CN111849932A - 八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物合成领域，特别涉及八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用。本发明基于前期通过易错PCR筛选到的BtCrtI突变体菌株，对所包含的突变位点进行单点和多点重组验证，确定影响BtCrtI催化特异性的关键位点；对筛选得到的BtCrtI关键位点进行饱和突变，来增加BtCrtI突变体功能的多样性；通过对BtCrtI单点饱和突变结果进行主成分分析(PCA)和K均值聚类分析，对单点突变体归类，并将不同类别的代表性的单点突变进行组合，进一步分析BtCrtI催化功能的多样性。

Description

八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物合成领域，特别涉及八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
类胡萝卜素是自然界中广泛分布的一大类色素家族，目前已确定的类胡萝卜素分子结构已超过750种。近些年来，由于其出色的染色和抗氧化能力，类胡萝卜素在医药、食品色素、动物饲料等方面具有重要的商业潜力。在类胡萝卜素的生物合成路径中，八氢番茄红素是最起始的C40骨架化合物，并且具有9个双键。而后续由八氢番茄红素脱氢酶催化的连续多步脱氢为合成多样化的具有生理活性的类胡萝卜素提供了丰富前体。因此，探究影响八氢番茄红素脱氢酶的催化特异性的结构位点用于定制化合成脱氢产物和相应的类胡萝卜素衍生物具有重大意义。
目前关于八氢番茄红素脱氢酶的研究主要是不同物种中酶的挖掘和功能表征。一般来讲，真菌来源的八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)能够催化连续四步脱氢合成番茄红素，而细菌来源的八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)催化步数更多样(三步到六步)。而在蓝细菌和植物中CrtI分化为八氢番茄红素脱氢酶(CrtP或PDS)和zeta-胡萝卜素脱氢酶(CrtQ或ZDS)，分别负责由八氢番茄红素到番茄红素的四步脱氢中的前后两步。基于八氢番茄红素脱氢酶在自然进化过程中表现出的多样性功能分化，也有一些通过定向进化来改变八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)催化特异性的研究。Frances H.Arnold通过定向进化延长了八氢番茄红素脱氢酶的脱氢步数，合成了六步脱氢产物3,4,3’,4’-tetradehydrolycopene。在另一项研究中，也是通过对一个三步脱氢酶CrtI的随机突变，筛选得到了一个四步脱氢酶。而在我们之前的研究中(专利CN201910308068)也是在酿酒酵母中通过定向进化筛选到了一株两步脱氢突变体菌株和一株四步脱氢产物显著降低、三步脱氢产物显著增加的突变体菌株。
目前关于CrtI功能多样性的研究通常是通过随机突变的方式筛选出脱氢步数与原始脱氢酶不同的突变体，并未对这些突变位点进行深入的结构分析。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用，通过酶的定向进化探究八氢番茄红素脱氢酶催化特异性，为后续通过环化、羟基化等反应合成高活性类胡萝卜素提供多样化前体，进而实现产物的定制化合成。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了八氢番茄红素脱氢酶突变体，其第160、576、545、289、355、148、136、453位氨基酸中任意一个或几个被取代。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代包括Y160F&N576S、T545A、A289V、A355V、N148D、A289V/A355V、H136P、H136C、H136S、H453K、H453C、H453Q、H453Y、H453A、H453G、H453F、H453E中的任意一个或多个的组合。
在本发明的一些具体实施方案中，所述八氢番茄红素脱氢酶突变体包括Y160F&N576S、A289V&A355V、H136C&H453G、H136C&H453F或H136C&H453E中的一个或多个的组合。
本发明还提供了编码所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体的DNA分子。
此外，本发明还提供了一种重组表达载体，携带有所述的DNA分子。
在上述研究的基础上，本发明还提供了一种宿主细胞，包含所述的重组表达载体。
更具有重要意义的是，本发明还提供了所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体、所述的DNA分子、所述的重组表达载体、所述的宿主细胞在提高八氢番茄红素脱氢酶的催化效率、合成脱氢产物和/或合成六氢番茄红素，zeta-胡萝卜素，链孢红素，四氢-β-胡萝卜素，二氢-β-胡萝卜素，zeta-carotene-2-one和/或neurosporene-2-one中的应用。
本发明还提供了合成脱氢产物的方法，以所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体催化反应或以所述的宿主细胞为发酵菌株发酵。
本发明还提供了合成六氢番茄红素，zeta-胡萝卜素，链孢红素，四氢-β-胡萝卜素，二氢-β-胡萝卜素，zeta-carotene-2-one和/或neurosporene-2-one的方法，以所述的宿主细胞为发酵菌株发酵。
本发明基于前期通过易错PCR筛选到的BtCrtI突变体菌株，对所包含的突变位点进行单点和多点重组验证，确定影响BtCrtI催化特异性的关键位点；将不同来源的八氢番茄红素脱氢酶进行序列比对和进化树分析，探究不同来源、不同脱氢步数的八氢番茄红素脱氢酶在BtCrtI关键突变位点的氨基酸分化情况；对筛选得到的BtCrtI关键位点进行饱和突变，来增加BtCrtI突变体功能的多样性；通过对BtCrtI单点饱和突变结果进行主成分分析(PCA)和K均值聚类分析，对单点突变体归类，并将不同类别的代表性的单点突变进行组合，进一步分析BtCrtI催化功能的多样性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1中摇瓶发酵结果；
图2示实施例1中摇瓶发酵结果；
图3示实施例2中摇瓶发酵结果；
图4示实施例2中单点验证试验的发酵结果；
图5A示不同来源八氢番茄红素脱氢酶进化树分析和序列比对；图5B示BtCrtI在结合辅因子FAD前后(打开结构和关闭结构)构象变化；图5C示136位残基在BtCrtI打开结构和关闭结构中的结构变化；图5D示453位残基在BtCrtI打开结构和关闭结构中的结构变化；
图6A示关键结构位点H136的饱和突变体的摇瓶发酵结果；图6B示关键结构位点H453的饱和突变体的摇瓶发酵结果；
图7示BtCrtI中H136位点和H453位点的单点饱和突变结果聚类分析结果；
图8示实施例6的摇瓶发酵结果。
具体实施方式
本发明公开了八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明从之前研究中通过易错PCR筛选得到的两个突变体出发(CN201910308068)，通过理性设计找出了影响催化特异性的关键位点，探究了突变位点间的协同作用；借助同源建模、分子对接、序列比对、进化树分析等生物信息学手段，从蛋白结构层面分析了突变体功能变化的原因，同时揭示了八氢番茄红素脱氢酶在自然进化中表现出功能多样性可能的原因；通过对关键位点进行单点饱和突变、主成分分析和聚类分析、关键位点组合突变，增加了CrtI脱氢功能的多样性，从而奠定了定制化合成多样的类胡萝卜素产物的基础。
本发明提供的八氢番茄红素脱氢酶突变体及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1确定影响BtCrtI催化功能的突变位点
在前期的研究中(CN201910308068)，我们筛选得到的两个突变体菌株yCC08和yCC09中BtCrtI突变体包含两个点突变，分别是H136R&Y160F；H453R&N576S。为了确定影响BtCrtI催化功能的突变位点，同时也为了探究不同突变点间的协同作用，我们按照专利(CN201910308068)中的方法构建了四个单点突变体菌株和9个组合突变体菌株，存菌编号和对应的CrtI突变体类型列于表1。
表1
Figure BDA0002557555670000041
Figure BDA0002557555670000051
按照专利(CN201910308068)中的方法进行摇瓶发酵，结果如图1、图2、表2所示：
结论：
1.H136R和H453R分别是影响yCC08和yCC09菌株中BtCrtI突变体脱氢功能变化的关键突变位点；
2.无论是在单点突变还是组合突变验证实验中，Y160F和N576S虽然可以提高催化活性，但是对脱氢步数没有影响。值得一提的是，Y160F和N576S的组合突变体Y160F&N576S能显著提高CrtI的催化效率和番茄红素的产量，可用于酿酒酵母中番茄红素的异源合成。
表2 BtCrtI和易错PCR及突变位点验证实验中获得的BtCrtI突变体菌株中脱氢产物的比例和脱氢效率
Figure BDA0002557555670000061
a番茄红素、链孢红素、ζ-胡萝卜素、六氢番茄红素分别代表各自在总的脱氢产物中的比例。
b脱氢效率代表脱氢产物在总的类胡萝卜素产物中的比例。
实施例2对H136R和H453R的第二轮易错PCR突变筛选
为了获得性能更优的CrtI突变体，我们在第一轮易错PCR确定的H136R和H453R的基础上进行了第二轮易错PCR，筛选出的突变体菌株见表3：
表3
Figure BDA0002557555670000062
Figure BDA0002557555670000071
摇瓶发酵结果如图3所示：
第二轮易错PCR并没由筛选得到性能更好的突变体。但在单点验证试验中发现，突变点T545A,A289V,A355V,N148D,A289V&A355V都能够显著提高CrtI催化活性，同时番茄红素的产量也有了大幅度提升，这为酿酒酵母中高产番茄红素提供了可能。单点验证试验所构建的菌株和发酵结果见表4、图4和表5：
表4
菌株 描述
yCC076 yCC01，PRS416-GAL7-I(A355V)
yCC079 yCC01，PRS416-GAL7-I(A289V)
yCC080 yCC01，PRS416-GAL7-I(N148D)
yCC081 yCC01，PRS416-GAL7-I(A289V&A355V)
yCC082 yCC01，PRS416-GAL7-I(T545A)
表5第二轮易错PCR和突变位点验证实验中获得的BtCrtI突变体菌株中脱氢产物的比例和脱氢效率
Figure BDA0002557555670000072
Figure BDA0002557555670000081
a番茄红素、链孢红素、ζ-胡萝卜素、六氢番茄红素分别代表各自在总的脱氢产物中的比例。
b脱氢效率代表脱氢产物在总的类胡萝卜素产物中的比例。
实施例3探究调控CrtI功能的结构特征
为了探究不同来源八氢番茄红素脱氢酶在H136和H453位点的进化规律。我们将细菌、真菌、蓝细菌、植物来源的八氢番茄红素脱氢酶进行了进化树分析和序列比对。我们发现，在RsCrtI,RcCrtI,andRaCrtI中的八氢番茄红素脱氢酶可催化三步脱氢反应，对应于BtCrtI H136位点的氨基酸是精氨酸；蓝细菌和植物中的八氢番茄红素脱氢酶可催化两步脱氢反应，对应于BtCrtI H453位点的氨基酸也是精氨酸，这与我们的实验结果是一致的，所以我们推测H136和H453这两个位点是八氢番茄红素脱氢酶在自然进化中引起功能分化的关键结构位点。
紧接着我们对这两个突变位点的结构特征进行了分析。如图5所示，BtCrtI在结合辅因子FAD前后构象发生了很大的变化。同时，我们发现H136和H453的位置在两种状态(Open和Close)下也有较大的偏移，而且这两个位点距离催化活性中心点的距离都大于
Figure BDA0002557555670000083
具体来讲，H136在两种状态下位移了
Figure BDA0002557555670000084
但其位于刚性结构α-螺旋上，所以对催化特异性没有较大的影响；而H453在两种状态下位移了
Figure BDA0002557555670000085
变动幅度更大，同时位于蛋白的柔性结构上，因此对催化特异性影响较大，H453R突变体为两步脱氢酶。
实施例4 BtCrtI中H136位点和H453位点的单点饱和突变
为了探讨BtCrtI催化功能的多样性，我们对两个关键结构位点H136和H453进行了饱和突变，所构建的酵母菌株和突变体类型见表6：
表6
Figure BDA0002557555670000082
Figure BDA0002557555670000091
经摇瓶发酵后结果如图6、表7所示：
H453位点的突变对催化功能影响较大，很多突变体如H453P，H453C，H453S等催化活力都降低了。我们发现H136P突变体中番茄红素和链孢红素的比例降为了1:1，H453K是另外一个接近两步脱氢的脱氢酶。H136C和H136S突变体能显著提高催化活性和番茄红素的合成；H453A，H453G，H453F，H453E催化活性提升或保持不变，但四步脱氢产物番茄红素比例下降。
表7 BtCrtI在H136和H453位点饱和突变体菌株中脱氢产物的比例和脱氢效率
Figure BDA0002557555670000092
Figure BDA0002557555670000101
a番茄红素、链孢红素、ζ-胡萝卜素、六氢番茄红素分别代表各自在总的脱氢产物中的比例。
b脱氢效率代表脱氢产物在总的类胡萝卜素产物中的比例。
实施例5 BtCrtI中H136位点和H453位点的单点饱和突变结果聚类分析
我们将BtCrtI中H136位点和H453位点的单点饱和突变结果中的五个要素进行主成分分析(PCA)可k均值聚类分析：番茄红素的比例，链孢红素的比例，zeta-胡萝卜素的比例，六氢番茄红素的比例，脱氢产物在整个类胡萝卜素产物中的比例。结果如图7所示：
如图7所示，所有的突变体大致可分为三类，分别用三个不同颜色的椭圆表示。从突变体的分布来看，脱氢效率与脱氢步数存在正相关关系，即脱氢效率越高，越倾向于合成四步脱氢产物番茄红素；而倾向于两步脱氢的突变体脱氢效率均很低。同时，我们发现H136突变体对四步脱氢产物番茄红素和三步脱氢产物链孢红素的比例影响较大；而H453突变体更可能影响脱氢步数。
实施例6:BtCrtI中H136位点和H453位点组合突变
挑选实施例5中代表性的突变体H136C,H136S,H136P,H453G,H453F,H453E,H453K进行组合，所得突变体菌株和相应的突变体类型见表8：
表8
菌株编号 描述
yCC37 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136C&H453G)-CYC1t
yCC38 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136C&H453F)-CYC1t
yCC39 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136C&H453E)-CYC1t
yCC40 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136S&H453G)-CYC1t
yCC41 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136S&H453F)-CYC1t
yCC42 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136S&H453E)-CYC1t
yCC43 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136P&H453G)-CYC1t
yCC44 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136P&H453F)-CYC1t
yCC45 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136P&H453E)-CYC1t
yCC46 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136C&H453R)-CYC1t
yCC47 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136S&H453R)-CYC1t
yCC48 yCC01,pRS416-GAL7p-BtCrtI(H136P&H453R)-CYC1t
经摇瓶发酵，所得结果如图8、表9所示：
表9 BtCrtI在H136和H453位点组合突变体菌株中脱氢产物的比例和脱氢效率
Figure BDA0002557555670000111
Figure BDA0002557555670000121
a番茄红素、链孢红素、ζ-胡萝卜素、六氢番茄红素分别代表各自在总的脱氢产物中的比例。
b脱氢效率代表脱氢产物在总的类胡萝卜素产物中的比例。
结论：
1.所有和H453R组合的突变体全部失活；
2.组合后的突变体催化效率的强弱顺序与单点突变相同，如组合突变体的催化效率排序为H136C&H453G>H136C&H453F>H136C&H453E；而在单点突变中的催化效率排序为H453G>H453F>H453E；在其他组合突变体中情况类似；
3.在组合突变体中一步和两步脱氢产物比例较单点突变高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.八氢番茄红素脱氢酶突变体，其第160、576、545、289、355、148、136、453位氨基酸中任意一个或几个被取代。
2.如权利要求1所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体，其特征在于，所述取代包括Y160F&N576S、T545A、A289V、A355V、N148D、A289V/A355V、H136P、H136C、H136S、H453K、H453C、H453Q、H453Y、H453A、H453G、H453F、H453E中的任意一个或多个的组合。
3.如权利要求2所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体，其特征在于，所述八氢番茄红素脱氢酶突变体包括Y160F&N576S、A289V&A355V、H136C&H453G、H136C&H453F或H136C&H453E中的一个或多个的组合。
4.编码如权利要求1至3任一项所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体的DNA分子。
5.一种重组表达载体，其特征在于，携带有如权利要求4所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的重组表达载体。
7.如权利要求1至3任一项所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体、如权利要求4所述的DNA分子、如权利要求5所述的重组表达载体、如权利要求6所述的宿主细胞在提高八氢番茄红素脱氢酶的催化效率、合成脱氢产物和/或合成六氢番茄红素，zeta-胡萝卜素，链孢红素，四氢-β-胡萝卜素，二氢-β-胡萝卜素，zeta-carotene-2-one和/或neurosporene-2-one中的应用。
8.合成脱氢产物的方法，其特征在于，以如权利要求1至3任一项所述的八氢番茄红素脱氢酶突变体催化反应或以如权利要求6所述的宿主细胞为发酵菌株发酵。
9.合成六氢番茄红素，zeta-胡萝卜素，链孢红素，四氢-β-胡萝卜素，二氢-β-胡萝卜素，zeta-carotene-2-one和/或neurosporene-2-one的方法，其特征在于，以如权利要求5所述的宿主细胞为发酵菌株发酵。
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