仪(UMR790，上海联合成像医疗有限公司)上进行MRI。分辨率脉冲序列(3D IR-FSE)，否则使用2500/12.04毫秒的TR/TE，500-900毫秒的TI，40的ETL，65的翻转角和200x 320的矩阵。为了避免可能干扰T1测量的切片串扰，获得了一条1.5毫米厚的切片，该切片穿过了PCR管排。MR图像和T1加权强度是使用开源软件(http://ric.uthscsa.edu/mango/)的Multi-Image Analysis GUI(Mango)测量的。
实施例3
为了评估移植细胞的体内细胞动力学，我们进一步将报告者导入高转移性乳腺癌小鼠4T1细胞系中。4T1-OATP1B1的诱导作用和功能以类似的方式得到证实。
动物实验
所有动物护理和实验程序均符合国家研究委员会关于实验动物的护理和使用指南，并且所有程序均已获得深圳大学(中国深圳)机构动物护理和使用委员会的批准。
雌性BALB/C小鼠(6-8周龄；20-22g)购自Vital River实验室动物技术有限公司(中国北京)，并在22±5℃的光照/黑暗条件下饲养12小时。在所有实验中均使用循环并随意提供食物和水的方法。在细胞移植过程中，通过连续吸入2％异氟烷气体使小鼠处于麻醉状态。
为了推断早期细胞移植或细胞迁移，在取像前用10mg/mL dox对实验的动物进行灌胃4d。将1.5x1064T1-OATP1B1移植于BALB/C小鼠的背侧/对侧。为了确定报告子在间充质细胞中的适用性，将指定数量的hADSC稳定细胞悬浮于50μl PBS中，并使用1mL带27-G的注射器将其注射到剃毛的右后肢的腓肠肌中。
体内MRI
在指定日期，使用商用螺线管射频线圈，用3特斯拉GE临床磁共振扫描仪(GeneralElectric Healthcare Discovery MR7503.0 T，密尔沃基，WI)扫描4T1或HADSC移植细胞。小鼠腹腔注射400mg/kg水合氯醛麻醉。静脉注射Gd-EOB-DTPA(2mmol/Kg)3h后，利用稳态脉冲序列中的破坏梯度回忆采集技术，获取T1加权图像：视场，50mm；重复时间：15.8毫秒；回波时间：10.5毫秒；接收器带宽：31.25MHz；回波序列长度：4；翻转角度，60度；激发次数，1；100μm各向同性体素；扫描时间，每只老鼠大约15分钟。利用开源软件多图像分析GUI(Mango)对MR图像进行对比噪声比(CNR)测量(http://ric.uthscsa.edu/mango/)。用检测区域与后肢组织平均信号强度的差值除以背景信号的标准差计算CNR。
结论：
自从发现啮齿动物有机阴离子转运体rOatp1a1作为一个强Gd-EOB-DTPA依赖的MRI基因报告者以来，筛选和鉴定人类的直系亲属以避免免疫原性反应就变成了最重要的因素。然而OATP1B1作为MR报告者的潜力仍然没有被证实。所以本发明研究目的之一就是验证OATP1B1依赖的GD-EOB-DTPA摄取在T1加权MRI上的转换。用不同浓度的GD-EOB-DTPA或GD-DTPA处理OATP1B1-293T细胞90min，再用琼脂糖体模进行3t临床MRI扫描。我们会发现对比度增强依赖于Gd-EOB-DTPA剂量，在最高浓度(1mM)治疗组中就显示了约9倍的对比增强比(CNR)(图3-5)。同时，与未导入组相比，仅用钆二胺处理的OATP1B1的细胞在光输出量上无显著差异，这表明OATP1B1与Gd-EOB-DTPA有精确的亲和力，而与Gd-DTPA造影剂无明显的亲和力。为了评估报道分子的体内功效，我们首先将OATP1B1的4T1细胞植入BALB/C小鼠的对侧。在细胞植入后的21天中，OATP1B1的同种异体移植物的CNR升高了约8倍(图6-7)。尽管在未导入OATP1B1小鼠组中观察到的Gd-EOB-DTPA的非特异性积累导致了CNR增加2倍。但在植入后7d后，对扫描OATP1B1肿瘤的扫描结果，进一步证实了报告者的有效性。肿瘤局部可见明亮信号，对照组未见明显增强(图8-9)，提示肿瘤异质性或坏死可能是大肿瘤体积对照组稀疏增强的原因。当皮下埋植24小时后，只有1.5x106细胞的CNR增强了约4.5倍(图10-11)，这就进一步测试了OATP1B1报告者的范围和特异性，也表明了OATP1B1是一个令人信服的MR基因报告。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种在活体示踪和/或监测移植细胞中应用OATP1B1作为磁共振成像报告分子的方法，其特征在于，所述OATP1B1与钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸特异性亲和；
培养OATP1B1基因标记的细胞，将所述细胞用指定浓度的钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸在37℃和5％CO2下处理，停止处理后进行磁共振扫描成像；
所述钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸的浓度为0.05mM-1mM；
停止处理后将细胞进行过量洗涤，并用胰蛋白酶消化；
消化后得到的细胞用琼脂糖凝胶密封。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，OATP1B1基因标记移植细胞，并将移植细胞植入宿主体内，注射钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸，指定时间内进行磁共振扫描成像。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述钆乙氧基苄基二乙烯三胺五乙酸的注射用量1~5mmol/kg。
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